崔亨貞，孫蜜燭，王潤芝，李辰雨，黃予暄，黃秋菊，喬曉孟

研究報告

內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)DNA甲基化調(diào)控大鼠酒精相關行為

崔亨貞1，孫蜜燭2，王潤芝2，李辰雨3，黃予暄3，黃秋菊3，喬曉孟2

1. 鄭州大學醫(yī)學院基礎醫(yī)學專業(yè)，鄭州 450001 2. 鄭州大學醫(yī)學院法醫(yī)學系，鄭州 450001 3. 鄭州大學醫(yī)學院醫(yī)學檢驗系，鄭州 450001

酒精濫用不僅導致組織器官損傷，還易誘發(fā)神經(jīng)精神疾病。研究表明，DNA甲基化在酒精誘導基因表達和行為改變中發(fā)揮重要作用，但具體的神經(jīng)生物學機制尚未被闡明。為了探索DNA甲基化在酒精濫用中的作用機制，本研究選取健康成年雄性 SD大鼠() 32只，隨機分為飲水對照組(=16)和慢性酒精暴露組(=16)，運用雙瓶選擇實驗(two bottle choice test, TBCT)評估大鼠酒精偏愛率(alcohol preference)，通過曠場行為(open field test, OFT)評估活動狀態(tài)并檢測血酒精濃度。分離兩組大鼠內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)(medial prefrontal cortex, mPFC)，提取總DNA，利用簡化代表性重亞硫酸鹽測序技術(reduced representation bisulfite sequencing, RRBS)構建mPFC甲基化譜，對差異基因進行功能富集和通路分析，篩選與酒精濫用密切相關的甲基化差異基因，運用qRT-PCR技術檢測差異基因的表達，驗證DNA甲基化對基因的表達調(diào)控；利用qRT-PCR和Western blot檢測甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases, DNMTs)和甲基化CpG 位點結(jié)合蛋白2 (methyl CpG binding protein 2, MeCP2)的表達；同時，還檢測了短期酒精暴露(7 d)對大鼠mPFC內(nèi)DNMTs和MeCP2的影響(=8/組)。結(jié)果表明，慢性酒精暴露大鼠mPFC內(nèi)基因啟動子區(qū)甲基化水平顯著升高。與酒精濫用密切相關的差異基因中，慢性酒精暴露組和啟動子區(qū)甲基化水平升高，mRNA表達降低；和啟動子區(qū)甲基化水平降低，mRNA表達升高。慢性酒精暴露使DNMT3B和MeCP2 mRNA和蛋白表達升高，而短期內(nèi)酒精暴露不影響它們的表達。本研究初步證實DNA甲基化與酒精濫用的發(fā)展相關，可能受DNMT3B和MeCP2分子的調(diào)控，并發(fā)現(xiàn)了與酒精濫用相關的靶基因、、和，為研究酒精濫用的神經(jīng)生物學機制提供了新見解，同時為酒精濫用治療提供了可能的藥理學靶點。

酒精濫用；DNA甲基化；DNA甲基轉(zhuǎn)移酶；內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)

酒精是世界公認的成癮性精神活性物質(zhì)，長期過量飲酒會引起多種危害。在發(fā)達國家，酒精引起的疾病負擔(約10%)僅次于煙草和高血壓，而在一些發(fā)展中國家，酒精甚至是致病致殘的首要危險因素?！?017年全球酒精、煙草和非法藥物使用狀況報告》指出，2015年在成年人群中，重度飲酒的患病率為18.4%，其中每10萬人中就有843.2人患有酒精依賴[1]。全世界因酒精濫用造成的死亡達330萬例(占所有死亡人數(shù)的5.9%)，并產(chǎn)生5.1%的疾病負擔，造成2500億的經(jīng)濟損失[2]。中國的酒文化源遠流長，帶來的各種問題也顯而易見。2015年我國重度飲酒的患病率在20%~25%[1]，青少年酗酒率呈逐年上升趨勢[3]。酒精濫用對個人的身心健康有著極大威脅。攝入過量酒精可以誘發(fā)肝硬化，增加肝癌的發(fā)生率，并造成胃腸道功能紊亂及心血管疾??；長期飲酒可誘發(fā)神經(jīng)精神疾病，包括胎兒酒精譜系障礙和依賴，導致焦慮、抑郁甚至認知功能障礙[4]。因此，對酒精濫用的病因機制進行研究具有十分重要的生物醫(yī)學及社會學意義。

