吉佩，暢引東，王琦，李新鳳，張作剛，徐玉梅，姚宏亮，鄭戈文，曹改萍，王建明*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西省農(nóng)業(yè)種子總站，山西 太原 030006)

玉米大斑病(NorthernLeafBlightofCornNCLB)自1876年首次在意大利發(fā)現(xiàn)以來(lái)，逐漸在世界各地流行至今[1～3]。我國(guó)最早于1899年在東北發(fā)現(xiàn)此病害[3]。自上世紀(jì)70年代至今，該病害一直在我國(guó)玉米種植區(qū)發(fā)生危害，嚴(yán)重爆發(fā)年份可減產(chǎn)50%以上[4]。目前防治該病最有效的方法是種植抗性品種[2]。玉米大斑病菌隨種植地區(qū)、品種、時(shí)間和氣候的變化而產(chǎn)生的生理分化現(xiàn)象，是導(dǎo)致其產(chǎn)生新生理小種和玉米品種抗性喪失的主要原因[5]。因此，研究不同地區(qū)玉米大斑病菌的生理分化，對(duì)品種的合理布局和抗病育種以及有效防治該病害的危害都具有重要的科學(xué)意義。

1923年印度學(xué)者M(jìn)itra首次報(bào)道玉米大斑病菌存在生理分化現(xiàn)象[6]。1974年，Lim等人提出玉米大斑病菌生理小種劃分的毒力公式[7]。據(jù)此，世界各地相繼報(bào)道了1(新0號(hào))、2(新1號(hào))、3(新23號(hào))、4(新23N)、5號(hào)(新2N)等多個(gè)生理小種。20世紀(jì)90年代以來(lái)，隨著對(duì)玉米大斑病菌生理小種鑒定的深入研究，世界各地不斷發(fā)現(xiàn)新的小種。美國(guó)報(bào)道了0、1、2、23、2N和23N[8～10]；墨西哥報(bào)道了23、2和23N，贊比亞報(bào)道了0、23和23N，烏干達(dá)報(bào)道了0、1、2、3、N和23N[11]；巴西報(bào)道了0、1N、12N和123N[12]；肯尼亞，德國(guó)和奧地利報(bào)道了的0、1、2、3、N、12、13、23、3N、123、13N和23N[13]。2018年，Weems和Bradley 利用Ht1、Ht2、Ht3、Htn、Htm5個(gè)單抗性基因從美國(guó)中北部鑒定了0、1、2、M、N、12、13、23、1M、1N、MN、123、1MN、2MN、23M、23N、12MN、23MN、123M和123MN號(hào)，共20個(gè)生理小種[14]。綜上所述，各國(guó)玉米大斑病菌的生理小種種類差異明顯，且分化日趨復(fù)雜。

我國(guó)對(duì)大斑病菌生理小種的研究始于上世紀(jì)70年代。1980年潘順?lè)ǖ仁状螆?bào)道我國(guó)大斑病菌為1號(hào)小種(新0號(hào))[15]。上世紀(jì)80～90年代，我國(guó)不斷出現(xiàn)新小種，在我國(guó)先后發(fā)現(xiàn)2(新1號(hào))[16]、3(新23號(hào))[17]、4號(hào)(新23 N)[18]等小種，其中1號(hào)小種(新0號(hào))一直是我國(guó)的優(yōu)勢(shì)小種。進(jìn)入本世紀(jì)后，利用含不同單抗性基因(Ht1、Ht2、Ht2、HtN)的玉米自交系作為鑒別寄主，研究人員陸續(xù)報(bào)道了許多新的生理小種。目前，我國(guó)已報(bào)道的大斑病菌生理小種有0、1、2、3、N、12、13、1N、23、2N、3N、12N、13N、123、23N和123N共16個(gè)類型[19]。上個(gè)世紀(jì)90年代，李勇[20]、陳剛[21]和高衛(wèi)東[22]等人對(duì)采自于山西的標(biāo)樣進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明只存在1(新0號(hào))、2號(hào)(新1號(hào))小種。20世紀(jì)以來(lái)，孫淑琴等將從山西長(zhǎng)治采集的標(biāo)樣鑒定為12號(hào)小種[4]；趙輝等報(bào)道山西小種為0、12號(hào)[23]。2009年，隗爽[24]首次對(duì)山西省部分地區(qū)的玉米大斑病進(jìn)行研究，鑒定出0、1、2、12、13、23、12N和123N號(hào)，共8個(gè)生理小種；2013年張治家等[25]從山西運(yùn)城、忻州、晉東南3個(gè)主要玉米產(chǎn)區(qū)采集玉米大斑病標(biāo)樣，共鑒定出N、0和123N號(hào)3個(gè)生理小種。以上數(shù)據(jù)表明，山西已報(bào)道的生理小種共有9個(gè)[24，25]。

