★ 胡順金 王琴琴 王東 金華 任克軍 王億平 章雪蓮 牛云飛

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 合肥 230031；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院 合肥 230038）

糖尿病腎?。―isbetic nephropathy，DN）是糖尿?。―iabetes mellitus，DM）最嚴(yán)重的微血管病變之一，不僅大大增加了DM 的死亡風(fēng)險(xiǎn)，也是導(dǎo)致終末期腎病的主要病因之一［1］。大量臨床及實(shí)驗(yàn)研究［2-4］均證實(shí)足細(xì)胞損傷、脫落導(dǎo)致腎小球基底膜（Glomerular basement membrane，GBM）裸露，產(chǎn)生病理性蛋白尿。西醫(yī)治療DN 的療效不佳，而中醫(yī)藥在消減尿蛋白、防治DN 方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。糖腎康顆粒是我院曹恩澤教授針對(duì)DN 氣陰兩虛血瘀的病機(jī)及多年臨床經(jīng)驗(yàn)研制而成，在臨床治療中取得較好療效。本課題通過觀察糖腎康顆粒對(duì)DN 氣陰兩虛血瘀證患者臨床療效及治療前后尿中足糖萼蛋白（Podocalyxin，PCX）、腎病蛋白（nephrotic protein，Nephrin）、腎小球足細(xì)胞裂隙膜蛋白（glomerular podrocell fissure membrane protein，Podocin）的表達(dá)，探討糖腎康顆粒的作用機(jī)制，為中醫(yī)藥防治DN 提供可靠的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2016 年1 月—2017 年1 月于我院腎病科及內(nèi)分泌科住院DN 氣陰兩虛血瘀證患者72 例，按就診先后順序隨機(jī)分為觀察組和對(duì)照組各36 例。治療過程中共剔除3 例，其中觀察組1 例，對(duì)照組2 例，實(shí)際完成69 例，觀察組35 例，對(duì)照組34 例。觀察組中男性23 例，女性12 例；平均年齡（47.28±6.11）歲；發(fā)現(xiàn)DM 病程（9.34±2.20）年；發(fā)現(xiàn)DN 病程（14.45±1.35）月。對(duì)照組中男性21 例，女性13 例；平均年齡（49.28±5.46）歲；發(fā)現(xiàn)DM 病程（9.08±1.77）年；發(fā)現(xiàn)DN 病程（13.91±1.46）月。另從我院體檢中心隨機(jī)選取20 名同期健康體檢正常者設(shè)為正常組，男性12 例，女性8 例；平均年齡（46.23±6.43）歲，檢測尿中PCX、Nephrin、Podocin 的水平。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)：DM 診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］：參照2014 年美國糖尿病協(xié)會(huì)修訂的標(biāo)準(zhǔn)。DN 診斷標(biāo)準(zhǔn)［6-7］：參照Mogensen 分期結(jié)合2007 年美國K/DOQI 指南屬于Ⅲ期和Ⅳ期者。

中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)：參照中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)腎病分會(huì)于2007 年頒布的《DN 診斷、辨證分型及療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)》［8］中關(guān)于氣陰兩虛證及血瘀證的評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)：①氣陰兩虛證：主癥：倦怠乏力、口渴口干；次癥：氣短懶言，自汗、盜汗；舌脈：舌淡紅、少苔或花剝，脈細(xì)弱或細(xì)數(shù)無力。②血瘀證：主癥：肢體麻痛；次癥：肌膚甲錯(cuò)；舌脈：舌紫暗或有瘀斑、舌下青筋顯露，脈澀。主癥必備，次癥或兼，結(jié)合舌脈。