酒精反復攝入會引起相關基因的表達變化[5,6]，即使停止飲酒后這種改變?nèi)钥沙掷m(xù)，并且可以遺傳。這種基因表達改變的內(nèi)在機制可能由表觀遺傳介導[7]。近年來，越來越多的研究聚焦酒精濫用相關基因表達改變的表觀遺傳機制，酒精可能使基因的甲基化或組蛋白乙?；l(fā)生改變，從而增強或抑制轉(zhuǎn)錄，引起基因表達持久性改變。Zhu等[8]通過對1465個健康受試者外周血全基因組甲基化進行分析，發(fā)現(xiàn)飲酒量與基因組整體甲基化水平呈負相關。Mg2+/Mn2+依賴的蛋白質(zhì)磷酸酶1G (protein phos-phatase-Mg2+/Mn2+- dependent-1G, Ppm1G)被發(fā)現(xiàn)與酒精使用障礙相關，在酒精使用障礙患者的外周血基因組中，啟動子區(qū)甲基化水平升高，mRNA表達降低，而且其與499名酗酒青少年的沖動性行為增加顯著相關[9]。在對嚙齒類動物的研究中發(fā)現(xiàn)，慢性酒精暴露改變了小鼠(s)不同腦區(qū)5-羥色胺受體3a (serotonin receptor 3a,)啟動子區(qū)的甲基化，Hip中啟動子區(qū)甲基化水平升高，而背內(nèi)側(cè)紋狀體(dorsomedial striatum, DMSTR)和dmPFC內(nèi)啟動子區(qū)甲基化水平降低[10]。有研究表明，低甲基化藥物(如甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑)能減少慢性酒精暴露大鼠的飲酒量[11,12]。由此可見，DNA選擇性地響應環(huán)境因素，進而改變轉(zhuǎn)錄機制，參與細胞生長發(fā)育、周期調(diào)節(jié)、信號轉(zhuǎn)導等多種生命過程，導致大腦中生理和病理過程的改變。

本研究通過建立大鼠慢性酒精暴露模型，提取內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)(medial prefrontal cortex, mPFC) DNA，運用簡化代表性重亞硫酸鹽測序(reduced representation bisulfite sequencing，RRBS)技術檢測mPFC全基因組甲基化水平，篩選出與酒精濫用相關的甲基化差異基因；進而對差異基因進行GO功能富集和KEGG通路分析；運用實時熒光定量PCR技術 (qRT-PCR) 對甲基化差異基因進行擴大樣本量驗證；運用Western blot技術對調(diào)控DNA甲基化的關鍵酶及分子進行蛋白表達檢測，探索DNA甲基化在酒精濫用發(fā)展過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康成年雄性 SD大鼠48只，6~8周齡，體重180~220 g。實驗動物均由鄭州大學實驗動物中心提供，在無特定病原體(specific pathogen free, SPF)的動物標準環(huán)境飼養(yǎng)。飼養(yǎng)室環(huán)境安靜，溫度區(qū)間為21~25℃，濕度區(qū)間為40%~60%，保持12 h明暗周期(7:00 AM燈亮，7:00 PM燈暗)，實驗均在明周期進行。該項目經(jīng)鄭州大學實驗動物管理與使用委員會批準，并嚴格遵守中華人民共和國科技部《關于善待實驗動物的指導意見》。所有大鼠均未經(jīng)過任何行為學訓練，單只單籠飼養(yǎng)，自由攝食飲水，并于實驗前一周時間提前適應新環(huán)境。

1.2 慢性酒精暴露

所有動物被隨機分為兩組：慢性酒精暴露組(=16)和飲水對照組(=16)，其中每組各12只用于行為學檢測及分子生物學實驗，剩余4只用于RRBS測序。慢性酒精暴露模型建立之前，酒精暴露組大鼠首先接受連續(xù)5 d的雙瓶選擇實驗(two bottle ch-oice test, TBCT)，以判斷大鼠的基礎酒精偏愛率(alcohol preference)。同一飼養(yǎng)籠左右兩邊各一瓶6% (V/V)的酒精水溶液和自來水，供大鼠自由選擇。為防止大鼠對位置的偏愛，需每天交換酒瓶和水瓶的位置。每天17:00 PM定時稱量酒瓶和水瓶的重量，計算酒精溶液和水溶液的消耗體積，酒精偏愛率=酒精溶液消耗體積/液體總攝入體積×100%。雙瓶選擇實驗結(jié)束后，開始建立慢性酒精暴露模型。實驗組大鼠自由飲用6%的酒精水溶液，對照組大鼠自由飲水，每日7:00 AM更換新的酒和水，連續(xù)35 d。35 d內(nèi)每日5:00 PM稱量大鼠體重并記錄飲酒量，第7、14、21、28、35 d分別進行曠場行為(open field test, OFT)和血酒精濃度檢測。第36 d起重新進行一次雙瓶選擇實驗，以判定模型是否建立成功。隨后以頸椎脫臼法處死大鼠，分離mPFC核團，保存于?80℃冰箱中備用。對于短期酒精暴露模型(=8/組)，大鼠自由飲用6%的酒精水溶液連續(xù)7 d，第7 d早上處死大鼠，分離mPFC核團，一半核團提取mRNA，一半提取蛋白質(zhì)用于后續(xù)分析。

1.3 曠場行為

黑色正方形敞口實驗箱(100 cm×100 cm×45 cm)，中心區(qū)域占箱底總面積的60%，上方2 m處懸掛30 W照明燈。在酒精暴露的第7、14、21、28、35 d早上7:30，將所有大鼠逐只轉(zhuǎn)運至行為學實驗室適應30 min，隨后將大鼠放至箱子角落進行15 min的自由探索，由攝像裝置記錄并分析15 min內(nèi)的數(shù)據(jù)，包括：(1)總活動距離(total distance)：大鼠在實驗箱的總活動路程，反應大鼠的水平動機；(2)中心區(qū)域停留時間比(pencentage of time in the center)：反應大鼠的探索行為和焦慮樣情緒。

