吳彪，柯智，陳喜蓉，鐘劍鋒，林芳能，陽記萍

海南省林業(yè)科學(xué)研究院(海南省紅樹林研究院)，海南?？?71100

檸檬(Citrus limon(L.)Burm.f.)，為雙子葉植物綱蕓香科柑橘屬植物，又稱洋檸檬、檸果、益母果等。臺(tái)灣無籽青檸檬是青檸檬和四季檸檬的雜交品種[1]，可用枝條扦插繁殖，因其既耐熱又抗寒的特性，一年四季均可開花結(jié)果。其果無核多汁，富含維生素，果實(shí)成熟后果皮黃綠色或淡黃色[2]。

有研究表明菌肥可以改善土壤環(huán)境，影響土壤微生物數(shù)量和土壤酶活力，培肥地力，提高肥料利用率，促進(jìn)植物生長，增強(qiáng)抗性，減少病蟲害發(fā)生[3-4]。

微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，參與土壤有機(jī)質(zhì)的分解、碳氮循環(huán)以及成土過程，影響植物對(duì)礦質(zhì)營養(yǎng)的吸收釋放。土壤微生物會(huì)間接影響土壤肥力與植物營養(yǎng)。微生物分泌的土壤酶在土壤生態(tài)系統(tǒng)中起著關(guān)鍵作用，另外土壤酶還來源于植物根系及其殘?bào)w、土壤動(dòng)物及其遺骸，能催化土壤中復(fù)雜的有機(jī)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為簡單的無機(jī)化合物，供植物再利用[5]。土壤酶活性作為反映土壤中各種生物化學(xué)過程的方向和強(qiáng)度的指標(biāo)[6]，參與了有機(jī)質(zhì)分解、養(yǎng)分循環(huán)等重要機(jī)制。其中土壤過氧化氫酶、蔗糖酶、脲酶活性對(duì)評(píng)價(jià)土壤肥力水平起著重要作用[7]。

該研究以在無籽青檸檬種植地施不同肥料為研究對(duì)象，利用微生物純培養(yǎng)技術(shù)和Biolog-ECO 技術(shù)分析施肥后土壤可培養(yǎng)微生物及其群落功能多樣性以及土壤酶活性[8-9]，以期為無籽青檸檬的施肥管理提供理論基礎(chǔ)，推動(dòng)無籽青檸檬高產(chǎn)、綠色環(huán)保的種植方式的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 供試材料

臺(tái)灣無籽青檸檬種苗為市售，種苗主桿統(tǒng)一定桿株高為25cm，地徑0.8cm～1.2cm。

菌肥是以廢棄菌糠和雞糞為基質(zhì)，按1：1 充分混勻，添加1%的腐熟菌劑初發(fā)酵21d 后，添加0.5%的功能菌劑進(jìn)行發(fā)酵制成。菌糠主要填充物為橡膠木屑和麩皮。

1.2 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)于2017 年～2018 年分別在定安龍州、瓊山三門坡和儋州木棠基地進(jìn)行，檸檬園為緩坡地。3個(gè)樣地基本概況如表1 所示。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 無籽青檸檬種植地施肥量設(shè)置

每個(gè)試驗(yàn)地劃分為2 個(gè)相等的小區(qū)，每個(gè)小區(qū)30m2～50m2，分別進(jìn)行施肥組和未施肥組的對(duì)比試驗(yàn)，菌肥與普通肥的對(duì)比，定安龍州基地與瓊山三門坡基地、儋州木棠新北岸基地對(duì)比，每個(gè)處理重復(fù)3個(gè)。菌肥組按不同施肥量2kg/m2、4kg/m2、6kg/m2，普通肥按田間常規(guī)施肥量2kg/m2，分別在2018 年4月、6 月、8 月重復(fù)3 次施肥，另外設(shè)計(jì)不施肥作為對(duì)照處理。

1.3.2 土壤樣品的采集

每個(gè)小區(qū)采用“S”形取樣法采取5 點(diǎn)土樣，土樣深度5cm～10cm。裝入貼好對(duì)應(yīng)標(biāo)簽的無菌袋，帶回實(shí)驗(yàn)室保存于4℃冰箱待用，于當(dāng)天分析土樣[1]。