中醫(yī)癥狀量化評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［9］：參照2002 年《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則（試行）》“中藥新藥治療糖尿病的臨床研究指導(dǎo)原則”中癥狀分級(jí)量化標(biāo)準(zhǔn)，按照癥狀輕、中、重分為3 級(jí)，分別記為2、4、6 分，如無相應(yīng)癥狀，則記為0 分。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡在20～65 歲之間；符合DM 和DN Ⅲ期、Ⅳ期及氣陰兩虛血瘀證者；連續(xù)兩次以上檢測尿微量白蛋白與尿肌酐比值（UACR）＞30mg/g·cr 和24h 尿蛋白定量（24hUPr）＜3.5g；腎小球?yàn)V過率（用CKDEPI 公式估算）≥60mL/（min·1.73m2）；配合本課題治療方案、按時(shí)用藥者；自愿參加臨床試驗(yàn)，并簽署知情同意書。

排除標(biāo)準(zhǔn)：有可引起蛋白尿的原發(fā)性腎臟疾病或其他系統(tǒng)性疾病者；納入前1 月內(nèi)有泌尿系統(tǒng)感染和/或DM 酮癥酸中毒者；妊娠期或哺乳期患者；有合作障礙的患者，如合并精神系統(tǒng)疾??；入組前3 個(gè)月內(nèi)使用免疫抑制劑；已知對(duì)該研究用藥某些成分過敏者；已參加其他臨床試驗(yàn)者。

1.4 治療方法 所有患者均給予基礎(chǔ)治療。兩組患者均給予由北京諾華制藥有限公司生產(chǎn)的劑量為80mg/d 的纈沙坦膠囊（產(chǎn)品批號(hào)為X2116）；目標(biāo)血壓控制在140/90mmHg 以下，其中大于60歲的患者，血壓控制在150/90mmHg 以內(nèi)［10］；若血壓≥140/90mmHg 或60 歲以上患者血壓≥150/90mmHg，酌情添加鈣離子拮抗劑；若仍不達(dá)標(biāo)再加用利尿劑、β 受體阻滯劑等；研究過程中不使用ACEI 類藥物或其他ARB 類（除纈沙坦膠囊外）藥物等，以防止對(duì)療效產(chǎn)生影響。觀察組在對(duì)照組的基礎(chǔ)上加用具有益氣養(yǎng)陰化瘀功效的糖腎康顆粒（院內(nèi)制劑，由黃芪、丹參、山藥、葛根等組成。由安徽省中醫(yī)院制劑中心制成，產(chǎn)品批號(hào)20150825，每袋顆粒劑l0g），1 袋/次，3 次/日，口服。兩組療程均為8 周。

1.5 觀察指標(biāo) 兩組臨床療效，中醫(yī)證候積分值，治療前后尿微量白蛋白與尿肌酐比值（UACR）、24h 尿蛋白定量（24hUPr）及尿中PCX、Nephrin、Podocin 蛋白的水平變化。

1.6 療效判定標(biāo)準(zhǔn) 疾病療效判定標(biāo)準(zhǔn)：參照中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)腎病分會(huì)2007 年頒布的《DN 診斷、辨證分型及療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)》制定［7］：臨床控制、顯效、有效和無效。

中醫(yī)證候療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：參照2002 年《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則（試行）》中“DM 的證候療效判定標(biāo)準(zhǔn)” 制定［8］。臨床痊愈、顯效、有效和無效。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，先進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)及齊性檢驗(yàn)，如符合正態(tài)分布及方差齊性，采用t 檢驗(yàn)，否則用非參數(shù)檢驗(yàn)。以P＜0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床疾病療效比較 觀察組總有效率為88.57%，優(yōu)于對(duì)照組67.65%，有顯著性差異（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組臨床療效比較 例（%）

2.2 中醫(yī)證候療效比較 觀察組中醫(yī)證候總有效率91.43%，優(yōu)于對(duì)照組55.88%，兩組中醫(yī)證候療效有顯著性差異（P＜0.01）。見表2。

