★ 白書仙 衛(wèi)靜 賀琪 龍劍文 石全 李恒

（湖北省中醫(yī)院皮膚科 武漢 430061）

特異性皮炎（atopic dermatitis，AD），又稱遺傳過敏性皮炎，是常見的一種慢性的非特異性皮膚炎癥。目前發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前認(rèn)為免疫炎性反應(yīng)在發(fā)病過程中發(fā)揮了重要作用［1］。

Toll 樣 受 體（toll-like receptors，TLRs） 介導(dǎo)的免疫反應(yīng)在機(jī)體免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用［2］。目前，TLRs 與AD 發(fā)病的聯(lián)系成為研究熱點(diǎn)。有研究表明，TLRs 參與AD 免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)過程，與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)。在本文中，我們通過BABL/c 小鼠建立AD 的動(dòng)物模型，觀察健脾養(yǎng)血湯對特異性皮炎小鼠模型中Toll 樣受體的表達(dá)影響情況。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 主要試劑 Total RNA 提取試劑（RNAiso Plus）購 買 于 日 本TAKARA 公 司，5×PrimeScript?RT Master Mix 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購買于TAKARA 公司，SYBR?Premix Ex TaqTM II（Perfect Real Time）購買于TAKARA 公司。2，4- 二硝基氟苯（DNFB）購于美國sigma 公司。

1.2 動(dòng)物模型制備 BABL/c 雌性小鼠進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室后，標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng)1 周后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。參照Heller 等［3］的方法制備AD 小鼠模型。實(shí)驗(yàn)前1d，以剃刀剃除小鼠背部面積約2cm×3cm 毛發(fā)，剃毛處外涂100mL0.5%DNFB 進(jìn)行誘導(dǎo),連續(xù)10d。造模成功后，模型組小鼠背部皮膚表現(xiàn)為紅斑、丘疹、增厚、結(jié)痂，皮膚干燥，可見干裂。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物制備 健脾養(yǎng)血湯水煎液配方為：黨參15g，茯苓20g,白術(shù)15g，黃芪30g，白鮮皮20g,地膚子20g，土茯苓30g，當(dāng)歸20g，制首烏10g，荊芥10g,防風(fēng)10g,烏梅15g,五味子15g，甘草10g。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組 BABL/c 雌性小鼠（武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）30 只，體重15～20g。按照隨機(jī)數(shù)字表將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為正常對照組、特異性皮炎模型組、中藥治療組，每組10 只。健脾養(yǎng)血湯治療組予健脾養(yǎng)血湯水煎液灌胃（10mL/kg），正常對照組和特異性皮炎模型組予等量生理鹽水灌胃，連續(xù)1 周。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（Real-time PCR）測定各組TLR2、TLR3、TLR4、TLR9 表達(dá) RNA制備試劑盒提取皮膚組織總RNA，采用TAKARA逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒檢測Toll 樣受體mRNA 的表達(dá)，以三磷酸甘油醛脫氫酶（GADPH）作為內(nèi)參對照。反應(yīng)參數(shù)：95℃變性4min；95℃ 30s，55℃1min，72℃1min，35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。每個(gè)樣本設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，使用StepOne Software v2.1 軟件（Applied Biosystems 公司）分析PCR 過程各檢測樣本的Ct（Threshold cycle）值，CT 值代表熒光實(shí)時(shí)定量PCR 的結(jié)果，ΔCT=CT（目的基因）-CT（內(nèi)參基因），ΔΔCT=ΔCT（實(shí)驗(yàn)組）-ΔCT（對照組）。根據(jù)公式可以算出各組細(xì)胞中目的基因表達(dá)/對照組細(xì)胞中目的基因表達(dá)=2-ΔΔCT 表 示［4］。采用primer premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。具體序列如下：TLR2（上游引物：5'- GCTCCTGCGAACTCCTATCC-3'，下 游 引 物：5'- CAGCAGACTCCAGACACCAG-3'）；TLR3（上游引物：5'- GGCAGCAGGTGGAATTTGTAT-3'，下游引物：5'- CCAAGTTGCCGTTTCTTGTT -3'）；TLR4（上游引物：5'- GCTCACGCGCAGACACATCC-3'，下游引物：5'- CAGCACACTTCAAGACCCAG-3'）；TLR9（上游引物：5'- GGCGCAGGATGGAATTTGTAT-3'，下游引 物：5'- CCAAGTACGTACGTTCTTGTT -3'）；GAPDH（上游引物：5'- CAGCAAGGACACTGAGCAAGA-3'，下游引物：5'- GCCCCTCCTGTTATTATGGGG -3'）。