1.3.3 土壤可培養(yǎng)微生物的測定

參考林先貴分離純化培養(yǎng)土壤微生物的方法，采用常規(guī)涂布平板分離計(jì)數(shù)法測定土壤中可培養(yǎng)微生物[8]。

1.3.4 Biolog- ECO 測定

（1）Biolog-ECO 樣品的處理及測定

參考章家恩等方法[9]，稱取5g 鮮土加入裝有100mL 的0.85%NaCl 滅菌生理鹽水的三角瓶中，120r/min 振蕩培養(yǎng)30min，冰浴中靜置2min；取5mL上清液加入到裝有45mL 無菌水的三角瓶中搖勻稀釋，重復(fù)稀釋2 次，制得1：100 的懸濁液用于ELSIA反應(yīng)；吸取150μL 懸濁液滴入已預(yù)熱的Biolog ECO 平板孔中，28℃恒溫避光培養(yǎng)9d；每隔24h 用Biolog 讀數(shù)器讀取590nm 和750nm 的吸光值[10]。（2）土壤微生物群落功能多樣性指數(shù)

平均吸光值(AWCD)是反映微生物群落活性的有效指標(biāo)，其變化率和最終值可以反映土壤微生物群落利用碳源進(jìn)行代謝的總能力[11]。計(jì)算公式為：AWCD=∑(Ci-R)/n，式中Ci為每個(gè)孔的吸光值，R 為對(duì)照孔的吸光值，n 為培養(yǎng)基碳源總數(shù)，此實(shí)驗(yàn)中n為31。

Shannon 指數(shù)(H’)可以表征群落中物種的豐富度，計(jì)算公式：H’=-∑Pi·ln(Pi)，Simpson 指數(shù)（D）表征最常見種的優(yōu)勢度，表現(xiàn)微生物對(duì)碳源利用多樣性方面，更側(cè)重對(duì)差異性的描述[13]，計(jì)算公式為：D=1-∑(Pi)2。上述兩個(gè)式中：Pi為第i 個(gè)有培養(yǎng)基的孔和對(duì)照孔的光度值差與所有板總差的比值[12]。

McIntosh 指數(shù)（U）公式如下，式中：ni為第i 孔的相對(duì)吸光值[10]。

Pielou 指數(shù)（E）是通過Shananon-Wiener 指數(shù)計(jì)算出來的精度，指的是微生物群落實(shí)測多樣性和最大多樣性的比率，表征土壤微生物群落的均一性。計(jì)算公式如下：E=H’/lnS 式中：S 為被利用碳源總數(shù)[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤肥效

從表2 中可以看出，定安龍州、瓊山三門坡和儋州木棠基地種植的無籽青檸檬各施肥組的土壤pH、堿解氮、速效鉀和速效磷含量均大于對(duì)照組，其中4kg/m2菌肥組土壤中的堿解氮、速效鉀和速效磷含量最大， 定安龍州分別達(dá) 134.18mg/kg、146.57mg/kg、200.84mg/kg；瓊山三門坡分別達(dá)160.43mg/kg、175.28mg/kg、205.67mg/kg；儋州木棠124.67mg/kg、140.68mg/kg、191.05mg/kg。另外，菌肥組土壤中的堿解氮、速效鉀和速效磷含量整體隨著菌肥量的增加呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。定安龍州、瓊山三門坡和儋州木棠4kg/m2菌肥組土壤的堿解氮、速效鉀和速效磷比對(duì)照組分別提高32.6%、30.2%、14.8%；33.3%、16%、10.2%；33.4%、29.5%和22.2%。這一結(jié)果也充分說明施用菌肥有效提高了無籽青檸種植土壤的肥效，有利于無籽青檸檬的生長，同樣有利于提高無籽青檸檬果的品質(zhì)。

表2 不同施肥模式下土壤肥效Tab.2 Effects of different fertilization patterns on soil fertility

2.2 土壤可培養(yǎng)微生物

2.2.1 土壤微生物種類與總數(shù)

從表3 中可以看出，不同施肥模式下定安龍州基地種植的無籽青檸檬土壤中可培養(yǎng)微生物總數(shù)為4kg/m2菌肥組＞2kg/m2菌肥組＞2kg/m2普肥組＞6kg/m2菌肥組＞空白對(duì)照組，4kg/m2菌肥組土壤中可培養(yǎng)的細(xì)菌總數(shù)、放線菌總數(shù)和真菌總數(shù)均大于其他施肥組。該基地種植的無籽青檸檬施用菌肥后土壤中的可培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)、放線菌總數(shù)和真菌總數(shù)均隨著施肥量的增加呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢；不同施肥模式下瓊山三門坡基地種植的無籽青檸檬土壤中可培養(yǎng)微生物總數(shù)為6kg/m2菌肥組＞4kg/m2菌肥組＞2kg/m2普肥組＞2kg/m2菌肥組＞空白對(duì)照組，6kg/m2菌肥組土壤中的可培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)、放線菌總數(shù)大于其他施肥組，而4kg/m2菌肥組土壤中的真菌總數(shù)大于其他施肥組。該基地種植的無籽青檸檬施用菌肥后土壤中的可培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)隨施肥量的增加而增加，真菌隨施肥量的增加呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，放線菌總數(shù)與施肥量的多少呈現(xiàn)不規(guī)則的變化；不同施肥模式下儋州木棠基地種植的無籽青檸檬土壤中可培養(yǎng)微生物總數(shù)為4kg/m2菌肥組＞6kg/m2菌肥組＞2kg/m2普肥組＞空白對(duì)照組＞2kg/m2菌肥組，4kg/m2菌肥組土壤中可培養(yǎng)的細(xì)菌總數(shù)、真菌總數(shù)均大于其他施肥組。該基地種植的無籽青檸檬施用菌肥后土壤中的可培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)、真菌總數(shù)隨著施肥量的增加呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，放線菌總數(shù)與施肥量的多少呈現(xiàn)不規(guī)則的變化。

