楊孟然，邢維佳，趙丹，王偉東，王彥杰，晏磊

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319）

在世界各個(gè)生境之中，湖泊是各生境中重要的存在，不同湖泊的沉積物之中含有大量的微生物，微生物是湖泊中重要的生態(tài)資源，參與多種物質(zhì)循環(huán)[1]。因此，深刻解析湖泊沉積物中的微生物群落組成和多樣性的變化。對(duì)正確認(rèn)識(shí)湖泊沉積物和它參與的物質(zhì)交換與營(yíng)養(yǎng)循環(huán)具有重要意義。細(xì)菌多樣性也能在一定程度上反應(yīng)出細(xì)菌所處環(huán)境的變化。

沉積物中的細(xì)菌多樣性一直是不同的水體科學(xué)研究熱點(diǎn)。豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與特殊環(huán)境會(huì)使得沉積物成為水體細(xì)菌的理想棲息地。細(xì)菌在以鐵、硫?yàn)橹饕氐牡厍蚧瘜W(xué)循環(huán)中有著重要作用[2]。五大連池的藥泉湖是一個(gè)礦泉湖，其水質(zhì)與其他湖泊不同，是比較少有的湖泊水體類型。此外，藥泉湖內(nèi)的泉水可以引流到不同地域，為人所用。藥泉湖氣候多變，環(huán)境條件較差，但是也正是這種氣候成就了藥泉湖的特殊環(huán)境。藥泉湖中含有大量的沉積物，寒冷的冬季寒冷風(fēng)不停。藥泉湖地處高緯度的地區(qū)，它的氣候又受到來自大興安嶺等地寒溫帶的氣候與松嫩平原等地半干燥的氣候影響。藥泉湖常年的平均溫度－0.4 ℃，氣溫最低的時(shí)間在一月份左右。平常年平均的降雨量是476.3 mm 左右，大多數(shù)集中于6 到8 月。在一年最寒冷的時(shí)候，藥泉湖地面的凍土深度可達(dá)2.47 m。因此，為了探究特殊環(huán)境下的細(xì)菌多樣性，我們選擇藥泉湖作為研究地點(diǎn)[3]。

以五大連池藥泉湖的沉積物混合的樣品中的細(xì)菌為研究目標(biāo)，通過Hiseq 高通量測(cè)序技術(shù)來分析五大連池火山群內(nèi)藥泉湖沉積物細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育多樣性并結(jié)合相應(yīng)沉積物混合樣品的代謝途徑，推測(cè)其功能應(yīng)用。觀察在藥泉湖這種特殊環(huán)境下細(xì)菌的多樣性。

1 材料與方法

1.1 采樣材料

采集位于五大連池藥泉湖表層沉積物樣品（湖泊沉積物界面以下5 cm 左右）。采用柱狀采泥器在藥泉湖的3 個(gè)不同位置分別采集樣品。樣品采集完成，裝入滅菌的樣品瓶?jī)?nèi)，低溫避光帶回研究。

1.1 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 沉積物細(xì)菌總DNA 的提取與純化

利用Biomed DNA 的提取試劑盒對(duì)藥泉湖沉積物樣品進(jìn)行DNA 提取，并使用Axygen 的純化試劑盒對(duì)DNA 進(jìn)行純化。

1.2.2 細(xì)菌16S rDNA 的PCR 擴(kuò)增

采用細(xì)菌16S rDNA 的通用的引物27F 和1492R，反應(yīng)體系50 μL。PCR 產(chǎn)物利用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。反應(yīng)條件：94 ℃變性5 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min 30 個(gè)循環(huán)。

1.2.3 總DNA 質(zhì)量檢測(cè)

DNA 純度和濃度的測(cè)定：使用Nanodorp2000 測(cè)定所提取DNA 溶液的260 nm 與280 nm 比值，如果260 nm 與280 nm 比值在1.8 到2.0 之間說明DNA完整，同時(shí)可測(cè)出DNA 濃度。可以利用瓊脂糖凝膠電泳觀察DNA 條帶的亮度去判斷DNA 降解的情況和蛋白質(zhì)及其他雜質(zhì)的污染狀況。

