張英楠，徐 晶，欒維民，楊樹寶1,

(1.吉林醫(yī)藥學院，吉林 吉林 132013;2.長春科技學院生命科學學院，吉林 長春 130600；3.吉林農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，吉林 長春 130118)

目前，家禽的呼吸道疾病如禽流感和新城疫等給家禽養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失[1-2]，而肺臟又是家禽許多病毒性和細菌性疾病的主要靶器官，病原體會通過肺呼吸系統(tǒng)黏膜表面進入宿主，然后進一步散布到其他器官中[3]。因此，動物的健康在很大程度上取決于是否能夠成功控制病原在肺臟組織尤其是肺臟支氣管黏膜表面的入侵和復制。要研究這些疾病的發(fā)病機制并采取有效的防治措施，必需要對肺臟相關(guān)免疫系統(tǒng)的組織結(jié)構(gòu)和功能有清楚的認識，但是目前還缺乏此方面的研究。

Bienenstock J等(1973年)首次發(fā)現(xiàn)雞肺臟中初級支氣管中的淋巴小結(jié)與腸道集合淋巴結(jié)以及腸相關(guān)淋巴樣組織有很大的相似性，因此，這些結(jié)構(gòu)被指定為是支氣管相關(guān)淋巴組織(BALT)[4]。與其他動物相比，家禽體內(nèi)的BALT分布更為廣泛。

孵化期間由蛋殼氣孔過濾后的氣體是禽類的氧氣供應源。出殼之后，雛禽開始接觸外界空氣，并逐漸適應外界環(huán)境，同時其呼吸道結(jié)構(gòu)和功能也得到發(fā)育和建立[5]。出殼初期為了適應外界環(huán)境，雞的肺臟也經(jīng)歷著相應的快速變化。伴隨著肺臟結(jié)構(gòu)和功能的一系列轉(zhuǎn)變，BALT也應發(fā)生著相應的變化。因此，本試驗采用免疫組織化學方法研究從雞胚到出殼后的不同生長發(fā)育階段，肺臟中T、B淋巴細胞的發(fā)育情況以及定位分布變化，從而反映發(fā)育時期雞肺臟的免疫狀態(tài)變化，為進一步研究家禽肺臟的免疫機制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 200枚海蘭白雞種蛋，購自長春凈月潭旅游開發(fā)區(qū)銀河養(yǎng)殖場，種蛋進行常規(guī)孵化，雛雞進行常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑及器材 冰凍切片用OCT組織包埋液：美國Sakura公司產(chǎn)品；小鼠抗雞CD3和Bu-1單克隆抗體：美國Southern Biotechnology公司產(chǎn)品；Ultra Sensitive SP超敏試劑盒kit 9901：福州邁新公司產(chǎn)品。依愛EIF/C.DME3456 孵化機/出雛機：廣東依愛孵化機廠生產(chǎn)；Leica CM1850 冰凍切片機：德國Leica公司生產(chǎn)；Olympus CX41 顯微鏡：日本Olympus公司生產(chǎn)；Pixera pro150ES圖像采集器：美國Pixera公司生產(chǎn)。

1.3 試驗設計 200只試驗用海蘭白雞種蛋進行孵化，雞出殼后置于動物室中常規(guī)飼養(yǎng)。分別選擇未經(jīng)疫苗免疫的18、20日齡雞胚，1、4、7、14、21、35、56日齡和90日齡的雛雞，每個時期取3只雞胚或雛雞的肺臟組織。將肺臟組織制成冰凍切片，片厚5 μm，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 免疫組織化學染色程序 每張切片滴加30 mL/L 過氧化氫，室溫下孵育10 min；PBS洗3次，每次3 min；除去PBS，每張切片分別滴加小鼠抗雞CD3和Bu-1單克隆抗體工作液，37 ℃孵育1 h；PBS洗3次，每次3 min；每張切片滴加聚合物增強劑(試劑A)，室溫下孵育20 min；PBS洗3次，每次3 min；每張切片加酶標抗鼠/兔聚合物(試劑B)，室溫下孵育30 min；PBS洗3次，每次3 min；DAB顯色；蘇木精復染；自來水沖洗返藍；梯度酒精脫水；二甲苯透明；中性樹脂封片；照相。

