馮勝杰，王新欣，賈鵬宇，王詩雅，盧潔春，左官強，劉雅，黃文婷，馮乃杰，2，鄭殿峰，2

（1.黑龍江八一農墾大學農學院，大慶 163319；2.廣東海洋大學農學院；3.國家雜糧工程技術研究中心）

甜葉菊（Bertoni）是菊科的多年生草本植物。在巴拉圭(和巴西)，甜葉菊的葉子自幾百年前就被當?shù)厝朔Q為“甜食”[1-3]，其主要用作茶、藥品等的添加劑。存在于葉子中的甜菊醇糖苷作為主要次級代謝物是甜葉菊葉片甜度的基礎，并且是甜味劑的重要成分。此外，甜菊甙和杜克糖甙也是甜葉菊的次級代謝物，但其含量低于甜菊醇糖苷[4-6]。甜菊甙是甜葉菊干葉中主要的甜味成分（4.13%），而其他重要的化合物為:甜菊雙糖甙，瑞鮑迪甙A（2.4%），B，C（1.2%），D，E，F(xiàn) 和杜克甙A（0.3%）。瑞鮑迪甙A/甜菊醇糖苷比率被認為是一個很好的反映甜味的品質指標。甜菊甙是一種高甜度、低熱值的非發(fā)酵性天然甜味劑，其甜度為蔗糖的200～300 倍，而熱量只有蔗糖的1/300，提取于菊科宿根多年生草本植物的甜葉菊莖葉中。甜葉菊葉片中的各種次級代謝產物的合成在開花以后會顯著降低，因此為了獲得更高含量的甜菊醇糖苷，甜葉菊需要在開花前收獲葉片[7]。甜菊甙是一種新型糖源，具有重要的保健功能，如促進新陳代謝、強壯身體和降低血壓等，目前在食品、醫(yī)療、日用品等領域得到了廣泛的應用[8-9]。S.Gregersen[10]研究表明在甜葉菊葉的各時期發(fā)現(xiàn)了濃度不同的有甜味的化合物甜菊醇糖苷。在對甜葉菊研究過程中，發(fā)現(xiàn)了甜菊甙活性以及幾種酶活性。Bailey 和McHargue[11]研究表明番茄果實和葉片中過氧化物酶活性隨著葉齡的增加而增加，在衰老過程中活性逐漸下降。有研究表明[12-14]，應用植物生長調節(jié)劑可控制植株的生長發(fā)育，改善植株的光合作用，調控植物的生理代謝功能以及提高作物的產量和品質。張明才等[15]研究表明，DTA-6[16-17]可提高花生器官的生理代謝功能，增加花生產量，改善花生品質。目前大多數(shù)研究主要針對甜菊醇糖苷提純方面做出了研究，而植物生長調節(jié)劑在甜葉菊栽培中的應用尚未見報道。因此，研究引入植物生長調節(jié)劑DTA-6 并開展了其作用效果和機理研究。試驗在大田條件下，探討調節(jié)劑DTA-6 調控甜葉菊形態(tài)建成，生理代謝及甜葉菊產量品質的作用機理，進而為調節(jié)劑DTA-6 在甜葉菊上的應用提供科學理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗品種

供試品種為惠農3 號，黑龍江省海林市海林農場的主栽品種。

1.1.2 試驗地基本情況

試驗田地位于黑龍江省海林市海林農場第五作業(yè)區(qū)（東經128°47′30″～129°7′30″，北緯44°15′～44°25′），試驗地氣候為大陸性季風氣候，土質以崗地白漿土為主，有機質含量27 g·kg-1，含氮為98 mg·kg-1，全磷為94 mg·kg-1，含水解氮為58.8 mg·kg-1，有效磷為15 mg·kg-1。年平均≥10 ℃活動積溫2 500 ℃左右，無霜期136 d 左右，年降水量530～550 mm。

