王立勇 黃佳瀅 朱銳靈 徐悅 湯建 聞崇煒

摘要：為優(yōu)化僵蠶醇溶蛋白質(zhì)的提取工藝，并建立相應的SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳）、HPLC（高效液相色譜）、FTIR（傅里葉變換紅外光譜）指紋圖譜。在單因素試驗的基礎上，利用響應面法，以提取率為響應值建立數(shù)學模型，獲得最佳工藝，用SDS-PAGE、HPLC、FTIR建立僵蠶醇溶蛋白質(zhì)指紋圖譜。通過單因素試驗考察乙醇濃度、料液比、溫度、提取時間對僵蠶醇溶蛋白質(zhì)提取率的影響，進而用Box-Behnken法設計4因素3水平試驗，進行響應面回歸分析。結果表明，僵蠶醇溶蛋白質(zhì)的最佳提取工藝條件為料液比1g∶24.22mL，乙醇濃度38.73%，溫度35℃，提取時間3.94h，此時的提取率為0.5402%。用SDS-PAGE、HPLC、FTIR法建立僵蠶醇溶蛋白質(zhì)指紋圖譜，SDS-PAGE分析結果表明，僵蠶醇溶蛋白質(zhì)分子量集中在16.7～36.2ku;HPLC分析結果表明，主要僵蠶醇溶蛋白質(zhì)的保留時間為2.048min與3.354min，其含量分別占總蛋白量的31.23%與32.93%;FTIR分析結果表明，僵蠶醇溶蛋白質(zhì)在2927.71、1631.71、1457.24、1310.71cm-1處有主要吸收峰。研究并建立了僵蠶醇溶蛋白質(zhì)的優(yōu)化提取條件，并獲得了蛋白質(zhì)的SDS-PAGE、HPLC、FTIR指紋圖譜。

關鍵詞：僵蠶;醇溶蛋白質(zhì);響應面法;FTIR指紋圖譜;SDS-PAGE;HPLC

中圖分類號：R284.2文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2020）22-0196-06

作者簡介：王立勇（1994—），男，福建福州人，碩士研究生，研究方向為分子生藥學。E-mail：1395996384@qq.com。

通信作者：聞崇煒，博士，副教授，研究方向為分子生藥學。E-mail：wenchw@ujs.edu.cn。

早在秦漢年間，《神農(nóng)本草經(jīng)》就收載僵蠶為祛風定驚、化痰散結的中品藥材[1]?，F(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)，僵蠶具有抗癌、降血糖、抗菌、鎮(zhèn)靜催眠、抗凝血、神經(jīng)營養(yǎng)及保護等多種作用[2-7]。目前研究認為，僵蠶富含的草酸銨是其抗驚厥、抗凝血的主要藥理成分，槲皮素是其祛痰、止咳的藥理成分。程鎖明等利用反復硅膠柱色譜、十八烷基硅烷鍵合硅膠填料柱、液相色譜等方法進一步從僵蠶中分離得到（3α，6β）-3-芐基-6-異丙基-4-甲基-2，5-嗎啡啉二酮等12個化合物[8]。殷志琦等應用硅膠柱層析和重結晶方法首次從僵蠶中分離得到6個化合物[9]。郭曉恒等從僵蠶的三氯甲烷部位分離鑒定出6，9-氧橋-麥角甾-7，22-雙烯-3-醇、β-谷甾醇等多種化學成分[10]。但是，目前對僵蠶中含量最豐富的蛋白質(zhì)還缺乏深入研究。

蛋白質(zhì)具有重要的生物學功能，是生命活動的執(zhí)行者。在稀鹽、緩沖系統(tǒng)的水溶液作用下，蛋白質(zhì)的溶解度大、穩(wěn)定性好，因此它們是蛋白質(zhì)提取的常用溶劑。乙醇溶液可用于提取植物中的醇溶性蛋白質(zhì)[11-13]，但能否用于提取僵蠶中的醇溶性蛋白質(zhì)至今尚未見報道。響應面法可基于數(shù)學建模確定試驗因素間的相互作用并進行工藝優(yōu)化[14]，目前已在蛋白質(zhì)提取工藝的優(yōu)化中得到廣泛應用[15-18]。本研究旨在利用響應面法優(yōu)化僵蠶醇溶蛋白質(zhì)的提取工藝，并對其進行SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳）、HPLC（高效液相色譜）、FTIR（傅里葉變換紅外光譜）指紋圖譜分析，旨在為其后續(xù)功能研究及開發(fā)應用提供參考。