1.4 血酒精濃度(blood alcohol level, BALs)檢測

曠場實驗結(jié)束后，立即對酒精暴露組大鼠進行鼠尾靜脈采血，每只抽取尾靜脈血約0.2 mL。隨后采用頂空–氣相色譜法測定BALs。實驗前平衡溫度20 min，從冰箱內(nèi)取出血樣100 μL于5 mL頂空氣瓶中，加入0.1 g/L叔丁醇內(nèi)標溶液500 μL，用鉗口器將空瓶用硅膠墊密封后放入自動頂空恒溫爐中，吹洗2 min，進行預熱，聽到響聲后代表預熱完成，開始進樣，進樣口溫度為150℃，再聽到一次響聲時點擊“START”按鈕，開始測定，并進行樣品記錄。

1.5 簡化代表性重亞硫酸鹽測序

兩組大鼠分別選取3只，提取mPFC基因組DNA。限制性內(nèi)切酶Ⅰ將DNA切割為40~220 bp大小的片段，在DNA分子兩端引入接頭序列及索引序列，割膠后回收。按照標準流程使用QIAquick Gel Extraction kit進行純化，洗脫，將DNA保存在?20℃冰箱備用。按照標準流程使用EpiTect Bisulfite Kit對純化產(chǎn)物進行重亞硫酸氫鹽處理，洗脫DNA。通過PCR擴增完成文庫構建。PCR擴增引物為：

F: 5′-AATGATACGGCGACCACCGA-3′；

R: 5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3′。

PCR擴增條件：95℃ 5 min，98℃ 30 s；98℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，15個循環(huán)；最后再72℃ 5 min；4℃保存。

將構建好的文庫等摩爾濃度混合，對文庫進行定量后，利用Illumina Nextseq 500 Desktop Seque-ncer上機測序。得到原始測序數(shù)據(jù)后，對其進行質(zhì)量控制以獲得高質(zhì)量數(shù)據(jù)進行后續(xù)分析。將測序序列比對到基因組，得到不同基因組環(huán)境的甲基化情況，并基于二項分布檢驗和1% FDR約束對甲基化位點進行篩選。統(tǒng)計甲基化程度的分布情況，比較樣本之間甲基化程度的一致性。最后，運用GOseq對差異甲基化區(qū)域最近鄰基因進行功能注釋，用KEGG pathway對甲基化差異基因進行通路分析。

1.6 實時熒光定量PCR

采用MiniBEST Universal RNA Extraction 試劑盒(日本TaKaRa公司)提取兩組大鼠(=12/組)一側(cè)mPFC的RNA，并測定RNA濃度。隨后以RNA為模板合成互補的cDNA。以cDNA產(chǎn)物為模板，進行熒光實時定量PCR反應。目的基因的引物序列見表1。

1.7 Western blot檢測

提取兩組大鼠一側(cè)mPFC的蛋白質(zhì)，用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)法進行蛋白定量。為避免電泳時由于蛋白濃度的差異造成的條帶深淺不一，根據(jù)測得的蛋白濃度(均高于3 μg/μL)，將所有樣本的總蛋白濃度均調(diào)整為3 μg/μL，用RIPA裂解液和5×的蛋白上樣緩沖液稀釋所提取的蛋白。隨后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、轉(zhuǎn)膜并孵育抗體。一抗分別為抗DNMT1兔多克隆抗體(美國Epigentek公司)、抗DNMT3A兔多克隆抗體(美國Epigentek公司)、抗DNMT3B兔多克隆抗體(美國Epigentek公司)、抗MeCP2小鼠單克隆抗體(英國Abcam Technology公司)。二抗抗體孵育完成并洗膜后進行化學發(fā)光檢測。采用美國Bio-rad公司的Image Lab軟件進行分析，采集灰度值，計算目的蛋白條帶的平均光密度，進行相對定量分析。用目的蛋白與內(nèi)參蛋白(β-actin)條帶的光密度比值來表示檢測蛋白的相對表達水平。

1.8 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計學分析

采用SPSS 20.0和Graphpad Prism 6.0軟件進行統(tǒng)計學分析，以均值 ± 標準誤(mean ± S.E.M.)表示實驗數(shù)據(jù)。對于模型建立期間兩組大鼠的體重變化和每周一次的曠場行為測試結(jié)果，以時間為組內(nèi)因素，飲酒或飲水為組間因素進行重復測量的雙因素方差分析(Two-way ANOVA with repeated measure-ments, RM two-way ANOVA)；兩個因素有交互作用時，進行Sidak’s post hoc多組之間的兩兩比較。對于35 d內(nèi)慢性酒精暴露組大鼠的酒精攝入量(g/kg/d)、血酒精濃度和酒精偏愛率，進行重復測量的單因素方差分析(One-way ANOVA with repeated measure-ments, RM one-way ANOVA)；并進行Sidak’s post hoc不同時間點的兩兩比較。對于兩組大鼠mPFC內(nèi)相關分子的mRNA和蛋白表達，以相對于飲水組的相對倍數(shù)表示，采用非配對檢驗進行比較。以<0.05為顯著性檢驗水準。