1.2.4 物種注釋及分類學(xué)分析方法

（1）物種注釋：置信度的閾值是0.8。

（2）序列系統(tǒng)分析：利用PyNAST 軟件中的Neighbor-Joining 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[4]。

1.2.5 Alpha 多樣性分析平臺(tái)利用Alpha 多樣性分析手段來分析樣品內(nèi)微生物群落多樣性的分析方法，通過Alpha 多樣性分析就可以充分了解藥泉湖樣品的微生物群落豐富度和多樣性，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)與稀釋曲線分析指數(shù)進(jìn)行評(píng)估。

設(shè)定相似性為97%的序列聚類成OUT，97%稀釋性曲線用來說明藥泉湖樣品的測(cè)序數(shù)據(jù)量合理性，并反映細(xì)菌的物種的豐富度。曲線漸漸趨向平緩，可以證明測(cè)序數(shù)量合理，等級(jí)豐度曲線可解釋樣品所含物種的豐富度與均勻度[5]。

1.2.6 Beta 多樣性分析

利用Beta 多樣性分析手段沿環(huán)境梯度分析藥泉湖樣品群落之間物種組成的差異性。利用Qiime 平臺(tái)和Mothur 平臺(tái)等平臺(tái)軟件對(duì)樣品進(jìn)行分析[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 沉積物中細(xì)菌Alpha 多樣性

普遍的Alpha 多樣性指數(shù)分析主要有Chao1、Shannon、Observed Species、Simpson 等。通過Alpha 多樣性分析可以反映藥泉湖樣品內(nèi)的細(xì)菌群落的多樣性和豐富度。藥泉湖樣品Shannon 指數(shù)為6.21，Chao1 指數(shù)為1 369，藥泉湖樣品中細(xì)菌群落多樣性較高，它的群落物種的豐富度也處于較高水平[7]。通過稀釋曲線圖可以看到樣品中細(xì)菌16S rDNA V3+V4 區(qū)基因上達(dá)到平和，這足以說明藥泉湖各個(gè)樣品中全部序列完全獲得火山堰塞湖表層沉積物樣品中的細(xì)菌，說明實(shí)驗(yàn)測(cè)序量的合理性。

2.2 沉積物中細(xì)菌群落組成分析

細(xì)菌16SrDNA V3+V4 區(qū)測(cè)序結(jié)果顯示，藥泉湖表層沉積物主要菌門為變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、綠菌門（Chlorobi）、消化螺旋菌門（Nitrospirae）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、浮霉菌門（Planctomycetes）等。其中，在藥泉湖中占據(jù)優(yōu)勢(shì)的菌門為變形菌門（38.21%）和放線菌門（27.36%），其中豐度大于1%的菌門有擬桿菌門（12.82%），芽單胞菌門（4.16%），疣微菌門（3.10%）和綠菌門（2.24%）。在屬的水平上，統(tǒng)計(jì)了大于1%豐度的菌屬，藥泉湖內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌屬為鞘氨醇單胞菌屬，嗜甲基菌屬，芽單胞菌屬，慢生根瘤菌屬。其中，鞘脂桿菌屬為T01 獨(dú)有的屬。從上述數(shù)據(jù)分析可知藥泉湖內(nèi)的細(xì)菌物種豐度較豐富，湖內(nèi)含有細(xì)菌多樣性也較為豐富（圖1）。T01、T02、T03、T04 分別是藥泉湖的四個(gè)采樣點(diǎn)。