1材料與方法

1.1材料與試劑

主要試驗材料為僵蠶，購自亳州中藥材市場，經(jīng)江蘇大學藥學院歐陽臻教授鑒定為蠶蛾科昆蟲家蠶4～5齡的幼蟲感染白僵菌后的致死干燥體。

主要試劑有蛋白質(zhì)分子量標準品，購自賽默飛世爾科技有限公司;考馬斯亮藍R-250，購自北京中生瑞泰科技有限公司;溴酚藍，購自Amresco公司;無水乙醇、牛血清白蛋白、甲醇、乙腈、溴化鉀等試劑，均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2儀器與設備

主要設備有電子分析天平，購自Sartorius公司;酶標儀，購自美國MolecularDevices公司;數(shù)顯恒溫水浴鍋，購自江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠;微量臺式離心機，購自美國ThermoScientific公司;冷凍干燥機，購自德國Marinchrist公司;Avatar-370型傅立葉變換紅外光譜儀，購自美國尼高力儀器公司;安捷倫LC1200液相色譜儀，購自美國普惠公司。

1.3試驗方法

1.3.1蛋白質(zhì)的提取將僵蠶粉碎并過70目篩備用。取適量僵蠶粉末，按預設的料液比加入預設濃度的乙醇溶液，在恒溫水浴箱中用預設溫度水浴振蕩提取醇溶蛋白質(zhì)。水浴結束后，將樣品于12000r/min離心10min，收集上清液備用。

1.3.2蛋白質(zhì)提取率的測定以考馬斯亮藍法進行蛋白質(zhì)定量，牛血清白蛋白為標準蛋白質(zhì)，測定595nm處樣品吸光度，建立標準曲線[19]。隨后分別取200μL“1.3.1”節(jié)所得樣品加入管A、管B中，A管加適量三氯乙酸，離心去除沉淀蛋白質(zhì);B管不作任何處理，根據(jù)A管及B管吸光度計算蛋白質(zhì)吸光度，再根據(jù)標準曲線計算樣品中的蛋白質(zhì)含量，之后按下述公式計算蛋白質(zhì)提取率：

蛋白質(zhì)提取率=（mB-mA）/m×100%。

式中：mA為A管的蛋白質(zhì)含量;mB為B管的蛋白質(zhì)含量;m為提取用僵蠶粉末量。

1.3.3單因素試驗（1）乙醇濃度對蛋白質(zhì)提取率影響的試驗。乙醇濃度分別設為20%、30%、40%、50%、60%、70%，溫度為40℃，料液比為1g∶25mL，提取時間為4h。（2）料液比對蛋白質(zhì)提取率影響的試驗。料液比分別取1g∶10mL、1g∶15mL、1g∶20mL、1g∶25mL、1g∶30mL，提取溫度為40℃，乙醇濃度為40%，提取時間為4h。（3）提取溫度對蛋白質(zhì)提取率影響的試驗。提取溫度分別取30、35、40、45、50、55℃，乙醇溶液濃度為40%，提取時間為4h，料液比為1g∶25mL。（4）提取時間對蛋白質(zhì)提取率影響的試驗。提取時間分別取1、2、3、4、5、6、7h，提取溫度為40℃，乙醇濃度為40%，料液比為1g∶25mL。

1.3.4響應面試驗在單因素試驗的基礎上，采用Design-Expert8.0.6中的Box-Behnken中心組合試驗設計響應面試驗，以料液比、乙醇濃度、溫度、時間為自變量，以提取率為響應值，采用響應面分析法對僵蠶醇溶蛋白質(zhì)的提取工藝條件參數(shù)進行優(yōu)化，其各因素的編碼水平見表1。