表1 大鼠目的基因擴增引物序列信息

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠體重、酒精攝入量、血酒精濃度及酒精偏愛率的變化

2.1.1 35 d模型建立期間大鼠體重和酒精攝入量變化

為觀測慢性酒精暴露對大鼠基礎新陳代謝的影響，每日5:00 PM稱量大鼠體重。重復測量的雙因素方差分析結(jié)果表明，慢性酒精暴露模型建立35 d內(nèi)，飲用6%酒精水溶液對大鼠體重未產(chǎn)生顯著性影響[Alcohol(1,22)=0.649,=0.429]。在整個實驗期間，兩組大鼠的體重表現(xiàn)出同步增長[Time(5,110)=932.300,<0.0001] (圖1A)。結(jié)果表明，飲用6%酒精水溶液35 d對大鼠體重不產(chǎn)生影響，基本不影響大鼠的新陳代謝。

對于酒精攝入量，重復測量的單因素方差分析表明，整個實驗過程中大鼠飲酒量保持穩(wěn)定[(5,66)= 2.268,=0.121]，平均攝入量為6.47±1.08 g/kg/d (圖1B)。隨著飲用時間增長，大鼠飲酒量并沒有增加，始終保持穩(wěn)定，說明大鼠沒有產(chǎn)生酒精耐受。

2.1.2 慢性酒精暴露大鼠的血酒精濃度

在酒精暴露第7、14、21、28、35 d，對酒精暴露組大鼠的尾靜脈進行采血，檢測大鼠BALs，以了解酒精在大鼠體內(nèi)的維持狀況。整個實驗過程中，酒精暴露組大鼠的BALs平均為83.54±1.24 mg/dL，重復測量的單因素方差分析表明，酒精暴露組大鼠BALs保持穩(wěn)定[(4,55)=0.4265,=0.936] (圖1C)。結(jié)果表明，6% (V/V)酒精水溶液的慢性暴露可以讓大鼠體內(nèi)維持一定的BALs，大鼠相關行為的異常是酒精作用的結(jié)果。

2.1.3 模型建立前后大鼠酒精偏愛率

慢性酒精暴露開始前和結(jié)束后，對酒精暴露組大鼠進行5 d的雙瓶選擇實驗。在模型建立之前，重復測量的單因素方差分析表明，酒精暴露組大鼠的酒精偏愛率保持較低的穩(wěn)定水平[(4,55)=0.467,=0.721]，平均偏愛率為17.12±1.50%。而經(jīng)過35 d的酒精暴露之后，慢性酒精暴露組大鼠的酒精偏愛率明顯升高，重復測量的單因素方差分析顯示，時間因素影響了大鼠的酒精偏愛率[(4,55)=3.905,< 0.05]，測試第5 d，慢性酒精暴露組大鼠的酒精偏愛率顯著高于第1 d (<0.05)。5 d內(nèi)大鼠酒精偏愛率的最低值為43.10±5.54%，遠高于模型建立前大鼠的酒精偏愛率(圖1D)。

2.2 酒精對大鼠曠場行為的影響

為研究連續(xù)的酒精作用對大鼠自主活動量和焦慮樣行為的影響，在酒精暴露第7、14、21、28和35 d對兩組大鼠進行曠場實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大鼠偏向于在曠場外圍活動，這與嚙齒類動物的趨壁性習性相吻合(圖2A)。

重復測量的雙因素方差分析顯示，在35 d的慢性酒精暴露過程中，大鼠的水平活動量隨時間有所變化[Time(4,88)=24.150,<0.0001]，酒精因素所起的作用不大[Alcohol(1,22)=2.868,=0.113]。因酒精和時間因素沒有顯著的交互作用，本研究無法進行多重比較分析，為了使結(jié)果更直觀，本研究展示了具體的總活動距離(mean±S.E.M.)。慢性酒精暴露組和飲水對照組相比，在飲酒第7 d大鼠水平活動量有增加趨勢(飲水組：5457.75±192.75 cm酒精暴露組：7017.95±213.73 cm)，表明短期酒精暴露有刺激運動的作用；隨后這種差異在第14、21 d逐漸消失，飲水組和酒精暴露組總活動距離一致，表明神經(jīng)系統(tǒng)對酒精的適應性；而在飲酒第28 d和第35 d大鼠水平活動量有減少趨勢：第28 d，飲水組：5824.94± 144.86 cm酒精暴露組：4494.54±180.74 cm；第35 d，飲水組：5602.01±222.11cm酒精暴露組：3635.22±208.12 cm (圖2B)，反映了慢性酒精暴露的抑制性作用。

圖1 大鼠體重、飲酒量、血酒精濃度和酒精偏愛率的變化

A：慢性酒精暴露期間大鼠體重變化；B：大鼠每天酒精攝入量；C：血酒精濃度；D：模型建立前后大鼠酒精偏愛率。與酒精暴露前相比，***:<0.001表示差異顯著，=12/組。

圖2 酒精暴露期間大鼠的曠場行為

A：慢性酒精暴露第7 d、21 d、35 d大鼠曠場行為熱圖；B：慢性酒精暴露第7 d、14 d、21 d、28 d、35 d大鼠總活動距離；C：大鼠在中心區(qū)域停留時間比。