圖1 門水平樣品物種分布圖Fig.1 Species distribution in phylum level

圖2 屬水平樣品物種分布圖Fig.2 Species distribution in genus level

2.3 稀釋性曲線

稀釋性曲線，從藥泉湖沉積物樣品中隨機(jī)選取一些序列，統(tǒng)計(jì)這些序列所代表的物種數(shù)。隨后利用序列數(shù)與物種數(shù)構(gòu)建曲線，驗(yàn)證了藥泉湖樣品中物種多樣性的可靠，并且反映了藥泉湖沉積物樣品中物種的豐富度[8]。圖2 反映了持續(xù)抽樣時(shí)新OTU 出現(xiàn)的速度比率：在一定的范圍內(nèi)，隨著測(cè)序條數(shù)的不斷增加，藥泉湖樣品的曲線首先表現(xiàn)為急速上升，證明了樣品細(xì)菌群落中發(fā)現(xiàn)有大量物種。之后圖中的曲線逐漸趨于平緩，表示藥泉湖中的物種并不會(huì)隨測(cè)序數(shù)量的增加而顯著增多。該圖足以證明藥泉湖沉積物樣品序列數(shù)量達(dá)到反應(yīng)物種多樣性及豐富程度的要求，該圖也可以看出在不同位點(diǎn)物種豐富度都較高。

圖3 樣品稀釋曲線圖Fig.3 Dilution curve

2.4 功能分析

通過KEGG 代謝途徑的差異分析，觀測(cè)藥泉湖沉積物不同分組的樣品之間的微生物群落的功能基因在代謝途徑上的變化和差異，可以充分反映藥泉湖沉積物中群落樣本為適應(yīng)環(huán)境變化而發(fā)生的代謝功能改變。由圖4 可以明顯發(fā)現(xiàn)四個(gè)采樣位點(diǎn)的基本代謝途徑十分相似，在氨基酸代謝，碳水化合物代謝，細(xì)胞群落代謝這三個(gè)代謝途徑中藥泉湖沉積物樣品豐度是最高的，可見在這三個(gè)代謝途徑中，細(xì)菌種類繁多，數(shù)量較大，是對(duì)于藥泉湖十分重要的代謝途徑，也是主要的途徑，本文還對(duì)四個(gè)采樣位點(diǎn)進(jìn)行兩兩比對(duì)，發(fā)現(xiàn)，盡管細(xì)菌豐度較高的三個(gè)代謝途徑在四個(gè)位點(diǎn)都是一致的，但是不同位點(diǎn)間有部分代謝途徑還存在著差異，例如在細(xì)胞生長(zhǎng)與死亡、循環(huán)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等代謝途徑在幾個(gè)位點(diǎn)的對(duì)比之中都存在或多或少的差異（圖5）。盡管四個(gè)位點(diǎn)是從同一個(gè)湖泊采集，但是湖泊中的不同位置的沉積物樣品之間的差異也可以說明，同一個(gè)湖泊的主要代謝途徑是固定的，其中的細(xì)菌豐度與多樣性差異不會(huì)很大，但是同一湖泊的不同位置，次要的代謝途徑有可能會(huì)出現(xiàn)差異，細(xì)菌豐度及多樣性也會(huì)有一定差異。

圖4 KEGG 代謝途徑差異分析柱狀圖Fig.4 Histogram analysis of KEGG metabolic pathways

圖5 組間KEGG 代謝途徑差異分析圖Fig.5 Comparison of KEGG metabolic pathways between groups

3 結(jié)論與討論

實(shí)驗(yàn)選取了五大連池藥泉湖四個(gè)沉積物采樣點(diǎn)的樣品進(jìn)行測(cè)序分析，在藥泉湖中，廣泛存在的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類型包括變形菌和放線菌類群，他們?cè)谒幦鱾€(gè)位點(diǎn)上均占有較大的比例。變形菌類群的優(yōu)勢(shì)也體現(xiàn)在眾多不同的環(huán)境中。蘇潔等[9]在南沙海區(qū)的深海沉積物中對(duì)細(xì)菌多樣性的研究分析中也同樣發(fā)現(xiàn)變形菌的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)指出細(xì)菌多樣性的豐富程度與環(huán)境的不同有較大關(guān)聯(lián)；李會(huì)榮等[10]在北極太平洋扇區(qū)的海洋沉積物之中研究細(xì)菌多樣性的系統(tǒng)發(fā)育，也同樣發(fā)現(xiàn)了高豐度的變形菌的身影；侯梅鋒等[11]在連云港海底的底泥細(xì)菌多樣性系統(tǒng)分析中發(fā)現(xiàn)變形菌豐度高達(dá)49.2%。除了在海洋環(huán)境中，在湖泊中變形菌的優(yōu)勢(shì)也十分明顯，例如人們發(fā)現(xiàn)在新疆兩湖和湖南岳陽洞庭湖等湖泊環(huán)境中變形菌的豐度也相較占優(yōu)勢(shì)[12]。可以發(fā)現(xiàn)，無論是在海洋底泥中，還是淡水湖泊沉積物中，以及提及的火山堰塞湖沉積物這種特殊環(huán)境下的湖泊中，變形菌群的優(yōu)勢(shì)是十分明顯的。