1.6 皮膚炎癥分?jǐn)?shù)檢測 評估治療后1 周皮膚炎癥的分?jǐn)?shù)，按照研究者整體評價(jià)法評估皮損處水腫、紅斑和出血的嚴(yán)重程度進(jìn)行評分［5］。采用六級評分法評為0～5 分：0 分為無皮損；1 分為幾乎沒有皮損僅有可察覺的紅斑和丘疹/浸潤；2 分為輕度的紅斑和丘疹/漫潤；3 分為中度的紅斑和丘疹/浸潤；4 分為重度的紅斑和丘疹/浸潤；5 分為非常嚴(yán)重伴有滲出和結(jié)痂的嚴(yán)重的紅斑和丘疹/浸潤。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)以（）表示，采用兩樣本的t檢驗(yàn)法進(jìn)行檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 熒光定量PCR 法檢測各組TLR2、TLR3、TLR4、TLR9 表達(dá) 圖1 顯示，模型組小鼠皮膚組 織 中TLR2，TLR3、TLR4、TLR9mRNA 表 達(dá)明顯升高，與空白對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。治療組皮膚組織TLR2，TLR3、TLR4、TLR9mRNA 表達(dá)較模型組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)測定TLR2、TLR3、TLR4、TLR9mRNA表達(dá)

2.2 健脾養(yǎng)血湯劑對皮膚炎癥分?jǐn)?shù)的影響 評估治療后1 周皮膚炎癥的分?jǐn)?shù)，模型組分?jǐn)?shù)較正常組顯著增高（P＜0.05），健脾養(yǎng)血湯劑治療組皮膚炎癥分?jǐn)?shù)低于模型組（P＜0.05）。見表1。

表1 健脾養(yǎng)血湯治療特異性皮炎小鼠模型后皮膚炎癥評分（n=10）

3 討論

特應(yīng)性皮炎是一種與遺傳及免疫相關(guān)的復(fù)發(fā)性炎性皮膚病，以劇烈瘙癢、皮膚屏障異常、以及多種致病微生物如金葡萄球菌、真菌及某些病毒的定植與感染為特征，發(fā)病機(jī)制尚不明確。有研究表明AD 患者的發(fā)病與Toll 樣受體密切相關(guān)。TLRs目前在感染性皮膚病如帶狀皰疹、麻風(fēng)病、念珠菌病、皮膚利什曼病及一些皮膚免疫相關(guān)疾病中成為研究熱點(diǎn)［6］。本研究也發(fā)現(xiàn)在特異性模型組中TLR2、TLR3、TLR4 及TLR9mRNA 水平較正常對照組明顯增加，說明TLR2、TLR3、TLR4 和TLR9可能參與了特異性皮炎發(fā)病過程中的免疫反應(yīng)。

TLRs 是一種模式識別受體，它可以通過識別、結(jié)合外界病原體的病原相關(guān)分子模式和機(jī)體組織損傷相關(guān)分子模式，激活下游信號通路，啟動(dòng)依賴性髓樣細(xì)胞分化因子88（myeloid differentiation factor,MyD88）和非依賴性MyD88 的β 干擾素TIR 結(jié)構(gòu)域銜接蛋白（toll/IL-1receptor domain containing adaptor inducing IFN-β，TRIF）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，誘導(dǎo)NF-κB 核轉(zhuǎn)錄，刺激促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生［2］。因此，采取干預(yù)TLRs 信號通路進(jìn)而抑制下游產(chǎn)生的過多的炎性因子可能成為一種治療特異性皮炎的策略。我們通過健脾養(yǎng)血湯治療特異性皮炎小鼠發(fā)現(xiàn)TLR2、TLR3、TLR4 及TLR9mRNA水平較模型組均明顯下降，皮炎炎癥分?jǐn)?shù)也相應(yīng)降低，說明健脾養(yǎng)血湯可以抑制TLR2、TLR3、TLR4及TLR9mRNA 表達(dá)進(jìn)而產(chǎn)生抗炎作用。

西醫(yī)治療特異性皮炎多使用含有糖皮質(zhì)激素的軟膏治療效果較好，但長期使用會(huì)帶來如皮膚變薄、毛細(xì)血管擴(kuò)張、多毛、病情反復(fù)發(fā)作等許多不良反應(yīng)［7］。中藥一直廣泛用于治療皮膚疾病，而且臨床研究結(jié)果表明中藥是有效、安全的治療方法之一。我們的研究結(jié)果提供了健脾養(yǎng)血湯通過抑制Toll 樣受體治療特異性皮炎的理論依據(jù)。總之，我們在動(dòng)物體內(nèi)證實(shí)健脾養(yǎng)血湯抑制Toll 樣受體的作用，但其抑制作用還需在特異性皮炎患者體內(nèi)得到進(jìn)一步證實(shí)。