湯玥 何浩波 何凱 陳馨茹 胡翠英 姚雪梅 李良智

摘要：以野生型蠟樣芽孢桿菌（Bacilluscereus）EN34為出發(fā)菌株，增強(qiáng)胱硫醚γ-合成酶基因（metI）表達(dá)，敲除或弱化腺苷蛋氨酸合成酶的編碼基因metK，分析這2個(gè)基因的改變對(duì)蛋氨酸產(chǎn)量的影響。從枯草芽孢桿菌基因組中擴(kuò)增P43強(qiáng)啟動(dòng)子，連接到pEB03質(zhì)粒，利用重組連接的方法，將metI從BacilluscereusEN34[JP2]擴(kuò)增重組連接到質(zhì)粒，構(gòu)建成pEB03-P43-SD-metI，通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化到BacilluscereusEN34，獲得BacilluscereusEN34（pEB03-P43-SD-metI）菌株。通過(guò)BacilluscereusEN34擴(kuò)增metK基因，提取質(zhì)粒pKVM1以及重組連接等方法，構(gòu)建出pKVM1：：metK′敲除質(zhì)粒，[JP2]將質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到BacilluscereusEN34中進(jìn)行metK交換，再篩選出單交換成功的菌株，最后獲得metK弱化成功BacilluscereusEN34Δ（metK）菌株。經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)基硫源優(yōu)化分析得出，單獨(dú)增強(qiáng)metI表達(dá)不能提高蛋氨酸產(chǎn)量，產(chǎn)量與出發(fā)菌株基本一致;改變metK基因，能提高蛋氨酸產(chǎn)量，但不能完全刪除metK基因，否則將導(dǎo)致細(xì)胞死亡。硫源采用200μL/L甲基硫醇鈉和二甲基硫醚的混合物（體積比19∶1）、15g/L的Na2SO4，二者結(jié)合，BacilluscereusEN34Δ（metK）菌株蛋氨酸產(chǎn)量為440.66mg/L，是出發(fā)菌株的20倍。本研究為芽孢桿菌工程菌的構(gòu)建了提供一定的技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞：L-蛋氨酸;基因工程;芽孢桿菌;metI基因;蛋氨酸產(chǎn)量

中圖分類號(hào)：S188文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）22-0037-07

作者簡(jiǎn)介：湯玥（1999—），女，江蘇揚(yáng)州人，主要從事發(fā)酵工程方面的研究。E-mail：1430701525@qq.com。

通信作者：胡翠英，碩士，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，主要從事發(fā)酵工程方面的研究。E-mail：13151170848@163.com。

蛋氨酸作為必需氨基酸之一，是動(dòng)物飼料中必不可少的添加劑。產(chǎn)乳牛食用保護(hù)性蛋氨酸[1-2]，可以改善肉牛瘤胃內(nèi)環(huán)境，提高產(chǎn)奶量[3-4];喂食產(chǎn)蛋雞或肉仔雞保護(hù)性蛋氨酸能提高產(chǎn)蛋能力和肉質(zhì)[5-6];長(zhǎng)期添加OH-蛋氨酸能改善豬肉嫩度[7]?，F(xiàn)有全球制備蛋氨酸的方法主要是化學(xué)法[8]，發(fā)酵法制備蛋氨酸相對(duì)安全，但產(chǎn)量較低[9-11]。目前，筆者所在實(shí)驗(yàn)室已篩選到1株蠟樣芽孢桿菌（BacilluscereusEN34），但由于代謝通路中復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，蛋氨酸產(chǎn)量難以提高。胱硫醚γ-合成酶是由metI基因（早期稱yjcI基因）編碼，它有2個(gè)功能[12-14]，一是為硫酸鹽存在時(shí)，催化H2S與琥珀酰高絲氨酸反應(yīng)形成L-高半胱氨酸;二是催化O-琥珀酰高絲氨酸生成胱硫醚。通過(guò)加強(qiáng)metI基因的表達(dá)，促進(jìn)胞外S元素的消化吸收，可以提高蛋氨酸產(chǎn)量。S-腺苷甲硫氨酸（SAM）合成酶（由metK基因編碼）催化蛋氨酸變成SAM[15-16]，是蛋氨酸重要代謝途徑，阻斷或減弱此途徑，理想狀態(tài)下能有效截留L-蛋氨酸，從而提高蛋氨酸產(chǎn)量。目前，針對(duì)蠟樣芽孢桿菌這2個(gè)基因的改變研究較少，鑒于此，本研究以Bacillussp.EN34為出發(fā)菌株，通過(guò)基因工程的方法，增強(qiáng)胱硫醚γ-合成酶的表達(dá)量以及減弱或阻斷SAM合成酶，以提高蛋氨酸產(chǎn)量。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1菌株和質(zhì)粒蠟樣芽孢桿菌EN34（BacilluscereusEN34）為筆者所在實(shí)驗(yàn)室篩選保存菌株。質(zhì)粒pEB03、pKVM1，以及感受態(tài)細(xì)胞S17-1均為筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2主要試劑和儀器質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、DNA產(chǎn)物純化試劑盒、基因組DNA小量抽提試劑盒（離心柱式）等均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司;DNAMarker250bpⅠ、Ⅱ、Ⅲ均購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司;EcoRⅠ、HindⅢ、BamHⅠ均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司;T4連接酶購(gòu)自基因生物技術(shù)國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司;重組酶ClonExpressⅡ購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;氯霉素、氨芐青霉素、紅霉素等抗生素均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司，使用濃度分別為25、100、10μg/mL。氨基酸含量分析所用試劑、培養(yǎng)基成分均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。主要儀器有電泳儀（Subcell德國(guó)Eppendorf公司），凝膠成像分析儀（GelDocXR+美國(guó)Bio-Rad公司），全波長(zhǎng)紫外分光光度計(jì)（NanoDrop2000美國(guó)ThermoElectron公司），細(xì)胞電穿孔儀（ECM630美國(guó)BTX公司），氨基酸分析儀（A300德國(guó)MembraPure公司），聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增儀（5332德國(guó)Eppendorf公司）等。

