楊燕新，邱相坡，于歡，王文斌*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 文理學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801)

山楂(CrataeguspinnatifidaBunge)為薔薇科植物，又名山里紅，在亞洲、歐洲、北美洲以及南美洲均有分布，在我國北方分布較廣[1]。山楂可藥食兩用，具有消積化滯、補(bǔ)脾健胃、行氣散瘀和抗氧化的功能，在臨床醫(yī)學(xué)上還可用以治療高血脂、高血壓、冠心病以及清除自由基、增強(qiáng)免疫力和抑制腫瘤等[2, 3]。

黃酮類化合物在植物中廣泛存在，屬于植物的次級(jí)代謝產(chǎn)物，并具有很高的藥用價(jià)值，在心腦血管疾病方面具有較好的療效，通過其特有的抗氧化作用，從而可以阻止細(xì)胞的退化、衰老，甚至癌癥的發(fā)生[4～6]。山楂主要含有黃酮類、有機(jī)酸、三萜類、維生素C等化學(xué)成分。有研究表明，山楂的部分藥用功能與其所含的黃酮類化合物密切相關(guān)[7, 8]。當(dāng)前社會(huì)隨著生活節(jié)奏的加快和工作壓力的日益劇增，高血壓、高血脂等疾病的發(fā)病率明顯增加，并受到人們的普遍高度重視。為此，以黃酮類化合物為基礎(chǔ)研究出針對(duì)相關(guān)疾病的預(yù)防藥物已受到廣泛關(guān)注[9]。

我國山楂資源充足，據(jù)統(tǒng)計(jì)，1995年至2017年我國山楂種植面積由原來500余萬畝增加到700余萬畝，占我國果樹種植總面積的10%左右，產(chǎn)量更是高達(dá)300萬t[5]。然而，山楂食用后以及工廠藥用山楂加工后殘余的果核利用率極低，提升山楂果核資源的利用價(jià)值具有重要的意義。前人已有研究通過索氏提取、CO2超臨界流體萃取法等對(duì)山楂果核總黃酮提取工藝進(jìn)行優(yōu)化[10, 11]，但未見應(yīng)用閃式提取的相關(guān)報(bào)道。閃式提取是近些年發(fā)展起來的一種新的提取方法，利用機(jī)械剪切刀對(duì)材料進(jìn)行高速切割，并產(chǎn)生強(qiáng)大的真空負(fù)壓，使化學(xué)成分快速溶解于提取液。閃式提取器結(jié)合了粉碎、萃取、攪拌、振動(dòng)、浸漬等技術(shù)于一身，不需要加熱，能夠避免有效成分破壞，且溶劑用量小，效率高，處理量大，使用安全可靠[12]。閃式提取適用范圍廣泛，可用于植物根、葉、花、果實(shí)等多個(gè)部位，在銀杏葉、野菊花、羅漢松、金錦香等多種植物總黃酮提取方面均有相關(guān)的研究報(bào)道[13～16]。本文旨在利用響應(yīng)面分析法對(duì)山楂果核總黃酮的閃式提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，為合理開發(fā)利用山楂果核資源及黃酮類化合物的工業(yè)化提取提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

山楂鮮果購于山西省晉中市榆次區(qū)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，用刀片取出山楂果核，洗凈平鋪于濾紙上，放置于60 ℃干燥箱中烘干至恒重后用中藥粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，過80目篩，制得山楂果核粉末并儲(chǔ)存于干燥的藍(lán)蓋瓶中，在4 ℃冰箱密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法

精確稱取20.00 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品于少量無水乙醇中溶解，然后將其完全轉(zhuǎn)移到100 mL的容量瓶中，用60%的乙醇稀釋定容，得到0.2 g·L-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL依次置于6個(gè)25 mL的容量瓶中，各加入0.3 mL 5% NaNO2溶液，搖勻后靜置6 min；再各加0.3 mL 10% Al(NO3)3溶液搖勻后靜置6 min；最后，分別加入4 mL 4%的NaOH溶液，用60%乙醇溶液稀釋定容，搖勻后靜置15 min，分別測(cè)量在波長510 nm處的吸光度A[13, 17]。并根據(jù)不同濃度下測(cè)定的吸光度值生成蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。