同樣，本研究也檢測了中心區(qū)域探索的時間百分比。重復測量的雙因素方差分析顯示，時間因素顯著影響了大鼠對中心區(qū)域的探索[Time(4,88)=4.607,<0.05]，而酒精因素所起的作用不大[Alcohol(1,22)= 0.105,=0.751] (圖2C)。與總活動距離結(jié)果一致，在飲酒第7 d和第14 d大鼠向中心區(qū)域探索的時間有增加趨勢：第7 d，飲水組：8.38±1.10%酒精暴露組：13.18±1.13%；第14 d，飲水組：8.24±1.35%酒精暴露組：10.40±1.16%。隨后這種差異在第21 d消失，而在飲酒第28 d和35 d酒精暴露組大鼠向中心區(qū)域探索的時間有減少趨勢：第28 d，飲水組：9.32±1.10%酒精暴露組：4.93±0.89%；第14 d，飲水組：9.64±1.25%酒精暴露組：6.87± 1.13%。

2.3 慢性酒精暴露大鼠mPFC內(nèi)DNA甲基化譜

雙瓶選擇實驗之后，分別選取飲水對照組和慢性酒精暴露組大鼠各4只，立即將其處死，分離mPFC核團，提取mPFC總DNA，濃度和質(zhì)量測定后分別選取每組3個樣本進行RRBS測序。

從圖3A可以看出，兩組樣品中甲基化的胞嘧啶CpG類型的比例最高，這是因為哺乳動物的胞嘧啶甲基化一般發(fā)生在CpG位點。其余類型的甲基化均較低，對總甲基化水平貢獻不大。對于不同胞嘧啶類型的甲基化水平，盡管慢性酒精暴露組均略高于飲水對照組，但總體上兩組甲基化水平?jīng)]有差異。為了更進一步分析CpG的甲基化變化，本研究對兩組樣本的CpG進行了不同特征區(qū)域的注釋(圖3B)。結(jié)果表明，甲基化差異區(qū)域有66%存在于基因連接區(qū)，23%存在于內(nèi)含子區(qū)，9%存在于外顯子區(qū)，2%存在于啟動子區(qū)。在所有甲基化存在差異的CpG位點，僅有2%存在于啟動子區(qū)的CpG島，4%存在于CpG島岸。

本研究進一步對甲基化水平差異最大的基因進行GO功能富集(Top 20)和KEGG通路分析(Top 30)。GO結(jié)果顯示，差異基因多為突觸相關基因、谷氨酸受體、跨膜轉(zhuǎn)運體和離子通道，這些基因與神經(jīng)系統(tǒng)功能密切相關(圖3C)。通過對差異基因進行KEGG通路分析，發(fā)現(xiàn)甲基化差異基因與mTOR信號通路、可卡因成癮、Ras信號通路、cAMP信號通路、FoxO信號通路、安非他命成癮和Rap1信號通路等密切相關(圖3D)。

圖3 RRBS測序結(jié)果

A：兩組樣品中不同胞嘧啶類型的平均甲基化水平；B：差異甲基化區(qū)域在功能元件上的注釋；C：甲基化基因的GO功能富集(Top 20)；D：甲基化差異基因的KEGG通路分析(Top 30)。不同胞嘧啶類型包括CpG、CHG、CHH、CN，H代表除了G以外的A、T、C堿基。

2.4 慢性酒精暴露大鼠mPFC內(nèi)基因啟動子區(qū)甲基化水平及酒精濫用相關基因的篩選

哺乳動物啟動子區(qū)的CpG位點的甲基化水平與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)密切相關，因此本研究著重分析了啟動子區(qū)CpG差異位點。為了更直觀地表現(xiàn)出慢性酒精暴露組與飲水對照組大鼠mPFC內(nèi)基因啟動子區(qū)甲基化的差異，本研究對位于啟動子區(qū)的340個差異位點進行了熱圖分析(圖4A)。熱圖中每一行為一個位點，每一列代表一個樣本，左邊3列為酒精暴露組，右邊3列為飲水組。最上邊的樹狀結(jié)構表示不同樣本間的聚類，本圖中慢性酒精暴露組聚在一起，飲水對照組聚在一起，說明組內(nèi)樣本親緣關系更近，樣本聚類良好。左邊的樹狀結(jié)構為差異位點的聚類關系。盡管兩組樣本mPFC內(nèi)整體甲基化水平無顯著差異，但在啟動子區(qū)，慢性酒精暴露組的甲基化水平顯著高于飲水對照組。其中與對照組相比，慢性酒精暴露組大鼠mPFC內(nèi)存在67個低甲基化位點和273個高甲基化位點，這些位點涉及到241個已知基因。