1.1.3培養(yǎng)基[JP2]LB培養(yǎng)基（1L）：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化鈉10g，pH值為7.0;種子液（1L）：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，pH值為7.2;發(fā)酵培養(yǎng)基（1L）：葡萄糖110g，尿素8g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O0.2g，F(xiàn)eSO4·7H2O0.2g，MnSO4·H2O02g，（NH4）2SO42g，生物素5μg/100mL，硫胺素200μg/100mL，Na2SO415g，pH值為6.5。

1.2PCR引物設(shè)計(jì)

利用KEGGPathway網(wǎng)站與MEGA5分析metK和metI基因保守序列，利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)設(shè)置3對(duì)引物（metIF/R、metK[STBX]1[STBZ]F/R、metK[STBX]2[STBZ]F/R），用于擴(kuò)增EN34菌株相應(yīng)的基因，然后測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，設(shè)置引物metI-F（含EcoRⅠ與P43部分序列）、metI-R（含BamHⅠ與部分pEB03上面的序列）、metKUF（含pKVM1質(zhì)粒上部分序列、EcoRⅠ序列）、metKUR（含metK下游部分序列）、metKDF（含metK前面部分序列）、metKDR（含pKVM1質(zhì)粒上部分序列、EcoRⅠ序列）。P43強(qiáng)啟動(dòng)子來(lái)源于枯草芽孢桿菌，依據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)置P43引物P43F（含HindⅢ序列）與P43R（含EcoRⅠ和SD序列）。擴(kuò)增基因的引物名稱和具體引物序列見(jiàn)表1。

1.3metI基因加強(qiáng)表達(dá)