表3 不同施肥模式下土壤中可培養(yǎng)微生物Tab.3 Culturable microorganisms in soil under different fertilization patterns

由表3 可見，就施肥量來看，定安龍州基地、瓊山三門坡基地和儋州木棠基地?zé)o籽青檸檬地分別施用4kg/m2、6kg/m2、4kg/m2菌肥的土壤中的細(xì)菌和真菌總數(shù)最多，最有利于土壤有機(jī)和無機(jī)質(zhì)的轉(zhuǎn)化，能更好的參與土壤有機(jī)質(zhì)分解與腐殖酸合成，直接影響土壤肥力，同時(shí)有利于氨化作用。另外，定安龍州基地、瓊山三門坡基地和儋州木棠基地?zé)o籽青檸檬地分別施用4kg/m2、6kg/m2、6kg/m2菌肥的土壤中的放線菌最多，有利于提高土壤形成抗生物質(zhì)的能力，對(duì)無籽青檸檬的病蟲害防治具有重要的意義。

2.2.2 土壤微生物平均吸光值（AWCD）變化特征

從圖1 看出，每隔24h，連續(xù)9d 測得的吸光值平均變化率隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而提高，不同施肥組土壤微生物均在開始的24h 沒有明顯變化，即24h以內(nèi)土壤微生物活性較低；而在48h～168h 內(nèi)快速升高，隨后持續(xù)緩慢地升高至試驗(yàn)結(jié)束。平均吸光值(AWCD) 總體變化趨勢6kg/m2菌肥組＞4kg/m2菌肥組＞2kg/m2菌肥組＞2kg/m2普肥組＞空白對(duì)照組。

圖1 不同施肥模式下土壤微生物平均吸光值Fig.1 Average absorbance of Soil Microorganism under different fertilization modes

2.2.3 土壤微生物利用不同碳源的變化特征

從圖2 可以看出，隨著時(shí)間的推移，不同施肥組土壤微生物對(duì)6 類碳源的利用越來越高。從整體趨勢來看，不同施肥組的土壤微生物對(duì)碳水化合物碳源、氨基酸類碳源、多聚物、羧酸碳源利用均為4kg/m2菌肥組＞6kg/m2菌肥組＞2kg/m2菌肥組＞2kg/m2普肥組＞對(duì)照組。對(duì)酚酸類碳源的利用為6kg/m2菌肥組＞2kg/m2菌肥組＞空白對(duì)照組＞4kg/m2菌肥組＞2kg/m2普肥組；對(duì)胺類碳源的利用利用為6kg/m2菌肥組＞2kg/m2菌肥組＞4kg/m2菌肥組＞2kg/m2普肥組＞空白對(duì)照組。不同施肥組土壤微生物對(duì)6 大類碳源利用情況的的不同，說明不同施肥組土壤中的微生物群落結(jié)構(gòu)、種類和數(shù)量均存在差異，導(dǎo)致不同樣地的土壤微生物多樣性不同。

圖2 不同施肥模式下土壤微生物利用碳源情況Fig.2 Carbon source utilization by soil microorganisms under different fertilization patterns

2.2.4 土壤微生物群落功能多樣性指數(shù)

從圖3 可以看出，不同處理土壤微生物在培養(yǎng)168h 的McIntosh 指數(shù)(U 值)總體趨勢均為4kg/m2菌肥組＞6kg/m2菌肥組＞2kg/m2菌肥組＞空白對(duì)照組＞2kg/m2普肥組，各施肥組的U 值差異顯著，其中4kg/m2施肥組和6kg/m2施肥組與其他施肥差異極顯著。不同施肥組土壤微生物在培養(yǎng)168h 的H’值、D 值和E 值差異不顯著。

圖3 不同施肥模式下土壤微生物多樣性指數(shù)Fig.3 Soil microbial diversity index under different fertilization patterns

