潘思宇,黨 喬,劉樹明,2,3，孔令聰,2,3,馬紅霞,2,3

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.動(dòng)物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130118；3.吉林省新獸藥研發(fā)與創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130118)

獸醫(yī)臨床致病菌在抗微生物藥物壓力下不斷進(jìn)化、演變，部分菌株已對(duì)常用藥物呈現(xiàn)多重耐藥性，不但為獸醫(yī)臨床的抗感染治療造成了困難，也對(duì)公共衛(wèi)生安全造成了嚴(yán)重威脅[1]。通常耐藥性致病菌的產(chǎn)生由外排泵、產(chǎn)生滅活酶、攜帶耐藥性質(zhì)粒、可移動(dòng)耐藥原件及靶位置換等介導(dǎo)[2]。

但近年研究發(fā)現(xiàn)，主要致病菌的免疫系統(tǒng)在抗生素壓力下不斷進(jìn)化,也可在一定程度上介導(dǎo)耐藥性的產(chǎn)生。其中，聚類規(guī)則間隔回文重復(fù)序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR-Cas)系統(tǒng)不僅能穩(wěn)定病原微生物的遺傳性，還參與細(xì)菌的生理等功能的調(diào)控，為此受到了國內(nèi)外學(xué)者廣泛關(guān)注。該系統(tǒng)是原核生物基因組中的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，能夠有效抵抗外來基因組分的入侵，維持細(xì)菌基因信息的完整性[3]，是特異性核酸的靶向防御機(jī)制。CRISPR-Cas系統(tǒng)的免疫功能包括3個(gè)不同的機(jī)制階段:適應(yīng)、表達(dá)和干擾[4]。目前，該系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用于基因編輯、細(xì)菌分型等諸多領(lǐng)域。但Gill等首次發(fā)現(xiàn)了CRISPR-Cas系統(tǒng)可靶向外源DNA，有效阻止接合質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化，在一定程度上減少了病原菌間耐藥基因的傳播[5]。從此，CRISPR-Cas系統(tǒng)介導(dǎo)的細(xì)菌耐藥性及毒力研究引起國內(nèi)外研究人員的高度關(guān)注。

1 細(xì)菌CRISPR-Cas系統(tǒng)結(jié)構(gòu)及功能

CRISPR-Cas系統(tǒng)是原核生物基因組中新近發(fā)現(xiàn)的一種免疫防御系統(tǒng)，廣泛存在于細(xì)菌和古菌[6]。該系統(tǒng)由CRISPR位點(diǎn)和Cas基因組成,根據(jù)不同種類Cas蛋白的不同功能，可將該系統(tǒng)分為三類[4]，即Type I-III。其中Ⅰ型是整個(gè)系統(tǒng)中含有最豐富且復(fù)雜的蛋白系統(tǒng)，包含6個(gè)亞型，Cas3蛋白為最具有標(biāo)記性蛋白；II型系統(tǒng)組分相對(duì)單一，啟動(dòng)免疫系統(tǒng)僅需要Cas9蛋白的參與[7]；III類系統(tǒng)包含兩大標(biāo)志基因,需要多個(gè)Cas蛋白共同作用切割目的基因[8]。

Cas蛋白通常攜帶能夠結(jié)合聚合酶、核酸酶及解旋酶的功能域，參與免疫的多個(gè)階段[4,9]。Sternberg等解釋了CRISPR-Cas免疫系統(tǒng)的工作原理，當(dāng)一種細(xì)菌識(shí)別病毒或質(zhì)粒侵入時(shí)，將外源DNA整合到CRISPR單元中作為新的間隔序列，再將CRISPR單元轉(zhuǎn)錄為pre-crRNA，產(chǎn)生的crRNA與入侵病毒或質(zhì)粒結(jié)合并使其沉默[10],進(jìn)而啟動(dòng)免疫系統(tǒng)。在適應(yīng)階段，外源DNA插入CRISPR位點(diǎn)的重復(fù)序列和間隔序列，這些序列被轉(zhuǎn)錄成crRNA。在靶向過程中，成熟的crRNAs與Cas蛋白組裝破壞外源核酸[11]。在表達(dá)階段，反式編碼RNA和pre-crRNA結(jié)合為復(fù)合體與Cas9結(jié)合對(duì)靶向DNA進(jìn)行切割[12]。在干擾階段，III類CRISPR系統(tǒng)中許多蛋白發(fā)揮相應(yīng)的作用，Cas6蛋白參與crRNA的成熟及其前體的初加工，成熟后的crRNA與Cas復(fù)合體相結(jié)合對(duì)DNA進(jìn)行靶向切割[13](表1)。