通過濫用與成癮數(shù)據(jù)庫，并查閱相關文獻，篩選出與藥物依賴及酒精濫用密切相關的啟動子區(qū)甲基化差異基因共10個。與飲水對照組大鼠相比，慢性酒精暴露組大鼠mPFC內(nèi)基因啟動子區(qū)甲基化升高的基因包括神經(jīng)營養(yǎng)因子3 (neurotrophin factor-3,) (<0.001)、丙酮酸脫氫酶磷酸酶催化亞單元1 (pyruvate dehyrogenase phosphatase catalytic subunit 1,) (<0.01)、Mg2+/Mn2+依賴的蛋白質(zhì)磷酸酶1G (protein phosphatase-Mg2+/Mn2+-dependent-1G,) (<0.05)、FMS樣酪氨酸激酶1 (FMS-like tyrosine kinase 1,) (<0.0001)和神經(jīng)連接蛋白2 (neuroligin 2,) (<0.05)，啟動子區(qū)甲基化降低的基因包括亨廷頓相關蛋白1 (huntingtin-associated protein 1,) (<0.05)、核因子κB (nuclear factor kappa B p100,) (<0.05)、RTKN蛋白2 (rhotekin 2,) (<0.01)、雙特異性磷酸酶1 (dual specificity phosphatase 1,) (<0.05)和雙特異性磷酸酶8 (dual specificity phosphatase 8,) (<0.05) (圖4B)。

圖4 啟動子區(qū)甲基化水平及甲基化差異基因轉(zhuǎn)錄驗證

A：啟動子區(qū)甲基化差異位點聚類圖。紅、黑、綠信號代表甲基化程度的高低，紅色信號越強，代表甲基化程度越高，反之則代表甲基化程度越低。B：慢性酒精暴露組和飲水對照組mPFC內(nèi)10個基因啟動子區(qū)的甲基化程度。C：慢性酒精暴露組和飲水對照組mPFC內(nèi)10個甲基化差異基因的mRNA表達水平。與飲水組相比，*:<0.05表示有差異，**:<0.01表示有明顯差異，***:<0.001表示差異顯著，****:<0.0001表示差異極顯著。

本研究進一步利用qRT-PCR對這10個甲基化差異基因進行轉(zhuǎn)錄水平的驗證(圖4C)。結(jié)果表明，慢性酒精暴露后，大鼠mPFC內(nèi)、啟動子區(qū)CpG位點甲基化水平升高，抑制轉(zhuǎn)錄，導致其mRNA水平降低；而和啟動子區(qū)CpG位點甲基化水平降低，解除或削弱了轉(zhuǎn)錄抑制作用，導致其mRNA水平升高。

2.5 慢性酒精暴露大鼠mPFC內(nèi)甲基化調(diào)控酶的表達

經(jīng)過35 d的慢性酒精暴露和5 d的雙瓶選擇，本研究檢測了大鼠mPFC內(nèi)DNMTs和MeCP2蛋白和mRNA表達改變(圖5)。非配對檢驗顯示，相較于飲水對照組，酒精暴露組大鼠mPFC內(nèi)的DNMT1 (蛋白：=0.824,=0.424; mRNA:=0.885,=0.391)和DNMT3A (蛋白:=1.510,=0.153; mRNA:= 0.064,=0.950)表達無明顯改變，而DNMT3B (蛋白:=9.800,<0.0001; mRNA:=5.364,<0.0001)和MeCP2 (蛋白:=13.94,<0.0001; mRNA:=4.652,<0.001)表達顯著升高。

2.6 短期酒精暴露對大鼠mPFC內(nèi)甲基化調(diào)控酶的影響

為了明確短期內(nèi)酒精暴露對甲基化調(diào)控酶的作用，讓大鼠自由飲酒7 d后，本研究檢測了mPFC內(nèi)DNMTs和MeCP2的蛋白和mRNA表達改變(圖6)。非配對檢驗顯示，短期酒精暴露不影響DNMT1 (蛋白:=0.092,=0.928; mRNA:=0.440,=0.670)、DNMT3A (蛋白:=0.153,=0.880; mRNA:=0.209,=0.739)、DNMT3B (蛋白:=0.198,=0.846; mRNA:=0.182,=0.859)和MeCP2 (蛋白:=0.060,=0.953; mRNA:=0.394,=0.653)的表達。

圖5 慢性酒精暴露后大鼠mPFC內(nèi)DNMT1、DNMT3A、DNMT3B和MeCP2蛋白及mRNA表達改變

A：慢性酒精暴露后大鼠mPFC內(nèi)DNMT1、DNMT3A、DNMT3B和MeCP2蛋白條帶；B：慢性酒精暴露后大鼠mPFC內(nèi)DNMT1、DNMT3A、DNMT3B和MeCP2蛋白表達；C：慢性酒精暴露后大鼠mPFC內(nèi)、、和的mRNA表達。與飲水組比較，***:<0.001表示差異顯著，****:< 0.0001表示差異極顯著。

圖6 短期酒精暴露后大鼠mPFC內(nèi)DNMT1、DNMT3A、DNMT3B和MeCP2蛋白和mRNA表達改變

A：短期酒精暴露后大鼠mPFC內(nèi)DNMT1、DNMT3A、DNMT3B和MeCP2蛋白條帶；B：短期酒精暴露后大鼠mPFC內(nèi)DNMT1、DNMT3A、DNMT3B和MeCP2的蛋白表達；C：短期酒精暴露后大鼠mPFC內(nèi)、、和的mRNA表達。

