靳雙星，張桂枝，王 晶，任曉麗，張愛國

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046；2.鄭州市禽病診斷與防控工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450046；3.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，河南 鄭州 450046)

在高密度集約化肉雞生產(chǎn)中，疫苗免疫對(duì)控制和消滅傳染病發(fā)揮著極其重要的作用。但疫苗接種作為一種特殊的應(yīng)激因子誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)激，破壞機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，改變新陳代謝，降低生產(chǎn)性能，延長飼養(yǎng)周期，導(dǎo)致機(jī)體免疫力和抗病力的下降，給肉雞生產(chǎn)帶來的危害也愈來愈嚴(yán)重[1]。尋找安全有效的抗應(yīng)激添加劑來預(yù)防和緩解免疫應(yīng)激已成科技人員研究的熱點(diǎn)。本試驗(yàn)通過給AA肉雞注射細(xì)菌脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)建立經(jīng)典免疫應(yīng)激模型，評(píng)估發(fā)酵中藥對(duì)LPS免疫應(yīng)激肉雞的血液常規(guī)和血清生化指標(biāo)的影響，以期為發(fā)酵中藥應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 脂多糖(LPS)，購自Sigma公司。雞新城疫疫苗(LaSota株)，購自哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司；復(fù)方中藥，購自鄭州鶴眾堂醫(yī)藥有限公司，由黃芪、白術(shù)、黨參、茯苓、刺五加、酸棗仁、甘草按一定比例配制而成。中藥發(fā)酵參考張桂枝等[2]的方法。

1.2 主要儀器 全自動(dòng)生化分析儀(型號(hào)：AU2700，Beekman Coulter Olympus公司產(chǎn)品)；全自動(dòng)血液分析儀 (型號(hào)：XE2100，Sysmex公司產(chǎn)品)。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物與設(shè)計(jì) 選用7日齡健康A(chǔ)A肉雞200只隨機(jī)分為5組：對(duì)照組(基礎(chǔ)日糧)和4個(gè)處理組，即LPS應(yīng)激組 (基礎(chǔ)日糧+LPS)、1%未發(fā)酵中藥組(基礎(chǔ)日糧+LPS+1%未發(fā)酵中藥)、0.5%發(fā)酵中藥組(基礎(chǔ)日糧+LPS+0.5%發(fā)酵中藥)、1%發(fā)酵中藥組(基礎(chǔ)日糧+LPS+1%發(fā)酵中藥)，每組8個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5只雞。按常規(guī)方式飼養(yǎng)，自由采食和飲水，7日齡進(jìn)行2倍量新城疫滴鼻免疫接種，21日齡進(jìn)行3倍量新城疫飲水免疫接種。飼養(yǎng)至15、17、19、21、23、25、27日齡時(shí)分別按照100、200、200、250、250、400、400 μg/(kg·bw)的劑量對(duì)4個(gè)處理組腹腔注射LPS，對(duì)照組注射等量生理鹽水。

1.4 指標(biāo)測(cè)定 最后一次注射LPS后24 h，每組分別采集全血和血清16份，用全自動(dòng)血液分析儀測(cè)定血液常規(guī)指標(biāo)，用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清生化指標(biāo)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 各指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，多重比較采用LSD檢驗(yàn)，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)酵中藥對(duì)免疫應(yīng)激肉雞血液常規(guī)指標(biāo)的影響 結(jié)果見表1。從表1可看出，LPS應(yīng)激組白細(xì)胞數(shù)目顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。3個(gè)中藥組與LPS應(yīng)激組相比，白細(xì)胞數(shù)目均有所下降，尤其是2個(gè)發(fā)酵中藥組白細(xì)胞數(shù)目顯著低于LPS應(yīng)激組(P<0.05)，與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05)；其他指標(biāo)各組之間無顯著差異(P>0.05)。

表1 肉雞的血常規(guī)指標(biāo)Table 1 Blood routine indexes of broilers (n=16)