表1 CRISPR-Cas系統(tǒng)組分及作用機(jī)理

2 CRISPR-Cas系統(tǒng)對(duì)細(xì)菌耐藥性調(diào)控作用

相關(guān)研究表明，完整的CRISPR-Cas系統(tǒng)不僅可有效地抵抗外來入侵物質(zhì)，同時(shí)影響細(xì)菌包膜的完整性。Sampson團(tuán)隊(duì)[14]通過改變脂質(zhì)A介導(dǎo)的外膜蛋白及增加電荷，從而使菌株可對(duì)多黏菌素產(chǎn)生相應(yīng)抗性。Cas9缺陷株的生長(zhǎng)能力在不同濃度抗生素壓力下呈現(xiàn)不同趨勢(shì)，而對(duì)Cas9回補(bǔ)株幾乎沒有影響。國內(nèi)研究人員也證明,缺失Cas3基因的突變鏈球菌的生物被膜形成能力與野生株相比明顯減弱，同時(shí)對(duì)氟敏感性也顯著增加[15]。

對(duì)于許多致病性細(xì)菌，抗生素耐藥性主要是通過獲得外源DNA介導(dǎo)且被編碼整合于可移動(dòng)元件上，包括質(zhì)粒、基因島及整合子等。已有研究報(bào)道，CRISPR-Cas與細(xì)菌耐藥存在一定關(guān)系。McDonald等[16]確定了70多弧菌科的多種不同的CRISPR-Cas系統(tǒng)類型，這些系統(tǒng)主要分布在可移動(dòng)原件中,I-F系統(tǒng)也在整合酶基因島附近。王琳琳[17]在多重耐藥志賀菌中分別檢測(cè)出四環(huán)素類、B-內(nèi)酰胺類、氟喹諾酮類等耐藥基因，這些耐藥基因均存在于CRISPR間隔序列較少的菌體內(nèi)，進(jìn)一步推測(cè)多重耐藥株的CRISPR間隔物缺失可影響菌株獲得多重抗生素耐藥性。而CRISPR-Cas免疫系統(tǒng)的缺失可能會(huì)促進(jìn)細(xì)胞在特定條件下的生存,例如在抗微生物藥物的壓力下抗性基因的獲取等。關(guān)于糞腸球菌CRISPR-Cas系統(tǒng)與耐藥適應(yīng)性的相關(guān)報(bào)道表明，該系統(tǒng)的部分缺失與獲得性耐藥呈正相關(guān)[18-19]。已報(bào)道糞腸球菌含有一些能夠獨(dú)立復(fù)制的質(zhì)粒和致病島，這些元件上均分布了抗性基因與毒性因子，CRISPR-Cas系統(tǒng)以上述元件為靶向位點(diǎn)，并檢測(cè)到糞腸球菌中存在相關(guān)耐藥基因[21]。此外，Palmer[21]發(fā)現(xiàn)構(gòu)成多重耐藥腸球菌的基因組中，25%來自可移動(dòng)元件，且與CRISPR間隔序列高度一致，促進(jìn)質(zhì)粒自身轉(zhuǎn)移進(jìn)一步影響染色體的編碼及Cas位點(diǎn)移動(dòng)和部分堿基突變，從而使腸球菌產(chǎn)生獲得耐藥性，為此強(qiáng)調(diào)CRISPR在腸球菌內(nèi)整合基因組的重要性。對(duì)表皮葡萄球菌的研究發(fā)現(xiàn)，非致病性菌體缺乏CRISPR序列，而在攜帶質(zhì)粒的致病性菌體內(nèi)檢測(cè)到CRISPR序列，能夠有效的阻止接合質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移，在一定程度上減少了耐藥基因在病原菌間的轉(zhuǎn)移[5]。同時(shí)，Eva等[7]在弗朗西斯菌中發(fā)現(xiàn)了存在于II型系統(tǒng)中的一種scaRNA，不同于tracrRNA和crRNA的作用機(jī)理,這種小分子由Cas9介導(dǎo)使RNA相互作用降低蛋白轉(zhuǎn)錄，從而抑制抗原的表達(dá)并降低宿主促炎性反應(yīng)。綜上所述，不同菌種的CRISPR系統(tǒng)均參與了細(xì)菌耐藥性的調(diào)控，為日后細(xì)菌耐藥性的研究提供了重要的理論基礎(chǔ)。