2.3 土壤酶活性

從表4 中可以看出，定安龍州施用6kg/m2菌肥組土壤中的蔗糖酶、多酚氧化酶和過氧化氫酶含量均大于其他施肥組，施用2kg/m2菌肥組土壤中的脲酶均大于其他施肥組。從不同施肥方式下的土壤中蔗糖酶含量指標(biāo)來看，6kg/m2菌肥組＞2kg/m2普肥組＞2kg/m2菌肥組＞4kg/m2菌肥組＞空白對(duì)照組；脲酶含量指標(biāo)2kg/m2菌肥組＞6kg/m2菌肥＞空白對(duì)照組＞4kg/m2菌肥組＞2kg/m2普肥組；多酚氧化酶含量指標(biāo)6kg/m2菌肥組＞2kg/m2菌肥組＞2kg/m2普肥組＞4kg/m2菌肥組＞空白對(duì)照組；過氧化氫酶含量指標(biāo)6kg/m2菌肥組＞2kg/m2普肥組＞2kg/m2菌肥組＞空白對(duì)照組＞4kg/m2菌肥組。由此可見，土壤中與土壤肥力關(guān)系密切的過氧化氫酶、過氧化物酶、多酚氧化酶、蔗糖酶與施肥量間的規(guī)律不明顯。

由于瓊山三門坡基地和儋州木棠基地施肥晚于定安龍州基地，土壤酶活性指標(biāo)分析時(shí)，僅采集了施用4kg/m2菌肥組的土壤進(jìn)行比較分析。結(jié)果表明瓊山三門坡施用4kg/m2菌肥土壤中的酶含量脲酶＞蔗糖酶＞過氧化氫酶＞多酚氧化酶，儋州木棠基地施用4kg/m2菌肥土壤中的酶含量脲酶＞多酚氧化酶＞過氧化氫酶＞蔗糖酶。無籽青檸檬盆栽樣品的處理盆栽土施用4kg/m2菌肥土壤中的酶含量脲酶＞蔗糖酶＞多酚氧化酶＞過氧化氫酶。

表4 不同施肥模式下土壤酶活性Tab.4 Soil enzyme activities under different fertilization patterns

3 結(jié)論與討論

3.1 施用菌肥對(duì)土壤可培養(yǎng)微生物和肥效的影響

從目前定安龍州、瓊山三門坡和儋州木棠基地試種無籽青檸檬不同施肥方式下的土壤中可培養(yǎng)微生物（細(xì)菌、真菌、放線菌）的分析結(jié)果來看，無籽青檸檬施用4kg/m2～6kg/m2菌肥有利于土壤中微生物的生長和代謝，有利于改善土壤結(jié)構(gòu)，能更好的參與土壤有機(jī)質(zhì)分解與腐殖酸合成，促進(jìn)土壤腐殖質(zhì)的生成，直接影響土壤肥效，增加植物抗性、促進(jìn)植物對(duì)養(yǎng)分的吸收、減少病原危害，對(duì)無籽青檸檬的生長和病蟲害的防治，以及無籽青檸檬果的品質(zhì)具有重要的作用。

3.2 施用菌肥對(duì)土壤微生物多樣性指數(shù)的影響

從目前定安龍州、瓊山三門坡和儋州木棠基地試種無籽青檸檬不同施肥方式下的土壤中多樣性指數(shù)的分析結(jié)果來看，4kg/m2施肥組的McIntosh 指數(shù)(U 值) 顯著高于其他施肥組，各施肥組的Shananon-Wiener 指數(shù)(H’值)、Simpson 指數(shù)(D 值)和Pielou 均勻度指數(shù)(E 值)差異不顯著。說明施用菌肥可以調(diào)節(jié)土壤微生物多樣性的指數(shù)，但對(duì)各指數(shù)的調(diào)節(jié)效應(yīng)不同。從研究的土壤中微生物多樣性指數(shù)來看，無籽青檸檬施用4kg/m2菌肥對(duì)土壤中微生物的McIntosh 指數(shù)(U 值)調(diào)節(jié)最佳，有利于無籽青檸檬的生長。

3.3 施用菌肥對(duì)土壤酶活性的影響

從目前定安龍州、瓊山三門坡和儋州木棠基地試種無籽青檸檬不同施肥方式下的土壤中酶活性（蔗糖酶、脲酶、多酚氧化酶、過氧化氫酶）的分析結(jié)果來看，施用6kg/m2菌肥試驗(yàn)組的土壤中的4 種酶活性整體優(yōu)于其他試驗(yàn)組。這說明無籽青檸檬施用6kg/m2菌肥有利于提高土壤中幾種關(guān)鍵酶的活性，對(duì)無籽青檸檬的生長具有重要的作用。