2.2 發(fā)酵中藥對(duì)免疫應(yīng)激肉雞血清生化指標(biāo)的影響 結(jié)果見表2。從表2可以看出，LPS應(yīng)激組與對(duì)照組相比肉雞血清中總蛋白(TP)、球蛋白(GLO)、尿素氮(BUN)和總膽固醇含量明顯上升(P<0.05),谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、肌酸激酶(CK)等血清酶活性明顯升高(P<0.05)。3個(gè)中藥組與LPS應(yīng)激組相比總蛋白、白蛋白和球蛋白含量均無顯著差異(P>0.05)，但球蛋白含量有一定下降，白蛋白含量有一定提高(P>0.05)。3個(gè)中藥組尿素氮和總膽固醇含量均有所降低，可以使LPS應(yīng)激引起的尿素氮和總膽固醇含量上升幅度降低到與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05)。3個(gè)中藥組總蛋白和白蛋白含量均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。3個(gè)中藥組與LPS應(yīng)激組相比，ALT、AST、CK、乳酸脫氫酶(LDH)等血清酶活性有不同程度下降，其中1%發(fā)酵中藥組的ALT、2組發(fā)酵中藥組的AST和0.5%發(fā)酵中藥組的CK血清酶活性顯著低于LPS應(yīng)激組(P<0.05)。

表2 肉雞的血液生化指標(biāo)Table 2 Blood biochemical indexes of broilers (n=16)

3 討論

3.1 發(fā)酵中藥對(duì)免疫應(yīng)激肉雞血液常規(guī)指標(biāo)的影響 LPS是一種十分有效的應(yīng)激源，許多研究者通過給動(dòng)物腹腔或靜脈注射一定劑量的 LPS 來建立動(dòng)物模型，是建立免疫應(yīng)激模型最經(jīng)典的方式之一[3-6]。LPS是革蘭陰性細(xì)菌外璧層中特有的一種化學(xué)成分，可導(dǎo)致血常規(guī)指標(biāo)在短時(shí)間內(nèi)呈現(xiàn)異常變化[7]。白細(xì)胞為機(jī)體主要的免疫細(xì)胞，通過游走、趨化和吞噬消除進(jìn)入機(jī)體的病原微生物和壞死組織，在發(fā)生細(xì)菌感染或炎癥時(shí)，白細(xì)胞數(shù)目通常增加。本試驗(yàn)中LPS應(yīng)激組白細(xì)胞含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，說明LPS誘導(dǎo)肉雞產(chǎn)生了類似于細(xì)菌感染的炎性反應(yīng)，使白細(xì)胞數(shù)目顯著升高。3個(gè) 中藥組與LPS應(yīng)激組相比，白細(xì)胞數(shù)目均下降，2個(gè)發(fā)酵中藥組白細(xì)胞數(shù)目顯著低于LPS應(yīng)激組(P<0.05)，可以使LPS應(yīng)激引起的白細(xì)胞數(shù)目上升幅度降低到與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05)。說明該發(fā)酵中藥組方在一定程度上能夠降低LPS應(yīng)激引起的炎癥反應(yīng)。

3.2 發(fā)酵中藥對(duì)免疫應(yīng)激肉雞血清生化指標(biāo)的影響 血清球蛋白是多種蛋白質(zhì)的混合物，包括具有防御作用且含量較多的免疫球蛋白、補(bǔ)體和多種糖蛋白。血清白蛋白由肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞合成，在維持血漿膠體滲透壓和物質(zhì)運(yùn)輸過程中起重要作用。閆偉[8]采用LPS刺激建立鵝免疫應(yīng)激模型，發(fā)現(xiàn)應(yīng)激組血清總蛋白、球蛋白含量顯著升高。鄭肖川[9]研究報(bào)道，LPS刺激顯著提高了血清總蛋白和球蛋白的水平，降低了血清白蛋白的水平；日糧添加冬凌草甲素顯著降低了總蛋白和球蛋白的水平。本試驗(yàn)LPS應(yīng)激組與對(duì)照組相比肉雞血液中的總蛋白和球蛋白含量顯著升高(P<0.05)；1%發(fā)酵中藥組可以使LPS應(yīng)激引起的球蛋白含量上升幅度降低到與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05)；并且中藥組可顯著提高血清中白蛋白的水平。說明復(fù)方中藥可以減輕LPS引起的免疫應(yīng)激而且可以促進(jìn)肝臟合成白蛋白。