1.3.5SDS-PAGE檢測取適量蛋白質(zhì)樣品與上樣緩沖液混合，沸水浴處理10min，得電泳樣品。按照常規(guī)方法進行SDS-PAGE分析，分離膠濃度為10%，濃縮膠濃度為5%，于80V恒壓電泳2h，當溴酚藍指示劑距膠板底部邊緣1～2cm時結束電泳，取下凝膠后進行染色、脫色[20]。

1.3.6凝膠分析用凝膠成像系統(tǒng)采集SDS-PAGE凝膠圖像，用QuantityOne軟件定量各條帶的遷移率及灰度值，按如下公式計算各蛋白質(zhì)的比例：

蛋白質(zhì)比例=待測蛋白質(zhì)灰度值/蛋白質(zhì)總灰度值×100%。

1.3.7HPLC檢測采用安捷倫LC1200液相色譜儀進行檢測，色譜柱為EclipsePlusC18（100mm×4.6mmID），流動相為10%乙腈溶液，流速為0.5mL/min，進樣量為20μL，檢測波長為270nm。取適量凍干后的僵蠶蛋白質(zhì)粉末溶解于適量流動相，再按照上述檢測條件進行HPLC檢測。

1.3.8FTIR檢測取適量凍干后的僵蠶蛋白質(zhì)粉末，加入適量溴化鉀（KBr）粉末研磨混勻，壓片后置于傅立葉紅外光譜儀下，于4000～400cm-1范圍內(nèi)進行掃描。

2結果與分析

2.1單因素試驗結果分析

由圖1-A可知，當乙醇濃度達到40%前，提取率隨著乙醇濃度的增加呈上升趨勢;當乙醇濃度為40%時，提取率達到峰值為0.531%;之后繼續(xù)提高乙醇濃度，提取率逐漸降低。這可能是因為乙醇濃度過高時，提取液的極性變小，使得蛋白質(zhì)在提取液中的溶解度降低。因此，本研究選擇乙醇提取濃度為40%。由圖1-B可知，當料液比小于1g∶25mL時，隨著料液比的增加，提取率呈明顯上升的趨勢;當料液比為1g∶25mL時，具有最大提取率，為0.532%;繼續(xù)增加料液比，提取率沒有顯著變化。理論上說，料液比越大，提取液的黏度就越低，蛋白質(zhì)就越容易溶出。當料液比達到1g∶25mL后，蛋白質(zhì)的溶出趨于平衡，料液比的增加不再使提取率升高，過多的提取液反而會造成資源浪費和后續(xù)處理的困難。綜合考慮，選擇料液比為1g∶25mL。由圖1-C可知，當溫度低于40℃時，隨著溫度的上升，提取率逐漸升高，在溫度為40℃時達到峰值，為0.519%;當溫度繼續(xù)提高時，提取率反而降低，這可能是因為隨著溫度的升高，蛋白質(zhì)會發(fā)生變性，進而形成凝膠，從而增加了提取液的黏度，導致分離困難，并且過高的溫度也會造成能耗的增加。綜合考慮，選擇提取溫度為40℃。由圖1-D可知，當提取時間小于4h時，提取率隨著提取時間的增加而升高;當提取時間為4h時，提取率達到最大值，為0.532%，此時蛋白質(zhì)的溶出率達到了動態(tài)平衡;當提取時間超過4h時，若繼續(xù)增加提取時間，提取率反而下降，因此選擇提取時間為4h。

2.2響應面結果分析

響應面法是一種結合數(shù)學方法與統(tǒng)計方法對所感興趣的響應值受多個變量影響的問題進行建模和分析的數(shù)理統(tǒng)計方法，可以實現(xiàn)響應值的優(yōu)化。本研究在單因素試驗的基礎上，以蛋白質(zhì)提取率為效應值，以料液比、乙醇濃度、溫度和提取時間為自變量進行響應面設計試驗，結果見表2、表3。

從表3可看出，該模型P值顯著、失擬項不顯著，表明模型擬合得較好。另外，料液比、溫度、提取時間對乙醇溶液提取僵蠶蛋白質(zhì)的影響極顯著，其中交互項AC、BD對僵蠶醇溶蛋白質(zhì)提取率具有顯著或極顯著影響，結果如圖2所示。