綜上所述，國(guó)內(nèi)外不同地區(qū)、不同年份的小種種類及分布存在顯著差異，且分化嚴(yán)重。玉米是山西的第一大糧食作物，山西省南北氣候差異大，種植品種繁、多、雜。大斑病流行面積廣、危害損失大，品種抗性喪失明顯[26]，小種的分化亦比較復(fù)雜，但對(duì)山西省大斑病菌生理小種的系統(tǒng)研究比較少，且較為滯后。有關(guān)山西小種的種群結(jié)構(gòu)、分布和毒力頻率等尚無(wú)系統(tǒng)的研究報(bào)道。因此，本試驗(yàn)將采用玉米Ht單抗性基因鑒別寄主法，對(duì)采自山西省14個(gè)市縣的玉米大斑病菌進(jìn)行生理分化研究，以期明確小種的種群結(jié)構(gòu)、分布和毒力頻率等，為抗病育種、品種布局和有效防治該病害提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

本試驗(yàn)所用32供試菌株菌，為2017年從采自山西省14個(gè)市縣的罹病玉米葉片上分離并鑒定的的玉米大斑病菌，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理實(shí)驗(yàn)室提供(表1)。

1.2 供試鑒別寄主

鑒別寄主選用一套具有Ht1、Ht2、Ht3和HtN單基因以及不含任何上述主效抗病基因的玉米自交系，分別為A619Ht1、A619Ht2、A619Ht3、A619HtN和A619(對(duì)照)(鑒別寄主由山西農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所王富榮研究員饋贈(zèng))。

1.3 鑒別寄主的種植

選取籽粒飽滿的玉米籽粒，經(jīng)浸種、催芽處理后，選取露白整齊的種子播種于直徑15 cm的花盆中，待長(zhǎng)到4～6葉期時(shí)接種備用，每個(gè)品種3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.4 孢子懸浮液的制備及接種

將活化的菌株轉(zhuǎn)接至PDA平板中，待其大量產(chǎn)孢后，用帶有10%吐溫80的無(wú)菌水洗脫孢子，并用3層紗布過(guò)濾，將濾液配置成濃度為104～105個(gè)·mL-1的孢子懸浮液。采用涂抹法對(duì)培育好的鑒別寄主進(jìn)行接種，在保濕棚內(nèi)保濕24 h后進(jìn)行正常管理。待出現(xiàn)典型病斑后進(jìn)行調(diào)查。

1.5 鑒定標(biāo)準(zhǔn)

供試材料的生理小種鑒定以其在鑒別寄主上的2種病斑反應(yīng)類型為標(biāo)準(zhǔn)。R型病斑最初為水浸狀或褐色窄條形，中期為中間褐色、邊緣黃色暈圈梭型病斑，其出現(xiàn)早，枯死慢，不產(chǎn)生或產(chǎn)生很少孢子，稱為褪綠斑；S型病斑最初為水浸狀斑，中期為中間灰褐色、邊緣無(wú)明顯暈圈的梭型病斑，出現(xiàn)晚，枯死快，病斑周圍有明顯的萎蔫和中毒區(qū)，條件適宜時(shí)產(chǎn)生大量褐色霉層，稱為萎蔫斑[27]。