沉積物中各種類型的變形細(xì)菌是海洋和湖泊沉積物中微生物群落中重要的組成部分[13]。國(guó)內(nèi)外許多研究已經(jīng)表明變形細(xì)菌在太平洋深海沉積物的生物地球化學(xué)過程[14]中起著重要的作用，比如多種類型的γ 變形細(xì)菌在硫元素循環(huán)中同時(shí)還參與氧化和還原兩種作用[15]。研究表明，湖泊水體細(xì)菌在參與的生物地球化學(xué)過程中都起到重要的作用。與多數(shù)生境一樣，湖泊中的細(xì)菌在以C、S 等元素為主的生物地球化學(xué)循環(huán)過程中作用不可忽視[16]。除了變形菌之外，其他藥泉湖沉積物中的菌群也有著十分重要的作用，例如綠菌門被發(fā)現(xiàn)在厭氧環(huán)境中存在許多還尚不可知的作用[17]，放線菌門是一種具有巨大開發(fā)價(jià)值的資源，是微生物天然產(chǎn)物中最重要的產(chǎn)生菌之一[18]，硝化螺旋菌門是湖泊中參與氮循環(huán)的主要作用者[19]。藥泉湖沉積物中各個(gè)菌群均參與生物地球化學(xué)循環(huán)過程，由于是沉積物樣品，沉積物處于厭氧環(huán)境，所以特別有利于反硝化細(xì)菌的生存，其大部分存在于沉積物中，尤其是在深水湖泊的底層或者局部厭氧的環(huán)境中，能充分發(fā)揮反硝化作用，硝化、反硝化的聯(lián)合產(chǎn)氮的作用也一直是被認(rèn)為湖泊氮損失的主要途徑[20]。

藥泉湖沉積物中含有豐富的細(xì)菌菌群，豐度占具優(yōu)勢(shì)的菌群與大多是深水、湖泊、海洋沉積物細(xì)菌多樣性的研究結(jié)果相同或類似。藥泉湖沉積物中的細(xì)菌多樣性豐富且不同位點(diǎn)的沉積物樣品細(xì)菌多樣性及豐度有一定的差異，差異的原因有可能由于藥泉湖是半封閉型水體，湖泊內(nèi)水流大小以及水流速度不及開放型水體，多個(gè)采樣位點(diǎn)存在差異，也說明藥泉湖整體湖泊細(xì)菌多樣性豐富。目前多項(xiàng)研究均表明湖泊水體細(xì)菌群落的多樣性與物種分布的特征環(huán)境決定與隨機(jī)分布兩種過程共同作用的結(jié)果。目前對(duì)湖泊細(xì)菌功能的研究，也主要集中于多數(shù)細(xì)菌參與下的湖泊水體生產(chǎn)力與元素的生物地球化學(xué)循環(huán)過程，參與循環(huán)過程中的許多具體功能，還有待研究，目前，人們對(duì)于湖泊細(xì)菌群落多樣性和功能的認(rèn)識(shí)與了解還十分有限，對(duì)于特殊環(huán)境的湖泊細(xì)菌多樣性的研究更是匱乏，因此對(duì)火山堰塞湖的研究，希望可以為后續(xù)的研究提供理論支持。