用Design-Expert8.0.6軟件對表3中的數(shù)據(jù)進行分析，擬合得回歸方程：

Y=0.530+0.680A+0.280B-0.580C-0.410D-0.025AB+1.200AC+0.300AD+0.330BC+0.500BD+0.330CD-1.600A2-0.260B2-0.076C2-0.070D2。

從該回歸方程可以看出，4個因素對僵蠶醇溶性蛋白質(zhì)提取率影響的排序為料液比>溫度>提取時間>乙醇濃度。通過軟件計算分析，得出最佳僵蠶醇溶蛋白質(zhì)提取工藝為料液比1g∶24.22mL，乙醇濃度38.73%，溫度35℃，提取時間3.94h，在此條件下獲得最佳僵蠶醇溶性蛋白質(zhì)的提取率為0.5402%。

2.3驗證試驗

取3份僵蠶粉末，按照最佳提取工藝條件進行試驗，重復3次，得到僵蠶醇溶蛋白質(zhì)平均提取率為0.5417%。該結果與理論最大值一致，說明本試驗的數(shù)學模型穩(wěn)定可靠。

2.4SDS-PAGE指紋圖譜分析

按照“1.3.5”節(jié)與“1.3.6”節(jié)方法進行僵蠶醇溶蛋白質(zhì)的SDS-PAGE指紋圖譜分析。由圖3可以看出，用40%乙醇溶液提取的蛋白質(zhì)樣品為多種中小分子量（16.7～36.2ku）蛋白質(zhì)形成的混合物，其中分子量較?。?6.7～23.1ku）的蛋白質(zhì)占蛋白質(zhì)總量的74%，其遷移率為0.808～0.945;分子量較大（32.5～36.2ku）的蛋白質(zhì)占蛋白質(zhì)總量的24.8%，其遷移率為0.603～0.651。

2.5HPLC指紋圖譜分析

按照“1.3.7”節(jié)所述方法進行僵蠶醇溶蛋白質(zhì)的HPLC指紋圖譜分析。如圖4所示，共形成保留時間介于1.630～6.115min的6個色譜峰，其中主要醇溶蛋白質(zhì)的保留時間分別為2.048、3.354min，其含量分別占總蛋白含量的31.23%、32.93%。

2.6FTIR指紋圖譜分析

按照“1.3.8”節(jié)所述進行僵蠶醇溶蛋白質(zhì)的FTIR指紋圖譜分析。由圖5可見，用40%乙醇提取的僵蠶蛋白質(zhì)在4000～400cm-1范圍內(nèi)共有6個吸收峰，其中2927.71cm-1處為甲基、亞甲基的C—H伸縮振動峰，1631.71cm-1處為蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ帶的C[FY=，1]O的伸縮振動峰，1457.24、1310.71cm-1處為C—H的彎曲振動吸收峰。冀憲領等曾報道，僵蠶75%乙醇提取物的FTIR指紋圖譜的主要特征吸收峰為1723、1300、1210cm-1等[21]，將其研究結果與本研究結果相結合，可為基于FTIR技術鑒定僵蠶提供較好的試驗依據(jù)。

3結論與討論

植物中含有較多的醇溶蛋白質(zhì)，研究結果表

明，這些蛋白質(zhì)具有良好的生物相容性、利用度及可降解性，可用作多種支架材料、黏附材料及載體材料，在食品及醫(yī)藥方面有廣闊的應用前景[22-25]。但是，動物來源的醇溶蛋白質(zhì)至今仍鮮有報道。本研究采用響應面法優(yōu)化了僵蠶醇溶蛋白質(zhì)的提取工藝，結果表明，最佳提取條件為料液比1g∶24.22mL，乙醇濃度38.73%，溫度35℃，提取時間3.94h，蛋白質(zhì)的最優(yōu)提取率為0.5402%，建立了僵蠶醇溶蛋白質(zhì)的SDS-PAGE、HPLC、FTIR指紋圖譜，為后續(xù)僵蠶醇溶蛋白質(zhì)的研究及開發(fā)利用創(chuàng)造了條件。

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