1.1 試驗設計

試驗采用大田試驗方法，隨機區(qū)組試驗設計，使用植物生長調節(jié)劑2-N，N-二乙氨基乙基己酸酯（DTA-6）進行葉面噴施處理，濃度分別為12.5 mg·L-1（D12.5）、60 mg·L-1（D60）、300 mg·L-1（D300），以葉面噴施清水為對照（DCK）。試驗設置四次重復，于8 月15 日（移栽后75 d）進行葉面噴施。小區(qū)為6 行區(qū)，壟寬0.65 m，行長8 m，小區(qū)面積為31.2 m2，區(qū)間過道1 m，共16 個小區(qū)。于5 月25 日移栽大田，每公頃的保苗株數(shù)在18 萬株。田間作業(yè)均同當?shù)爻Ｒ?guī)生產。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 取樣及測定方法

（1）形態(tài)指標測定：于8 月20 日、9 月7 日、9 月22 日（分別為移栽后80、98、113 d）進行取樣，每個處理選取大小長勢一致的植株4 株，測量株高、莖粗后，按莖、葉分樣，105 ℃殺青30 min，80 ℃烘干至恒重后分別稱其干物質量。

（2）生理指標測定：采取植株倒5 葉片，在液氮中速凍30 min，置于-40 ℃低溫冰箱中貯存。

（3）產量的測定：在9 月22 日進行收獲測產，在每試驗小區(qū)取1 m2進行測產，放在室內陰干脫葉后進行甜葉菊干葉稱重。

1.3.2 酶液提取方法

過氧化物（POD）酶活性的提取和測定采用Sigma 法[18]測定。已知量的新鮮甜菊葉在預冷的研缽中研磨并在50 mmol·L-1預冷的磷酸緩沖液（pH7.8）在冰浴上研磨成勻漿。轉入離心管中在4 ℃、12 000 g、20 min 的條件下進行離心，取出上清液即為酶粗提液，用于過氧化物酶活性的測定。

多酚氧化（PPO）酶活性的提取和測定方法是根據(jù)曹建康等[19]編著的《果蔬采后生理生化實驗指導》測定。已知量的新鮮甜菊葉在預冷的研缽中研磨并在含有4% PVPP、1 mmol PEG 和1%TritonX-100 的已知濃度的提取緩沖液中研磨。轉入離心管中在4 ℃、12 000 g、20 min 的條件下進行離心，取出上清夜即為酶粗提液，用于多酚氧化酶活性的測定。

1.3.3 酶活性測定

過氧化物酶活性，反應混合物含有在0.2 M 磷酸鹽緩沖液（pH6.0）中的愈創(chuàng)木酚，30%H2O2和40 μL酶提取物。通過加入相應的酶開始反應。氧化染料的顏色變化在30 s 的時間間隔在470 nm 讀取1 min，重復4 次。過氧化物酶活性單位為u·g-1FW。

多酚氧化酶的活性，反應混合物含有50 mmol·L-1乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH5.5）、鄰苯二酚溶液和50 μL酶提取物。將內容物混合并立即開始計時。將反應混合液倒入比色杯中，置于分光光度計樣品室中。以蒸餾水為參比，在反應15 s 時開始記錄反應體系在波長420 nm 處吸光度值，作為初始值，然后每隔1 min記錄一次，連續(xù)測定，至少獲取6 個點的數(shù)據(jù)，重復4次。多酚氧化酶活性單位為ΔOD420/min·g-1。

1.3.4 瑞鮑迪甙A 和甜菊糖苷的提取及測定

酶液提?。悍Q取1 g 干樣葉片粉末，加入8 mL 熱水，混勻后進行30 min 超聲處理，離心4 000 g，15 min，4 ℃進行離心，取上清液，重復3 次。3 次上清液混合均勻待用，進行色譜分析。

檢測方法：通過使用安捷倫1 200 型液相色譜儀進行液相色譜分析，采用XDB-NH3（4.6×250 mm，5 μm）色譜柱，柱溫40 ℃，流速1 mL·min-1，流動相采用等度洗脫模式，流動相乙腈/水組成比為80∶20（v/v），檢測器為紫外-可見檢測器，檢測波長210 nm。

1.4 數(shù)據(jù)分析與處理

試驗數(shù)據(jù)的處理與分析采用了SPSS22.0，顯著性和極顯著性的檢驗采用Duncan’s 新復極差法，數(shù)據(jù)整理與圖表的繪制是通過Microsoft Office EXCEL2010 進行繪制完成。