另外，CRISPR系統(tǒng)除了抵御外來物質(zhì)入侵外，還能控制內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄，參與調(diào)解細(xì)菌致病性[22]。CRISPR系統(tǒng)的缺失可明顯導(dǎo)致細(xì)菌致病性的變化。最新研究表明，Cas9的缺失可降低細(xì)胞上皮細(xì)胞粘附，影響數(shù)種調(diào)控毒力的蛋白表達(dá)，而Cas9作為毒力因子的作用機(jī)制尚不明確，推測(cè)Cas9基因與編碼毒力決定因素的基因協(xié)同調(diào)控病原菌的毒力性，同時(shí)抑制毒性決定基因的轉(zhuǎn)錄[12]。CRISPR系統(tǒng)不僅能增強(qiáng)生物膜形成能力，同時(shí)Cas9還參與了宿主先天免疫的逃避通路并有效抑制抗原的表達(dá)，這種天然機(jī)制也使細(xì)菌逃避多種宿主受體的免疫機(jī)制而提高自身毒力[14]。此外，值得注意的是缺乏CRISPR序列的菌株擁有更多的原噬菌體，CRISPR靶標(biāo)的分析表明，間隔序列與其原噬菌體靶標(biāo)之間存在相互排斥的關(guān)系，干擾毒力因子在病原菌間轉(zhuǎn)移[23]，這說明CRISPR-Cas可拮抗原噬菌體的插入，從而影響病原體的進(jìn)化，但其二者相互影響及作用機(jī)制仍需進(jìn)一步開展研究。

3 展望

CRISPR-Cas系統(tǒng)作為細(xì)菌常在的天然免疫防御系統(tǒng)，一方面，CRISPR免疫系統(tǒng)阻止抗生素抗性基因和毒力基因向病原菌轉(zhuǎn)移，從而降低病原菌的進(jìn)化能力;另一方面，該系統(tǒng)能有效對(duì)抗入侵的外源性遺傳物質(zhì)，其獨(dú)特的功能特性不僅調(diào)控微生物耐藥適應(yīng)性并介導(dǎo)耐藥基因與毒力基因的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)室針對(duì)革蘭陽性和陰性多重耐藥致病菌，如腸球菌、巴氏桿菌及肺炎克雷伯菌等進(jìn)行CRISPR-Cas系統(tǒng)的檢測(cè),結(jié)果與已報(bào)道結(jié)論相似。CRISPR-Cas缺失株與野生株相比，Cas基因的缺失不僅影響細(xì)菌的耐藥性同時(shí)潛在的使部分耐藥基因發(fā)生表達(dá)沉默，部分功能基因表達(dá)量發(fā)生顯著上調(diào)，間接影響細(xì)菌在抗生素壓力下的生長(zhǎng)速率，但CRISPR-Cas是如何介導(dǎo)致病菌耐藥性及其相關(guān)機(jī)制仍需要我們進(jìn)一步展開研究。不同生物體內(nèi)的CRISPR免疫通路與執(zhí)行相應(yīng)功能蛋白有所不同，Cas 蛋白家族在實(shí)現(xiàn)精確整合CRISPR序列的功能上發(fā)揮著重要作用，通過與向?qū)NA和篩選標(biāo)記結(jié)合，可快速篩選出全基因組范圍內(nèi)潛在的靶點(diǎn)基因，以期為分子生物領(lǐng)域研究提供重要的基因工具。