1.2.2 總黃酮的提取

將山楂果核粉末精確稱量2.00 g于藍(lán)蓋瓶中，電壓為100 V，在不同的料液比、乙醇濃度、提取時(shí)間條件下進(jìn)行閃式提取，提取完后的液體完全轉(zhuǎn)移至離心杯中，然后5 000 r·min-1離心15 min，取上清液作為山楂果核試液。

1.2.3 總黃酮含量的測(cè)定

本試驗(yàn)采用硝酸鋁顯色法測(cè)定山楂果核總黃酮的含量[13, 17]。取山楂果核試液2.0 mL于25 mL容量瓶中，其余步驟同1.2.1，依次加入0.3 mL 5% NaNO2、0.3 mL 10% Al(NO3)3及4 mL 4% 的NaOH溶液，振蕩搖勻，用60%乙醇溶液定容后靜置15 min，測(cè)量該溶液在波長510 nm處的吸光度A。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算山楂果核總黃酮的含量，利用以下公式求出其提取率E/%。

E為總提取率/%；C為提取液中黃酮濃度/(g·mL-1)；V為體積/mL；n為稀釋倍數(shù)；m為稱取的山楂果核粉末的質(zhì)量/g。

1.3 單因素試驗(yàn)

1.3.1 料液比試驗(yàn)

用電子天平分別精確稱量山楂果核粉末，按料液比為1∶5，1∶15，1∶25，1∶35 (g·mL-1)比例加入60%乙醇，設(shè)置電壓100 V，時(shí)間90 s完成閃式提取。然后將所得液體于5 000 r·min-1條件下離心15 min，并將上清液轉(zhuǎn)移至4個(gè)干凈的藍(lán)蓋瓶中，分別取不同料液比上清液2.0 mL，同1.2.3完成總黃酮含量的測(cè)定并計(jì)算不同料液比條件下的山楂果核總黃酮提取率。

1.3.2 乙醇濃度試驗(yàn)

料液比和閃式提取時(shí)間分別設(shè)置為1∶25(g·mL-1)和90 s，乙醇濃度設(shè)置梯度為40%、50%、60%和70%，其余步驟同1.3.1。

1.3.3 閃式提取時(shí)間試驗(yàn)

料液比和乙醇濃度分別設(shè)置為1∶25(g·mL-1)和50%，閃式提取時(shí)間梯度設(shè)置為70、80、90、100 s，其余步驟同1.3.1。

1.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，通過Design-Expert軟件中的Box-Behnken Design程序，分別用A、B、C表示乙醇濃度、提取時(shí)間、料液比，每個(gè)因素設(shè)置低、中、高3個(gè)水平，用-1、0、+1表示，設(shè)計(jì)結(jié)果見表1。

表1 試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Design of of experimental factors and levels

1.5 統(tǒng)計(jì)分析方法

所有試驗(yàn)至少重復(fù)3次，采用Microsoft Excel及SPSS 17.0進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算及顯著性差異分析。單因素實(shí)驗(yàn)中總黃酮提取率結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1顯示蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=8.731 3x-0.008 9(R2=0.999 4)。其中自變量x代表蘆丁濃度/(g·L-1)，因變量y為吸光度A。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 料液比對(duì)山楂果核總黃酮提取率的影響

在閃式提取電壓100 V條件下，設(shè)置乙醇濃度60%，提取時(shí)間90 s，得到山楂果核總黃酮的提取率與料液比關(guān)系曲線圖。由圖2可知，在液料比為1∶5～1∶25(g·mL-1)范圍內(nèi)，閃式提取山楂果核總黃酮的提取率呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，在1∶25～1∶35(g·mL-1)之間提取率下降，并且在料液比為1∶25(g·mL-1)時(shí)，山楂果核總黃酮的提取率最大。因此，初步選取1∶25(g·mL-1)為最適料液比。

圖2 料液比與總黃酮提取率關(guān)系Fig.2 Relation between ratio of material to liquid and flavonoids extraction rate