表2 兩組中醫(yī)證候療效比較 例（%）

2.3 治療前后兩組中醫(yī)證候積分比較 兩組治療前中醫(yī)證候積分比較無明顯差異（P＞0.05），治療后兩組均較治療前下降（P＜0.01），觀察組下降幅度優(yōu)于對(duì)照組（P＜0.01）。見表3。

表3 兩組治療前后中醫(yī)證候積分比較（）

表3 兩組治療前后中醫(yī)證候積分比較（）

注：與同組治療前比較，*P＜0.01；與對(duì)照組比較，△P＜0.01。

組別 n 治療前治療后積分 下降幅度觀察組 35 26.57±2.50 12.63±7.15*△ 13.94±6.50△對(duì)照組 34 27.12±3.55 19.00±7.95* 8.12±2.34

2.4 治療前后兩組UACR 、24hUPr 水平比較 兩組治療前UACR、24hUPr 水平比較無明顯差異（P＞0.05），治療后兩組UACR、24hUPr 水平均較治療前顯著降低（P＜0.01），觀察組優(yōu)于對(duì)照組（P＜0.01）。見表4。

表4 兩組治療前后UACR、24hUPr水平比較（）

表4 兩組治療前后UACR、24hUPr水平比較（）

注：與同組治療前比較，*P＜0.01；與對(duì)照組比較，△P＜0.01。

組別 n UACR（mg/g·cr） 24hUPr（g/24h）觀察組治療前35 205.13±28.40 0.37±0.06治療后 100.69±53.12*△ 0.19±0.02*△對(duì)照組治療前34 191.88±29.91 0.36±0.05治療后 149.90±82.40* 0.26±0.01*

2.5 兩組治療前后尿PCX、Nephrin、Podocin 水平比較 兩組治療前尿PCX、Nephrin、Podocin 水平均高于正常組（P＜0.01）；兩組治療后尿PCX、Nephrin、Podocin 水平均較治療前下降（P＜0.05 或P＜0.01），且觀察組優(yōu)于對(duì)照組（P＜0.05）。見表5。

表5 三組治療前后尿PCX、Nephrin、Podocin水平比較（）

表5 三組治療前后尿PCX、Nephrin、Podocin水平比較（）

注：與正常組比較，▲P＜0.01；與對(duì)照組比較，△P＜0.05；與同組治療前比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 n PCX（ng/mL） Nephrin（ng/mL） Podocin（pg/mL）正常組 20 5.39±0.91 12.40±2.52 0.01±0.01觀察組 35治療前 10.12±1.19 42.81±4.72 0.26±0.02治療后 7.27±0.81**△ 37.30±4.84**△ 0.23±0.03**△對(duì)照組 34治療前 10.18±1.07▲ 42.57±4.29▲ 0.27±0.03▲治療后 8.73±0.84* 40.15±5.96* 0.26±0.02*

3 討論

正常情況下足細(xì)胞不僅參與維持腎小球毛細(xì)血管袢的結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定性，還與內(nèi)皮細(xì)胞、基底膜細(xì)胞一起維持腎小球?yàn)V過功能的正常運(yùn)行，因此足細(xì)胞成為腎臟疾病攻擊的靶細(xì)胞。近年研究表明［2-3］，足細(xì)胞肥大、足細(xì)胞數(shù)量及密度的減少、細(xì)胞骨架蛋白異常等種種足細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的改變以及其相關(guān)標(biāo)記蛋白的異常表達(dá)，促使足細(xì)胞脫離GBM，使毛細(xì)血管與腎小囊壁層細(xì)胞發(fā)生黏連，加速破壞GBM 的正常結(jié)構(gòu)，引起濾過膜電荷及機(jī)械屏障功能異常，導(dǎo)致蛋白尿的產(chǎn)生。亦有報(bào)道指出［11］，在腎小球疾病中，尿中的足細(xì)胞數(shù)量可直接反應(yīng)腎小球上皮細(xì)胞受損的程度，且足細(xì)胞損傷后不可再生，故足細(xì)胞數(shù)量的缺失，有助于腎小球硬化的發(fā)生、發(fā)展。