1.6 生理小種的命名

小種的命名采用Leonard的命名方法，以無(wú)效抗性基因的序號(hào)作為該小種的名稱[28]。同時(shí)參照劉國(guó)勝等[29]提出的毒力頻率公式(某抗病基因的毒力頻率/%=有毒力菌株數(shù)/測(cè)定總菌株數(shù) × 100)對(duì)分離菌株進(jìn)行毒力頻率的分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 山西玉米大斑菌生理小種鑒定結(jié)果及出現(xiàn)頻率

從表1和圖1中可知，供試的32株大斑病菌被鑒定為0、1、2、3、N、12、2N、3N、12N、13N、23N和123N，共12個(gè)生理小種，其中123N號(hào)小種出現(xiàn)頻率最高，為25.00%；12N號(hào)出現(xiàn)頻率為12.50%；12、3N、23N號(hào)，各占9.38%；N、2N、13N號(hào)，各占6.25%；0、1、2、3號(hào)均為1株，出現(xiàn)頻率均為3.13%。試驗(yàn)結(jié)果表明，山西玉米大斑病菌生理分化十分明顯，且呈多樣性和復(fù)雜化。12、3N、12N、23N和123N號(hào)5個(gè)小種出現(xiàn)頻率占總數(shù)的65.64%，是構(gòu)成山西玉米大斑病菌的主要致病小種群體。其中，原來(lái)的優(yōu)勢(shì)小種0號(hào)和1號(hào)各占3.13%，123N號(hào)成為山西省的新優(yōu)勢(shì)小種，占25.00%。

表1 山西玉米大斑病菌生理小種鑒定結(jié)果Table 1 Identification result of physiological races of E. turcicum in Shanxi

圖1 山西玉米大斑病菌生理小種頻率圖Fig.1 Isolation frequency of physiological races of E. turcicum in Shanxi

2.2 山西玉米大斑病菌生理小種毒力頻率分析

由表2可見，在供試菌株的32個(gè)菌株中，對(duì)Ht1、Ht2、Ht3和HtN四個(gè)單抗性基因無(wú)毒性的0號(hào)小種僅出現(xiàn)1株(表1)，出現(xiàn)頻率僅為3.13%，而剩余的31株對(duì)Ht單抗性基因的毒力頻率在56.25%～78.13% 之間。其中，對(duì)含HtN抗性基因的毒力頻率最高，為78.13%；對(duì)Ht2的毒力頻率次之，為68.75%；對(duì)Ht1和Ht3的毒力頻率最低, 均為56.25%。但供試菌株對(duì)含Ht雙基因組合、Ht三基因組合和Ht四基因組合的毒力頻率分別為81.25%、56.25%和25.00%。由此可知，4個(gè)Ht單抗性基因的抗病效能已顯著降低，含Ht3基因的有效抗性相對(duì)最低，而含Ht1或Ht3基因的玉米品種對(duì)大斑病菌抗病性相對(duì)最高。同時(shí)，隨著含Ht抗性基因組合數(shù)的增加，病菌的毒力頻率逐漸降低，品種抗病性則逐漸增強(qiáng)。

2.3 山西不同地區(qū)生理小種的組成

由表3可見，忻州生理小種的種類最多，共分離鑒定出1、2、2N、12N、13N、123N號(hào)6個(gè)小種，總出現(xiàn)頻率為25.00%；其次是大同，分別為N、2N、3N、12N號(hào)4個(gè)生理小種，總出現(xiàn)頻率為12.50%；最少的為長(zhǎng)治、太原和朔州僅鑒定出1個(gè)小種，這3個(gè)地區(qū)的總出現(xiàn)頻率分別為3.13%、3.13% 和9.38%。從山西地理位置來(lái)看，山西南部地區(qū)(包括運(yùn)城、臨汾、晉城和長(zhǎng)治)有7個(gè)小種，分別是3、N、12、12N、13N、23N和123N號(hào)小種，總出現(xiàn)頻率為31.26%；中部地區(qū)(包括晉中、呂梁和太原)有5個(gè)小種，分別是0、12、12N、3N和23N號(hào)小種，總出現(xiàn)頻率為21.89%；北部地區(qū)(包括忻州、朔州和大同)有8個(gè)小種，分別是1、2、N、2N、3N、 12N、13N和123N號(hào)小種，總出現(xiàn)頻率為46.88%。由此可知，山西各地區(qū)生理小種種類存在明顯差異，北部小種最為豐富，南部次之，中部最少。