2.2.2 乙醇濃度對(duì)山楂果核總黃酮提取率的影響

設(shè)置閃式提取電壓100 V，選取2.2.1中最適料液比1∶25(g·mL-1)，提取時(shí)間90 s，然后得到山楂果核總黃酮的提取率與乙醇濃度關(guān)系的曲線圖。由圖3可知，在乙醇濃度為40%～70%之間，山楂果核總黃酮提取率呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)，并且在乙醇濃度為50%時(shí)，山楂果核總黃酮的提取率最大。因此，初步選取50%為最適乙醇濃度。

圖3 乙醇濃度與總黃酮提取率關(guān)系Fig.3 Relation between ethanol concentration and flavonoids extraction rate

2.2.3 閃式提取時(shí)間對(duì)山楂果核總黃酮提取率的影響

設(shè)置閃式提取電壓100 V、料液比1∶25(g·mL-1)、乙醇濃度50%，完成閃式提取，得到山楂果核總黃酮的提取率與閃式提取時(shí)間關(guān)系曲線圖(圖4)。在時(shí)間70～100 s范圍內(nèi)，提取率隨提取時(shí)間的延長呈先升高后降低變化趨勢(shì)，并且在提取時(shí)間90 s條件下總黃酮提取率最大。因此，初步選取90 s為最適閃式提取時(shí)間。

圖4 提取時(shí)間與黃酮提取率關(guān)系Fig.4 Relation between extraction time and flavonoids extraction rate

2.3 響應(yīng)面結(jié)果分析

依據(jù)響應(yīng)面設(shè)計(jì)完成不同因素及水平組合條件下的山楂果核總黃酮閃式提取及含量測(cè)定。通過Design Expert 8.0.5對(duì)表2所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，山楂果核總黃酮提取率用響應(yīng)值Y來表示，二次回歸方程模型為下式：

Y=0.64-0.013×A+2.000E-0.003×B+0.020×C-0.012×A×B+7.250E-0.03×B×C+4.250E-0.03×A×C-0.053×A2-0.024×B2-0.024×C2

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及測(cè)定結(jié)果

由表3可知失擬項(xiàng)不顯著，說明該模型擬合良好；均方差P=0.02<0.05，說明此回歸模型顯著。CV=2.85%，說明此響應(yīng)面試驗(yàn)精確度良好；信噪比8.368>3，表明此模型對(duì)山楂果核黃酮提取率的分析和預(yù)測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確；R2=0.930 2表明模型擬合程度較高。對(duì)回歸模型進(jìn)行顯著性分析，得到模型的一次項(xiàng)C顯著(P<0.05)，A、B不顯著(P>0.05)，二次項(xiàng)A2極顯著(P<0.01)，B2、C2顯著(P<0.05)，其余項(xiàng)均不顯著。各因素對(duì)山楂果核總黃酮提取率的影響大?。毫弦罕?乙醇濃度>提取時(shí)間。

2.4 多因素間交互作用分析

2.4.1 乙醇濃度和提取時(shí)間的交互作用

圖5顯示在料液比為1∶25時(shí)乙醇濃度和閃式提取時(shí)間對(duì)山楂果核總黃酮提取率的交互作用的3D模型。由圖5可見，固定A或者B的任一值，提取率曲線都會(huì)隨著其中單個(gè)因素的增大而先升高后降低，并且提取時(shí)間坡度較為平緩，而乙醇濃度的坡度較陡，A與B交互作用較為顯著。

圖5 乙醇濃度與提取時(shí)間對(duì)提取率交互影響的響應(yīng)面Fig.5 The response surface of interaction effect between the ethanol concentration and the extraction time

2.4.2 乙醇濃度和料液比的交互作用

在閃式提取時(shí)間90 s時(shí)，乙醇濃度與料液比對(duì)山楂果核總黃酮提取率的交互作用的3D模型如圖6所示。固定A或C中的任一值，提取率的曲線都是隨著其中一個(gè)因素的增大而先升高后降低，且乙醇濃度的坡度較陡，料液比坡度較為平坦，A與C交互作用較為顯著。

圖6 乙醇濃度與料液比對(duì)提取率交互影響的響應(yīng)面Fig.6 The response surface of interaction effect between the ethanol concentration and the ratio of material to liquid