3 討論

酒精濫用是一種由遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的復雜疾病，涉及獎賞、動機、學習記憶、情緒和執(zhí)行功能等多種神經(jīng)生物學過程，盡管科研人員對其神經(jīng)生物學機制進行了深入研究，但尚未研發(fā)出有效的藥物。前額葉皮質(zhì)參與調(diào)控認知、情感、情緒、動機、決策等生物學進程，其中mPFC與酒精濫用引起的神經(jīng)適應性改變密切相關。DNA甲基化在長時程記憶的形成以及藥物成癮中都具有重要作用，DNMTs可通過催化5?-CpG-3?上的胞嘧啶發(fā)生甲基化來調(diào)節(jié)下游基因的表達，從而產(chǎn)生持久的神經(jīng)生物學改變并最終影響個體行為調(diào)控，然而在mPFC內(nèi)DNMTs的活性對于酒精相關行為的調(diào)控作用仍不清楚。

本研究建立大鼠慢性酒精暴露模型，檢測了大鼠的自主活動和焦慮樣行為，發(fā)現(xiàn)在飲酒第7 d酒精暴露組大鼠總活動距離和中心區(qū)域探索時間比飲水對照組高，表明短期內(nèi)低濃度飲酒，可以增加大鼠的自主活動量，并在一定程度上減輕焦慮樣情緒。隨著飲酒時間的增加，在連續(xù)飲酒21 d后酒精暴露組與飲水對照組大鼠之間活動總距離和中心區(qū)探索時間差異逐漸縮小，反映了長期飲酒后大鼠對酒精的適應性。而飲酒28 d后，大鼠總活動距離和中心區(qū)探索時間又減少并低于飲水對照組，表明慢性低濃度飲酒給大鼠帶來了不適感，減少了大鼠的自主活動量，并加重了大鼠的焦慮樣行為。與本研究結(jié)果一致的是，Boerngen-Lacerda等[13]發(fā)現(xiàn)2 g/kg的酒精對小鼠急性灌胃或灌胃7 d，均增加了小鼠對高架十字迷宮開臂的探索時間和曠場實驗的自主活動距離。出生4~9 d的雄性大鼠幼崽暴露在5.25 g/kg/d的酒精環(huán)境下連續(xù)一個月，活動性和探索行為均降低，并且社交行為變少[14]。大量的動物實驗和臨床資料表明，焦慮與酒精濫用兩者之間存在復雜的交互聯(lián)系[15,16]。酒精濫用和依賴作為慢性復發(fā)性疾病，在發(fā)展過程中焦慮起了促進作用[17]。短期內(nèi)飲酒降低短時程焦慮，而長期飲酒反而增加長時程焦慮。多數(shù)慢性飲酒或酒精戒斷能夠通過生理-心理-社會機制引起顯著的焦慮癥狀。個體飲用一定濃度酒精后，酒精的心理或藥理作用可以緩解焦慮癥狀，在此過程中，酒精通過負強化作用促進焦慮個體提高飲酒量和飲酒頻率[18]。

盡管DNA甲基化異?？梢栽黾雍芏嗉膊〉幕疾★L險，酒精濫用的甲基化研究尚處于早期階段。目前的研究偏向于飲酒個體外周血的基因組甲基化或酒精誘導的某個基因甲基化的異常。有研究表明酒精濫用患者外周血DNA甲基化較健康對照組顯著升高，伴隨DNMT3A和DNMT3B mRNA水平的降低[19,20]。利用甲基化芯片對臺灣地區(qū)酒依賴患者外周血全基因組DNA進行檢測，發(fā)現(xiàn)酒依賴組整體DNA甲基化程度較對照組明顯升高[21]。與血液基因組相比，來自大腦基因組的甲基化差異更能說明酒精相關行為的中樞控制機制。本研究通過提取慢性酒精暴露大鼠mPFC基因組DNA，進行RRBS測序分析，發(fā)現(xiàn)兩組大鼠mPFC內(nèi)整體基因組甲基化無顯著差異，但仍有911個高甲基化差異甲基化區(qū)域(differentially methylated region, DMR)和560個低甲基化DMR，進一步分析啟動子發(fā)現(xiàn)，慢性酒精暴露組大鼠mPFC啟動子區(qū)甲基化水平顯著高于飲水對照組。通過對差異基因的功能富集分析和通路分析，本研究篩選出與酒精濫用密切相關的甲基化差異基因、、和，在mRNA水平驗證了其表達。其中，在神經(jīng)元分化、突觸發(fā)育和可塑性起關鍵的調(diào)控作用[22,23]，本實驗室前期研究也證實是酒精濫用的靶基因[12]。Ruggeri[9]等對18對患有酒精使用障礙的單卵雙胞胎外周血DNA進行了全基因組甲基化分析，證明與酒精使用障礙和行為控制期間的大腦活動有關。此外，通過影響鈣信號通路從而調(diào)控神經(jīng)元興奮性[24,25]。同時，可以使絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPK)蘇氨酸/酪氨酸殘基特異性去磷酸化，從而調(diào)控細胞的生長、分化、增殖及凋亡[26]。以上甲基化差異基因的篩選為酒精濫用的分子機制提供了可能靶點。