metI基因加強(qiáng)表達(dá)的操作流程如圖1所示。（1）獲得metI擴(kuò)增產(chǎn)物。接種EN34菌株于種子液，30℃培養(yǎng)過(guò)夜，用液氮碾磨菌體，提取總DNA。用metIF/R引物擴(kuò)增metI基因并測(cè)序。（2）構(gòu)建pEB03+P43+SD質(zhì)粒。獲取枯草芽孢桿菌基因組，用P43F/R引物（帶SD序列）擴(kuò)增P43強(qiáng)啟動(dòng)子，獲得P43-SD產(chǎn)物。用EcoRⅠ與HindⅢ雙酶切pEB03質(zhì)粒，連接P43-SD。轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物到S17-1感受態(tài)細(xì)胞，挑取轉(zhuǎn)化子，用引物P43F與P43R驗(yàn)證，獲得含pEB03-P43-SD質(zhì)粒的S17-1。（3）pEB03-P43-SD-metI表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。用BamHⅠ酶切pEB03-P43-SD質(zhì)粒，將酶切產(chǎn)物用Exnase酶重組連接metI基因擴(kuò)增產(chǎn)物（用metI-F/R擴(kuò)增）。重組連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到S17-1感受態(tài)細(xì)胞，挑取轉(zhuǎn)化子，利用metI-F/R驗(yàn)證metI基因序列，獲得含pEB03-P43-SD-metI質(zhì)粒S17-1細(xì)胞。（4）電擊轉(zhuǎn)化與驗(yàn)證。將pEB03-P43-SD-metI質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化到Bacillussp.EN34感受態(tài)細(xì)胞中[17]。電擊轉(zhuǎn)化條件：電容25μF，電阻200Ω，脈沖電壓2500V/cm，約4.5ms/次脈沖。向電擊液中加入LB培養(yǎng)基，30℃靜置2h，涂布LB平板（含氯霉素），30℃培養(yǎng)24～36h;[JP2]用引物P43F/R驗(yàn)證是否有P43強(qiáng)啟動(dòng)子。將獲得的菌株命名為BacilluscereusEN34pEB03-P43-SD-metI。

1.4metK基因敲除

metK基因敲除流程見(jiàn)圖2。（1）擴(kuò)增EN34菌株中metK。因metK較長(zhǎng)，分成2部分?jǐn)U增，中間重疊。利用引物metK1F/R、metK2F/R擴(kuò)增metK基因，測(cè)序。（2）分別擴(kuò)增metK上下游部分序列，如圖2中metKU（格子）與metKD（點(diǎn)）片段，引物為metKUF/R、metKDF/R。（3）pKVM1：：metK′的構(gòu)建。重組連接pKVM1的EcoRⅠ酶切產(chǎn)物與metK上下游部分序列。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到S17-1感受態(tài)細(xì)胞中。挑取在氨芐LB平板上長(zhǎng)出的菌落。以metKUF/R為引物驗(yàn)證是否含有metK′基因。（4）pKVM1：：metK′質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化EN34菌株。方法同“1.3”節(jié)。涂布平板[含安芐（Amp）、異丙基-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）];30℃培養(yǎng)24～36h;挑出藍(lán)色菌株到新的LB培養(yǎng)基中，過(guò)夜培養(yǎng)。（5）單交換轉(zhuǎn)化子。將培養(yǎng)液接種至LB培養(yǎng)基（含Amp、SAM、IPTG和X-gal）中，30℃培養(yǎng)6～12h，轉(zhuǎn)接至新鮮LB培養(yǎng)基中，42℃培養(yǎng)6～12h，系列稀釋（10-4和10-5）至含葡萄糖的營(yíng)養(yǎng)肉湯固體培養(yǎng)基平板（含氨芐、SAM、IPTG和X-gal），42℃過(guò)夜培養(yǎng)，挑取轉(zhuǎn)化子，非藍(lán)色菌落，在42℃LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)16h，以metKUF與metKDR為引物驗(yàn)證單交換轉(zhuǎn)化子。（6）雙交換轉(zhuǎn)化子。挑取轉(zhuǎn)化子至LB液體培養(yǎng)基（含SAM）中，30℃（無(wú)抗性）培養(yǎng)并轉(zhuǎn)接兩代，稀釋涂LB平板，30℃培養(yǎng)，挑取轉(zhuǎn)化子，并進(jìn)行分子驗(yàn)證（雙交換）。將獲得的菌株命名為BacilluscereusEN34Δ（metK）。

1.5蛋氨酸產(chǎn)量分析

分別接種BacilluscereusEN34、BacilluscereusEN34（pEB03-P43-SD-metI）、BacilluscereusEN34Δ（metK）到種子液，過(guò)夜培養(yǎng)，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基，向培養(yǎng)BacilluscereusEN34Δ（metK）的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入10mg/LSAM，下同。30℃200r/min搖床培養(yǎng)72h。發(fā)酵液10000r/min離心10min，取400μL上清液樣品，加入100μL10%的磺基水楊酸，2～8℃靜置60min。14500r/min離心5min，用0.22μm針式過(guò)濾器過(guò)濾，得到的樣品用氨基酸分析儀分析。每種菌平行3次試驗(yàn)。