PCX 是一種在足細(xì)胞成熟過程中只固定表達(dá)于足細(xì)胞頂端膜區(qū)的特異性標(biāo)記蛋白，當(dāng)腎臟受損、足細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)發(fā)生變化時(shí)，隨尿液排出體外，使尿蛋白含量增加［4］。1998 年 Masanori Hara等［12］率先發(fā)現(xiàn)尿PCX 的表達(dá)與腎臟病理改變及尿蛋白變化有關(guān)，并指出患有腎小球疾病的患者尿中PCX 的表達(dá)高達(dá)92.5%，且其敏感性為88.4%，特異性大于90%。因此，PCX 已成為最具穩(wěn)定性的足細(xì)胞標(biāo)記蛋白。程亮等［13］研究表明，DN 患者尿液中PCX mRNA 的表達(dá)較正常對(duì)照組明顯升高，隨著DN 病情的進(jìn)展進(jìn)一步升高，與腎小球?yàn)V過率成負(fù)相關(guān)，表明PCX 在DN 的發(fā)展中至關(guān)重要，且可預(yù)測DN 的病情進(jìn)展。

Nephrin 是特異地表達(dá)在腎小球裂孔隔膜（slit diaphragm，SD）上的跨膜糖蛋白，是維持SD 結(jié)構(gòu)和功能完整性的關(guān)鍵分子。Nephrin mRNA 的低表達(dá)，影響足細(xì)胞內(nèi)骨架蛋白的重排和相連蛋白功能，破壞足突和GBM 的穩(wěn)定性，產(chǎn)生蛋白尿［14］。其作用機(jī)制［15-16］可能是Nephrin 表達(dá)異常，使磷脂酰肌醇3 激酶-蛋白激酶B 信號(hào)通路中相關(guān)上下游分子蛋白酪氨酸磷酸酶激活，并異常沉積于足細(xì)胞內(nèi)，通過磷酸化介導(dǎo)足細(xì)胞骨架的重構(gòu)，共同改變足細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、功能。由此可見，尿中Nephrin 水平的上調(diào)與足細(xì)胞融合、脫落關(guān)系密切。

Podocin 是存在于SD 上，呈發(fā)卡樣結(jié)構(gòu)，介導(dǎo)SD 與足細(xì)胞骨架相連的標(biāo)記蛋白，與Nephrin 、CD2AP 共同構(gòu)成SD 骨架，維持SD 結(jié)構(gòu)及功能的穩(wěn)定，保持濾過屏障的正常運(yùn)作。當(dāng)Podocin 表達(dá)下調(diào)，SD 的結(jié)構(gòu)及形態(tài)的穩(wěn)定性受損，與其他骨架蛋白的聯(lián)系也遭到破壞，導(dǎo)致足突形態(tài)發(fā)生改變，影響GBM 的通透性［17］，增加尿蛋白水平，損害腎功能。

因此我們檢測尿中Nephrin、Podocin、PCX 的水平，對(duì)了解DN 患者的足細(xì)胞損傷意義重大。本研究結(jié)果顯示，DN 患者的尿Nephrin、Podocin、PCX 水平較正常組明顯升高，經(jīng)糖腎康顆粒干預(yù)治療后，上述標(biāo)記蛋白均顯著下降，且下降幅度優(yōu)于同期對(duì)照組，尿蛋白水平也隨之下調(diào)，提示足細(xì)胞損傷可能是DN 發(fā)生的原因，也是其持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵因素。糖腎康顆粒有效改善DN 氣陰兩虛血瘀證患者的臨床癥狀，降低中醫(yī)證候積分值，減少尿蛋白，能保護(hù)患者的腎功能，延緩病情進(jìn)展，其作用機(jī)制可能與下調(diào)上述標(biāo)記蛋白，減少足細(xì)胞損傷有關(guān)。