1.5 圖像分析及統(tǒng)計學處理 應用Image-pro plus 6.0圖像分析軟件測定肺臟中單位視野內(nèi)陽性細胞面積。同一日齡選取3個樣本，每個樣本制作3張連續(xù)切片，每張切片于10倍物鏡下隨機選取3個視野，取平均值。應用SPSS18.0軟件對不同日齡的同一陽性細胞進行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 胚胎期及出殼后初期T、B淋巴細胞的分布規(guī)律 胚胎18日齡時，CD3+T淋巴細胞出現(xiàn)在肺臟實質(zhì)中(中插彩版圖1A)。胚胎20日齡時，CD3+T淋巴細胞的數(shù)量和分布與胚胎18日齡比較無明顯變化。1日齡時，CD3+T淋巴細胞繼續(xù)增多，但著色較弱(中插彩版圖1B)。另外，Bu-1+B細胞也首次出現(xiàn)，主要分布于大血管周圍(中插彩版圖1C)。

圖1 胚胎期和出殼后初期肺臟中T、B淋巴細胞的動態(tài)變化 (250×)Fig.1 Development of T and B lymphocytes in lung at embryonic stage and early post-hatch period (250×)A：胚胎18日齡，箭頭：肺臟實質(zhì)中的CD3+T細胞；B：1日齡，箭頭：小葉間結(jié)締組織中的CD3+T細胞；C：1日齡，箭頭：Bu-1+B細胞出現(xiàn)在大血管周圍；D：4日齡，箭頭：BALT中的CD3+T細胞；E：4日齡，箭頭：BALT中的Bu-1+B細胞；F：7日齡，箭頭：BALT中的CD3+T細胞；G：7日齡，箭頭：BALT中的Bu-1+B細胞；H：7日齡，箭頭：分布于氣體交換區(qū)的實質(zhì)中淋巴細胞； I：14日齡，箭頭：Bu-1+B細胞位于BALT的外周A：18-day-old embryonic chicken,arrow:CD3+T cells in lung parenchyma；B:1-day-old,arrow:CD3+T cells in interlobular connective tissue;C:1-day-old,arrow:Bu-1+ B cells appear around large blood vessels;D:4-day-old,arrow:CD3+T cells in BALT；E:4-day-old,arrow:Bu-1+ B cells in BALT;F:7-day-old,arrow:CD3+T cells in BALT;G:7-day-old,arrow:Bu-1+ B cells in BALT;H:7-day-old,arrow:lymphocytes distributed in the parenchyma of gas exchange region;I:14-day-old,arrow:Bu-1+B cells in the periphery of BALT

4日齡時，在初級支氣管與次級支氣管交匯處有淋巴細胞的聚集物，即形成了明顯的支氣管相關(guān)性淋巴組織(BALT)。從此時起，肺臟內(nèi)的淋巴細胞就以兩種形式存在，一是集合性淋巴組織—BALT，另外一種是散布在肺小葉中的彌散性淋巴組織。在BALT中CD3+T淋巴細胞的數(shù)量明顯多于Bu-1+B淋巴細胞(中插彩版圖1D、1E)。

7日齡時，BALT更為發(fā)達，T、B淋巴細胞都明顯增加，CD3+T淋巴細胞仍明顯多于Bu-1+B淋巴細胞(圖2)，而且CD3+T淋巴細胞占據(jù)了BALT的中央?yún)^(qū)域(中插彩版圖1F)，而Bu-1+B淋巴細胞主要環(huán)繞在外周(中插彩版圖1G)。在肺小葉中，T淋巴細胞和B淋巴細胞都主要分布于氣體交換區(qū)的實質(zhì)中(中插彩版圖1H)。