DNA甲基化是由甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltrans-ferase, DNMTs)調(diào)控的。DNMTs大致分為兩類：(1)從頭甲基化酶，包括DNMT3A和DNMT3B，在未經(jīng)甲基化的DNA上建立初始甲基化模式；(2)維持甲基化酶DNMT1，在DNA復制過程中將甲基化模式從親本DNA鏈上復制到子代鏈[27,28]。DNMTs的這些獨特功能可以確保DNA甲基化模式在不同個體中以組織特異性方式維持和保存。此外，DNMTs、甲基化CpG位點結(jié)合蛋白-2(MeCP2)、HMTs、HDACs可能通過復雜的交互作用影響DNA的甲基化水平，調(diào)節(jié)相關基因的表達，從而對酒精相關表型發(fā)揮作用[29]。DNMT1和DNMT3A基因雙敲除小鼠Hip神經(jīng)元體積減小，學習和記憶能力受損[30]。大鼠伏隔核(nucleus accumbens, NAc)中DNMT3A過表達能夠增加相應神經(jīng)元的樹突棘密度，同時減弱可卡因誘導的獎賞效應[31]。MeCP2基因敲除小鼠比野生型小鼠對酒精有更強的敏感性和戒斷效應[32]。本研究也發(fā)現(xiàn)，慢性酒精暴露后，大鼠mPFC內(nèi)DNMT3B和MeCP2表達升高。由此看來，動態(tài)的DNA甲基化調(diào)節(jié)對酒精相關表型的改變和維持至關重要，而DNMTs和MeCP2作為DNA甲基化的調(diào)控者，所起的重要作用不言而喻。然而，大鼠飲酒7 d，其mPFC內(nèi)DNMTs和MeCP2未發(fā)生顯著改變。由于表觀遺傳修飾是環(huán)境因素長期刺激的結(jié)果，并可以遺傳給后代[33]，猜測短期酒精作用不足以引起甲基化調(diào)控酶及DNA甲基化譜的改變。

本研究成功建立了大鼠慢性酒精暴露模型，獲得慢性酒精暴露大鼠mPFC內(nèi)DNA甲基化譜，并篩選出與酒精濫用相關的基因、、和，且明晰了調(diào)控DNA甲基化的關鍵酶，為未來表觀遺傳學在酒精濫用中的機制研究提供了基礎，將來尚需從以下兩個方面進行深入研究：(1)所得甲基化譜樣本量太小，應該針對與酒精濫用相關的甲基化差異基因，采用BSP挑克隆測序進行擴大樣本量驗證，使篩選出的差異基因更可靠。(2)本研究發(fā)現(xiàn)DNMT3B和MeCP2調(diào)控酒精誘導的DNA甲基化的改變，接下來應運用甲基轉(zhuǎn)移酶特異性干預劑驗證它們在酒精濫用中的作用。

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DNA methylation in the medial prefrontal cortex regulates alcohol-related behavior in rats

Hengzhen Cui1, Mizhu Sun2, Runzhi Wang2, Chenyu Li3, Yuxuan Huang3, Qiuju Huang3, Xiaomeng Qiao2

Alcohol abuse causes tissue and organ damage, and may participate neuropsychiatric diseases. Studies have shown that DNA methylation plays an important role in gene expression and behavioral changes induced by alcohol, however the causative neurobiological mechanisms have not been clarified. In this study, 32 healthy adult male SD rats were randomly divided into a drinking water control group (=16) and a chronic alcohol exposure group (=16). The alcohol preference and locomotor activity of rats were evaluated by two-bottle choice test (TBCT) and open-field test (OFT). DNA methylation in the medial prefrontal cortex (mPFC) tissue was detected by the reduced representative bisulfite sequencing (RRBS) technology. The methylation differential genes closely related to alcohol abuse were screened. qRT-PCR was used to verify the mRNA expression patterns of differential genes. qRT-PCR and Western blot were used to detect the expression of DNA methyltransferases (DNMTs) and methyl CpG binding protein 2 (MeCP2).Furthermore, the effect of short-term alcohol exposure (7 days) on DNMTs and MeCP2 in the mPFC of rats was tested (=8/group). The results indicated that the methylation level of promoter region in the mPFC of rats exposed to chronic alcohol was significantly increased. In addition, the increased methylation levels in the promoter ofandwere accompanied by down-regulated mRNA levels in the chronic alcohol exposure group. The decreased methylation levels in the promoter ofandwere accompanied by up-regulated mRNA levels. Furthermore, chronic alcohol exposure increased the mRNA and protein levels of DNMT3B and MeCP2. However,short term alcohol exposure did not affect their expression. This present study provides evidence that DNA methylation is associated with the development of alcohol abuse, which may be regulated by DNMT3B and MeCP2. The target genes,,,andrelated to alcohol abuse were discovered as well, providing new insights into the neurobiological mechanism of alcohol abuse and the potential pharmacological targets for the treatment of alcohol abuse.

alcohol abuse; DNA methylation; DNA methyltransferases; medial prefrontal cortex

2019-09-02;

2019-11-21

國家自然科學基金項目(編號：81373247)和鄭州大學大學生創(chuàng)新項目(編號：2019cxcy054)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 81373247) and the Innovative Project for College Students of Zhengzhou University (No. 2019cxcy054)]

崔亨貞，本科生，專業(yè)方向：基礎醫(yī)學。E-mail: chzzzu@163.com

喬曉孟，博士，講師，研究方向：酒精濫用的神經(jīng)生物學機制。E-mail: xiaomeng416520@126.com

10.16288/j.yczz.19-261

2019/12/25 17:11:05

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20191224.1714.002.html

(責任編委: 吳強)