2 結果與分析

2.1 噴施DTA-6 對甜葉菊形態(tài)建成的影響

如表1 所示，在整個生長期，株高逐漸增加。其中在8 月20 日，葉面噴施D12.5 的處理與CK 相比株高極顯著升高，而其他處理則與CK 相比株高無明顯差異；在9 月7 日，各處理與CK 相比株高并無顯著變化；在9 月22 日，D60 比CK 株高顯著升高，而其他處理則與CK 相比株高無明顯差異。

表1 葉噴DTA-6 處理對株高的影響Table 1 Effect of leaf DTA-6 spray treatment on plant height

如表2 所示，在整個生長期，莖粗逐漸增粗。其中在8 月20 日，葉面噴施D12.5 的處理與CK 相比株高極顯著增粗，而其他處理則與CK 相比莖粗無明顯差異；在9 月7 日，D12.5 的處理與CK 相比株高顯著增粗，而其他處理則與CK 相比莖粗均無顯著差異。在9 月22 日，D12.5 比CK 株高顯著增粗，而其他處理則與CK 相比莖粗無明顯差異。

表2 葉噴DTA-6 處理對莖粗的影響Table 2 Effect of leaf DTA-6 spray treatment on stem diameter

如表3 所示，在整個生長期，分枝數(shù)逐漸增加。其中在8 月20 日，葉面噴施D12.5、D300 處理與CK相比分枝數(shù)均極顯著增加，而D60 處理則與CK 相比無明顯差異；在9 月7 日，各處理與CK 相比分枝數(shù)均無顯著差異；在9 月22 日，D12.5 處理與CK 相比分枝數(shù)顯著增加，D60 處理與CK 相比分枝數(shù)極顯著增加。

表3 葉噴DTA-6 處理對分枝數(shù)的影響Table 3 Effect of leaf DTA-6 spray treatment on number of branches

如表4 所示，在整個生長期，單株莖重逐漸增加。其中在8 月20 日與9 月7 日，各處理則與CK 相比單株莖重均無明顯差異；在9 月22 日，D60 處理與CK 相比單株莖重顯著增加，而其他處理與CK 相比均沒有顯著變化。

表4 葉噴DTA-6 處理對單株莖重的影響Table 4 Effect of leaf spray DTA-6 treatment on stem weight

如表5 所示，在整個生長期中，除在9 月7 日調查時D12.5 處理與CK 相比降低，其余各處理與CK相比均增加，但均沒有達到顯著水平。

表5 葉噴DTA-6 處理對單株葉重的影響Table 5 Effect of leaf DTA-6 spray treatment on leaf weight per plant

2.2 噴施DTA-6 對葉片中過氧化物酶活性的影響

隨著甜葉菊的抗逆性的增加，過氧化酶活性逐漸降低。噴施調節(jié)劑DTA-6 后，各處理的過氧化物酶活性均有變化。如圖1 所示，過氧化物酶活性變化為在整個生長期中，氧化物酶（POD）活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。其中在8 月20 日，各處理中過氧化物酶活性與CK 相比顯著提高，并且均達到極顯著水平；在9 月7 日，各處理中過氧化物酶活性與CK 相比顯著提高，并且均達到極顯著水平；在9 月22 日，噴施D12.5 的處理與CK 相比過氧化物酶（POD）活性極顯著增加，噴施D300 處理與對照相比過氧化物酶（POD）活性極顯著降低，而噴施D60 的處理與CK相比活性顯著降低。

圖1 噴施DTA-6 對葉片中過氧化物酶活性的影響Fig.1 Effect of DTA-6 spray on peroxidase activity in leaves

2.3 噴施DTA-6 對葉片中多酚氧化酶活性的影響

甜葉菊的抗逆性與多酚氧化酶活性呈負相關。噴施調節(jié)劑DTA-6 后，各處理的多酚氧化酶活性均有變化。如圖2 所示，在整個生長期中，氧化物酶（POD）活性變化呈現(xiàn)先升高后趨于平緩的趨勢。其中在8 月20 日，D12.5、D60 處理與CK 相比多酚氧化酶活性極顯著降低，而D300 處理多酚氧化酶活性降低，但未達到顯著水平；在9 月7 日與9 月22 日，各處理多酚氧化酶活性與CK 相比均極顯著降低。