表2 山西玉米大斑病菌對(duì)Ht抗性基因的毒力頻率

3 討論與結(jié)論

近年來(lái)，我國(guó)各省在玉米大斑病菌的小種鑒定方面做了大量工作，其中，云南省[30]、東三省[31]、河北省[32]和甘肅省[33]等地先后鑒定出11個(gè)、14個(gè)、15個(gè)和10個(gè)生理小種。山西小種組成的復(fù)雜性和云南、東三省、河北、甘肅比較相似。本試驗(yàn)共鑒定出12個(gè)小種，加之以前報(bào)道過(guò)，但本研究未發(fā)現(xiàn)的13和23號(hào)小種，山西已有14個(gè)生理小種，存在較大的生理分化。這可能是由于山西玉米種植生態(tài)類型多、種植品種多、氣候條件復(fù)雜所造成的。本試驗(yàn)中僅對(duì)32株大斑病菌的生理小種進(jìn)行研究，且采用的是國(guó)內(nèi)通用的4種鑒別寄主進(jìn)行鑒定，而國(guó)外現(xiàn)已采用Ht1、Ht2、Ht3、Htn和Htm共5個(gè)單基因鑒別寄主進(jìn)行小種鑒定[14]，所以有關(guān)山西省玉米大斑病菌生理小種種類及其分布的結(jié)果存在一定的局限性。因此，今后應(yīng)在擴(kuò)大采集范圍、菌種樣本和鑒別寄主種類的基礎(chǔ)上繼續(xù)進(jìn)行小種鑒定，這對(duì)更深入、系統(tǒng)的了解山西省玉米大斑病菌生理分化情況具有重要意義。

表3 山西省不同地區(qū)玉米大斑病菌生理小種組成及出現(xiàn)頻率Table 3 Physiological races composition and isolation frequency in different areas of Shanxi Province

自上世紀(jì)60年代以來(lái)，我國(guó)玉米大斑病的優(yōu)勢(shì)小種主要為0號(hào)和1號(hào)[21～23]。大量的研究結(jié)果表明，自上個(gè)世紀(jì)90年代以來(lái)，我國(guó)大斑病菌的小種種群結(jié)構(gòu)發(fā)生了比較大的變化，針對(duì)Ht1、Ht2、Ht3和HtN這4個(gè)抗性基因，均分化出了具有相應(yīng)毒性基因的生理小種。從本世紀(jì)初開始，已在我國(guó)多個(gè)地區(qū)發(fā)現(xiàn)了對(duì)帶Ht抗性基因的玉米均能致病的123N號(hào)生理小種[4，5]，但出現(xiàn)頻率都比較低。到2011年，致病力強(qiáng)的123N號(hào)已經(jīng)成為云南、貴州等地玉米種植區(qū)的優(yōu)勢(shì)小種[30,34]，在這些地區(qū)單一的Ht抗性基因品種對(duì)玉米大斑病菌抗性作用已基本喪失，這與本研究結(jié)果相符。因此，僅依靠4個(gè)Ht單基因的垂直抗病品種已不能有效的防治玉米大斑病，而且針對(duì)含有2～4個(gè)Ht抗性基因的小種的出現(xiàn)頻率呈上升趨勢(shì)。針對(duì)Ht抗性基因的抗病效能需慎重對(duì)待，篩選新的抗源及培育和選育多基因抗性的抗病品種刻不容緩。