14日齡時，三級支氣管肺實質(zhì)中CD3+T細胞較多，而Bu-1+B細胞也較多地分布在三級支氣管肺實質(zhì)中，但比CD3+T細胞少。在BALT中，CD3+T細胞的數(shù)量仍多于Bu-1+B細胞，而且CD3+T細胞占據(jù)中央，而Bu-1+B細胞位于外周(中插彩版圖1I)。

2.2 21～90日齡雞T、B 淋巴細胞的分布規(guī)律 21日齡時，BALT特別發(fā)達，其中淋巴細胞分布更為密集，數(shù)量都顯著增加，CD3+T細胞和Bu-1+B細胞數(shù)量相當(圖2)。肺小葉中，CD3+T細胞較多地分布在呼吸毛細管周圍即氣體交換區(qū)，局部也形成小的淋巴聚集物(中插彩版圖3A)，而Bu-1+B細胞則較少，無聚集物形成(中插彩版圖3B)。

圖2 BALT中CD3+T和Bu-1+B細胞的數(shù)量變化Fig.2 The changes of quantity of CD3+T and Bu-1+B cells in BALT

圖3 21～90日齡肺臟中T、B淋巴細胞的動態(tài)變化 (250×)Fig.3 Development of T and B lymphocytes in lung at 21～90 day-old (250×)A：21日齡，箭頭：氣體交換區(qū)中小的淋巴聚集體；B：21日齡，箭頭：Bu-1+B細胞散布在肺臟實質(zhì)中；C：35日齡，箭頭：BALT中的CD3+T細胞；D：35日齡，箭頭：BALT中的Bu-1+B細胞；E：56日齡，箭頭：生發(fā)中心；F：56日齡，箭頭：僅少量CD3+T細胞分布于濾泡間區(qū)域；G：56日齡，箭頭：CD3+T細胞散布于整個肺小葉中；H：90日齡，箭頭：房間隔上形成聚集體；I：90日齡，箭頭：氣體交換區(qū)中的淋巴聚集體A:21-day-old,arrow:small lymphoid aggregates in gas exchange region;B:21-day-old,arrow:Bu-1+B cells scattered in the lung parenchyma;C:35-day-old,arrow:CD3+T cells in BALT;D:35-day-old,arrow:Bu-1+ B cells in BALT;E:56-day-old,arrow:germinal center;F:56-day-old,arrow:less CD3+T cells in the interfollicular area;G:56-day-old,arrow:CD3+T cells scattered in hole pulmonary lobule;H:90-day-old,arrow:lymphoid aggregates in interatrial septa;I:90-day-old,arrow:lymphoid aggregates in gas exchange region

35日齡時，無論是BALT中，還是肺小葉中淋巴細胞的數(shù)量都持續(xù)增加。BALT中Bu-1+B細胞已經(jīng)超過CD3+T細胞(中插彩版圖3C、3D)。

56日齡時，BALT中形成主要由B淋巴細胞構(gòu)成的淋巴小結(jié)，其中的生發(fā)中心周緣界限清楚(中插彩版圖3E)。T淋巴細胞分布于淋巴小結(jié)周圍的濾泡間區(qū)域，數(shù)量顯著少于B淋巴細胞(中插彩版圖3F)。肺小葉中，CD3+T細胞在三級支氣管氣道內(nèi)壁中、房間隔中、氣體交換區(qū)和小葉間結(jié)締組織中都都有分布，散布在整個肺臟中(中插彩版圖3G)。

90日齡與56日齡的發(fā)育狀況相似，說明56日齡時已基本發(fā)育成熟。此時，房間隔上淋巴細胞都有較多分布，甚至形成聚集物(中插彩版圖3H)。氣體交換區(qū)的呼吸性毛細管和毛細血管周圍，有大量淋巴細胞存在，呼吸性毛細管內(nèi)壁為單層扁平上皮(中插彩版圖3I)。