2.4.3 提取時(shí)間和料液比的交互作用

圖7表示當(dāng)乙醇濃度為50%時(shí)閃式提取時(shí)間及料液比對(duì)山楂果核總黃酮提取率的交互作用的3D模型。由圖7可見，固定B或者C的任一值，提取率曲線都是隨著其中一個(gè)因素的增大而先升高后降低，但是B與C在各自范圍內(nèi)的曲面均較為平坦，因此，B與C交互作用不顯著。

圖7 提取時(shí)間與料液比對(duì)提取率交互影響的響應(yīng)面Fig.7 The response surface of interaction effect between the extraction time and the ratio of material to liquid

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance for regression equation

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

通過分析回歸擬合方程和回歸模型，依據(jù)響應(yīng)面分析法對(duì)山楂果核總黃酮提取率選擇maximize模式進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)而得到山楂果核總黃酮最優(yōu)的閃式提取工藝參數(shù)為：料液比1∶29.36(g·mL-1)、乙醇濃度為48.78%、閃式提取時(shí)間為91.41 s，山楂果核總黃酮提取率的理論值為0.648%。根據(jù)實(shí)際操作情況，設(shè)置料液比、乙醇濃度、閃式提取時(shí)間依次為1∶29(g·mL-1)、49%、91 s進(jìn)行驗(yàn)證，最終得到山楂果核總黃酮提取率為0.644%。此結(jié)果與響應(yīng)面的理論預(yù)測(cè)值基本一致，說明采用響應(yīng)面法優(yōu)化設(shè)計(jì)的回歸方程能夠較好地顯示出其各個(gè)因素對(duì)總黃酮提取率的影響。

3 討論

前人對(duì)山楂果核總黃酮已通過索氏提取、CO2超臨界萃取、超聲提取等方法進(jìn)行相關(guān)研究[10, 11, 18]，但未見利用閃式提取法的相關(guān)報(bào)道。本試驗(yàn)基于響應(yīng)面法對(duì)山楂果核總黃酮的閃式提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，提取參數(shù)料液比、乙醇濃度、閃式提取時(shí)間依次為1∶29(g·mL-1)、49%、91 s。而通過索氏提取法提取山楂果核總黃酮需長時(shí)間回流至無色[10]，CO2超臨界萃取需50 ℃、20 MPa、2 h的提取條件[11]，超聲波提取參數(shù)為60 ℃、50%乙醇、也需40 min超聲破碎[18]。相對(duì)而言，閃式提取在室溫下即可進(jìn)行，提取時(shí)間更短，乙醇用量較少，提取能耗及提取成本更低，通過閃式提取法的山楂果核總黃酮提取率也優(yōu)于索氏提取法(0.51%)，本試驗(yàn)結(jié)果具有更好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。但與CO2超臨界萃取及超聲提取相比，閃式提取的提取率仍較低，推測(cè)可能與山楂來源有關(guān)，溶劑及提取參數(shù)也有待進(jìn)一步優(yōu)化。當(dāng)前山楂利用的現(xiàn)狀是山楂食用后以及工廠藥用山楂加工后殘余的果核棄之不用，從而造成資源浪費(fèi)。而近年來植物總黃酮成分的提取利用受到廣泛關(guān)注，已有研究表明，山楂果肉、果核及葉片總黃酮含量依次降低[10]。因此，本試驗(yàn)結(jié)果將對(duì)山楂廢棄果核總黃酮的資源利用具有重要的參考價(jià)值。

4 結(jié)論

本研究對(duì)山楂果核中的總黃酮進(jìn)行了閃式提取，并通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法對(duì)各提取參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。試驗(yàn)結(jié)果表明，各單因素對(duì)山楂果核總黃酮的提取率的影響大小為料液比>乙醇濃度>閃式提取時(shí)間，所得最優(yōu)提取工藝參數(shù)分別是料液比1∶29(g·mL-1)、乙醇濃度為49%、閃式提取時(shí)間為91 s，山楂果核總黃酮提取率為0.644%。本試驗(yàn)結(jié)果將為山楂果核資源的開發(fā)利用提供重要的理論參考。