畜禽在免疫應(yīng)激狀態(tài)下，體內(nèi)的糖皮質(zhì)激素分泌增加，糖、脂肪和蛋白質(zhì)的分解代謝加強(qiáng)。尿素氮、總膽固醇、甘油三酯是衡量機(jī)體三大物質(zhì)代謝的重要指標(biāo)。雖然家禽尿素氮含量較低，但尿素氮濃度在一定范圍內(nèi)可以反映蛋白質(zhì)的代謝情況，濃度升高時(shí)，氨基酸分解增加，相應(yīng)蛋白質(zhì)沉積減少；如果超過一定范圍，則說明腎臟功能異常[10]。免疫應(yīng)激對(duì)脂類代謝的影響主要是通過細(xì)胞因子對(duì)關(guān)鍵酶活性的調(diào)節(jié)來實(shí)現(xiàn)的，細(xì)胞因子可降低甘油三酯的清除率，促進(jìn)肝臟脂肪酸合成以及非必需脂肪酸重新酯化，導(dǎo)致血脂升高。宋志學(xué)等[11]研究表明，LPS應(yīng)激可使血液中的尿素氮、總膽固醇、甘油三酯和葡萄糖均顯著升高。本試驗(yàn)LPS應(yīng)激組與對(duì)照組相比尿素氮、總膽固醇和甘油三酯含量均有所升高，尿素氮和總膽固醇含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；飼料中添加復(fù)方中藥后可以使LPS應(yīng)激引起的尿素氮和總膽固醇含量上升幅度降低到與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05)。說明復(fù)方中藥可以緩解LPS應(yīng)激對(duì)脂肪和蛋白質(zhì)代謝的影響。

血清中的酶具有高度的特異性，其活性變化可以反映機(jī)體器官的代謝水平和功能狀態(tài)，當(dāng)機(jī)體器官代謝旺盛或受到損傷時(shí)，血清酶活性會(huì)發(fā)生顯著的變化[12]。谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶在肝細(xì)胞中存在較多，當(dāng)肝細(xì)胞受到損傷時(shí)，肝細(xì)胞內(nèi)的酶就會(huì)進(jìn)入血液中，導(dǎo)致血清酶的活性升高[13]。肌酸激酶主要存在于骨骼肌、心肌和腦組織中，骨骼肌及心肌活動(dòng)增加或受損會(huì)引起血清肌酸激酶活性升高。本試驗(yàn)結(jié)果表明，LPS免疫應(yīng)激使血清中ALT、AST、CK等血清酶活性顯著升高(P<0.05)；添加中藥能使谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶和肌酸激酶的血清酶活性顯著下降(P<0.05)，說明發(fā)酵中藥對(duì)肝臟細(xì)胞具有潛在的保護(hù)作用，也可能與中藥含有刺五加、酸棗仁具有鎮(zhèn)靜安神，減少肉雞活動(dòng)有關(guān)。

許多研究表明[14-16]，四君子湯在調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動(dòng)，促進(jìn)消化吸收和免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)代謝等方面具有重要作用。本試驗(yàn)的中藥組方是在四君子湯的基礎(chǔ)上加減黃芪、酸棗仁、刺五加而成，具有益氣健脾、鎮(zhèn)靜安神等功效。本試驗(yàn)結(jié)果表明，添加中藥能夠顯著降低肉雞炎癥反應(yīng)，調(diào)控蛋白質(zhì)和脂肪代謝，減輕免疫應(yīng)激造成的臟器損傷。分析原因可能是中藥組方中四君子湯成分可以調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，降低炎癥介質(zhì)在體內(nèi)的殘留，改善過度免疫所造成的病理性損傷有關(guān)[17]；黃芪對(duì)細(xì)胞免疫、體液免疫及非特異性免疫均具有增強(qiáng)作用[18]，因此，該發(fā)酵中藥具有降低炎癥反應(yīng)效果；四君子湯還可以增加食欲，提高采食量，增加營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收，使血液總蛋白和白蛋白水平升高；同時(shí)，中藥組方中的刺五加、酸棗仁具有鎮(zhèn)靜安神作用，使肉雞在免疫應(yīng)激條件下保持安靜，較少活動(dòng)，降低了免疫應(yīng)激反應(yīng)和能量消耗；中藥方劑中黃芪具有抗氧化和穩(wěn)定肝細(xì)胞膜的作用，甘草具有減輕肝細(xì)胞損害程度，促進(jìn)肝細(xì)胞再生，因此該中藥方劑具有保護(hù)肝臟的作用，促進(jìn)肝臟轉(zhuǎn)化合成了較多白蛋白，參與組織修復(fù)，調(diào)節(jié)血清酶活性下降。