3 討論

在禽類養(yǎng)殖中，呼吸系統(tǒng)的疾病是影響?zhàn)B殖的疾病之一，給養(yǎng)殖業(yè)也帶來了很大的經(jīng)濟損失[6]，而且，有幾種重要的禽類致病菌會通過肺臟表面進入宿主隨后傳播到體內(nèi)的靶器官，如禽流感和新城疫等。因此，動物的健康要取決于對致病菌入侵和在支氣管相關(guān)黏膜表面及肺臟組織中的復制的有效控制，這也就是說疫苗接種應該能夠有效誘導這些部位產(chǎn)生免疫應答，從而有助于阻止致病菌的入侵，實現(xiàn)這個目標的方法之一就是對黏膜表面進行疫苗接種，這個技術(shù)在禽類養(yǎng)殖業(yè)中已經(jīng)廣泛應用，如滴鼻點眼和噴霧等接種方法[7-8]。為了研制適合雞使用且可以提供有效免疫保護的黏膜新型疫苗，就需要對雞肺臟相關(guān)免疫系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能的有綜合的了解。但目前還缺乏有關(guān)雞肺臟相關(guān)免疫系統(tǒng)的知識。

對于環(huán)境刺激是否是BALT發(fā)育的根源這個問題在很大程度上還是未知。早期對于SPF雞的研究描述了在哈氏腺和支氣管中出現(xiàn)淋巴細胞浸潤，但是對于肺臟還沒有研究。雖然在關(guān)于SPF雞和一般雞生發(fā)中心的發(fā)育方面觀察到有微小的差別，但兩者BALT的發(fā)育具有類似的時間特征[9]。除此之外，致病性微生物的感染也會顯著的增加BALT生發(fā)中心的數(shù)量[10]。對于這種反應是源于局部抗原特異性T、B淋巴細胞的介導還是淋巴細胞的遷移還需要進一步的證明。本試驗通過免疫組織化學染色方法發(fā)現(xiàn)，4日齡時在初級支氣管與次級支氣管交匯處有淋巴細胞的聚集物，即形成了明顯的支氣管相關(guān)性淋巴組織(BALT)。從此時起，肺臟內(nèi)的淋巴細胞就以2種形式存在，一是集合性淋巴組織—BALT，另一種就是散布在肺小葉中的彌散性淋巴組織。這與之前的研究相一致：BALT在出生時并不存在，出殼后第4天才開始出現(xiàn)，第4周開始出現(xiàn)分離的T、B細胞區(qū)，到第12周可觀察到明確的T、B細胞區(qū)[11]。但BALT的進一步發(fā)育需依賴于抗原，這點與鼻相關(guān)淋巴組織(NALT)不同。在形態(tài)學上，BALT與NALT不同，淋巴細胞的排列形態(tài)和數(shù)量具有種屬和個體差異。典型的BALT為濾泡樣的淋巴細胞聚集，中心為由小淋巴細胞包裹的生發(fā)中心。淋巴濾泡主要由B細胞組成，淋巴濾泡間和副濾泡區(qū)主要由T細胞組成。在黏膜上皮下的部分稱上皮下區(qū)或圓頂區(qū)，夾雜分布有T細胞和B細胞，其中還分布有高內(nèi)皮靜脈(HEV)，其特點是無纖毛但有膜性突出[2]。此后隨著日齡增長，BALT不斷發(fā)育，其中的各種免疫細胞的數(shù)量也在不斷發(fā)生變化，56日齡時，BALT中形成主要由B淋巴細胞構(gòu)成的淋巴小結(jié)，其中的生發(fā)中心周緣界限清楚，有形態(tài)較大著色較深的漿細胞存在，此時各種免疫細胞的分布和數(shù)量也相對穩(wěn)定，因此BALT在56日齡時基本發(fā)育成熟，具有了參與肺臟局部黏膜免疫發(fā)達的結(jié)構(gòu)基礎。