圖2 噴施DTA-6 對葉片中多酚氧化酶活性的影響Fig.2 Effect of DTA-6 spray on polyphenol oxidase activity in leaves

2.4 噴施DTA-6 對葉片中瑞鮑迪甙與甜菊苷比值（ReA/ST）的影響

ReA/ST 的比值越高證明甜葉菊品質越好。噴施調節(jié)劑DTA-6 后，各處理的ReA/ST 的比值間具有一定的差異。如圖3 所示，在8 月20 日，D12.5 處理與CK 相比極ReA/ST 顯著提高，而其他處理與CK相比均極顯著降低；在9 月7 日，各處理間葉片中ReA/ST 與CK 相比均極顯著降低；在9 月22 日，各處理間葉片中ReA/ST 與CK 相比均極顯著提高，而D60 處理的ReA/ST 最大。

圖3 噴施DTA-6 對瑞鮑迪甙與甜菊苷比值的影響Fig.3 Effect of DTA-6 spray on the ratio of rebaudioside and stevioside

2.5 噴施DTA-6 對甜葉菊產量的影響

根據(jù)表6 可以看出，在收獲測產時，各處理于CK 相比均有增加，其中D12.5 處理增加了3.8%；D60 處理增加了11.2%，并且差異達到了顯著水平；D300 處理增加了8.0%。

表6 噴施DTA-6 對甜葉菊產量的影響Table 6 Effect of spraying DTA-6 on Stevia yield

3 討論

POD 酶是植物重要的保護性酶[20-22]，許多植物可以通過此類酶防御系統(tǒng)來清除遭受脅迫而產生的活性氧，從而使植物維持正常的生長發(fā)育。過氧化物酶廣泛存在于植物體中，是一種活性較高的酶。在植物生長發(fā)育過程中過氧化物酶活性不斷發(fā)生變化。一般表現(xiàn)為老化組織中活性較高，幼嫩組織中活性較弱，所以過氧化物酶可作為組織老化的一種生理指標[23-24]。多酚氧化酶（PPO）是呼吸鏈末端氧化酶之一，它參與多酚類物質的氧化，在植物植株的防御保護體系中起重要作用[25-26]。多酚氧化酶也是生物質體的自源代謝酶類，能夠長期維持生物體的生自體次生代謝的平衡[27-28]。甜葉菊整株含有糖苷，以其葉片甜度最高，其安全性早已得到FAO 和WHO 等國際組織的認可，因而甜葉菊醇糖苷已被廣泛應用于食品、藥品、肥料以及飼料等行業(yè)[29-30]。有研究發(fā)現(xiàn)[31-32]，在植物的幼嫩組織和器官中轉化酶的活性較高，轉化酶活性會隨著組織和器官的成熟而降低。研究指出，葉面噴施植物生長調節(jié)劑DTA-6 可以使甜葉菊葉片中的POD 酶和PPO 酶活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，并且D60 處理達到極顯著水平，這一結果與前人研究表現(xiàn)相同，但是關于調節(jié)劑DTA-6 具體對PPO 酶與POD 酶活性的調控過程可能還有許多其他因素在起作用，如基因調控、信號轉導以及植物內源激素系統(tǒng)的調控等諸多方面，其有關機理尚待深入研究。Saibi 等[33]使小麥中DHN-5 在擬南芥中超表達，結果表明，DHN-5 通過調控擬南芥中抗氧化酶的活性，增加了過氧化物酶活性，這與試驗的結果表現(xiàn)有差異，推斷調節(jié)劑對甜葉菊的作用可能是多基因共同調控的結果，今后還需進一步挖掘相關基因，從而更好地從分子水平揭示化學調節(jié)劑促進甜葉菊品質及產量建成的調控機理。

4 結論

試驗通過葉噴處理，初步篩選出了對甜葉菊產量提高、品質改善有較好效果的植物生長調節(jié)劑S3307 濃度為50 mg·L-1，該處理在葉片成熟期降低了甜葉菊葉片中POD 酶和PPO 酶活性，提高了甜葉菊中ReA/ST，增加甜葉菊產量，有利于甜葉菊植株更好地生長發(fā)育。證明了化學調控技術在對提高甜葉菊品質及其產量方面具有發(fā)展的潛力。