1.6優(yōu)化培養(yǎng)基成分

BacilluscereusEN34（pEB03-P43-SD-metI）增加metI表達(dá)，metI催化反應(yīng)之一是加速Na2SO4向蛋氨酸的轉(zhuǎn)化，針對(duì)此菌的優(yōu)化項(xiàng)是改變培養(yǎng)基中Na2SO4的含量。發(fā)酵培養(yǎng)基中其他成分不變，Na2SO4濃度梯度為5、10、15、20、25、30、35、45g/L。

BacilluscereusEN34Δ（metK）蛋氨酸相對(duì)產(chǎn)量較高，對(duì)培養(yǎng)條件也做了2種硫源的優(yōu)化。發(fā)酵培養(yǎng)基中其他成分不變，Na2SO4濃度梯度為5、10、15、20、25g/L。向發(fā)酵培養(yǎng)基中梯度添加甲基硫醇鈉和二甲基硫醚的混合物，二者體積比為19∶1，替換發(fā)酵培養(yǎng)基中Na2SO4?；旌衔锏奶砑訚舛确謩e為200、250、300、350、400μL/L。

最后，在最優(yōu)條件下，同時(shí)培養(yǎng)3種菌株。

2結(jié)果與分析

2.1質(zhì)粒pEB03-P43-SD-metI構(gòu)建

以BacilluscereusEN34基因組為模板，擴(kuò)增metI，電泳分析得出，片段大小為1113bp。以枯草芽孢桿菌基因組DNA為模板，擴(kuò)增P43強(qiáng)啟動(dòng)子，經(jīng)10%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果表明，擴(kuò)增片段大小約為450bp（含SD序列）。用T4連接酶連接pEB03質(zhì)粒酶切產(chǎn)物與P43-SD，對(duì)連接成功的菌株提取質(zhì)粒pEB03-P43-SD，重組連接此質(zhì)粒酶切產(chǎn)物與metI片段，轉(zhuǎn)化S17-1感受態(tài)細(xì)胞后挑取菌落，培養(yǎng)，電泳分析結(jié)果（圖3）表明，在選取的13個(gè)菌株中，有2個(gè)菌株（8號(hào)和11號(hào)）中獲得metI序列，片段大小與預(yù)期一致，約1000bp。證明質(zhì)粒pEB03-P43-SD-metI構(gòu)建成功。

2.2電擊轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pEB03-P43-SD-metI

將質(zhì)粒pEB03-P43-SD-metI電擊轉(zhuǎn)化到BacilluscereusEN34感受態(tài)細(xì)胞后，挑取獲得的菌株，利用PCR法驗(yàn)證是否有P43強(qiáng)啟動(dòng)子（大約400bp）。經(jīng)電泳分析，獲得8株轉(zhuǎn)化成功的菌株，為與出發(fā)菌株對(duì)照，分析了檢驗(yàn)轉(zhuǎn)化成功的1株菌株、出發(fā)菌株、質(zhì)粒pEB03-P43-SD-metIP43序列擴(kuò)增電泳圖，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，出發(fā)菌株沒(méi)有擴(kuò)增出P43序列，而轉(zhuǎn)化成功的菌株與質(zhì)粒pEB03-P43-SD-metI的P43擴(kuò)增成功，在約450bp處均有明顯的條帶。

2.3構(gòu)建質(zhì)粒pKVM1：：metK′

以BacilluscereusEN34基因組為模板，metK1F/R、metK2F/R為引物擴(kuò)增出metK基因完整序列，經(jīng)測(cè)序分析，全長(zhǎng)約1095bp。用引物metKUF/R、metKDF/R擴(kuò)增相應(yīng)片段，2個(gè)片段大小均約為300bp。2個(gè)片段重組連接后命名為metK′，大小約為600bp。將pKVM1酶切產(chǎn)物與2個(gè)片段重組連接，形成pKVM1：：metK′，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞S17-1。經(jīng)驗(yàn)證，質(zhì)粒pKVM1：：metK′中含有metK′，說(shuō)明質(zhì)粒構(gòu)建成功，見(jiàn)圖5中8號(hào)樣品電泳結(jié)果。

2.4改變BacilluscereusEN34metK基因

提取質(zhì)粒pKVM1：：metK′，電擊轉(zhuǎn)化到BacilluscereusEN34感受態(tài)細(xì)胞中。電轉(zhuǎn)化后涂布含有Amp、IPTG、X-gal的平板中。質(zhì)粒pKVM1上含有β-半乳糖苷酶基因，并含有Amp抗性，因此電轉(zhuǎn)化成功的轉(zhuǎn)化子在X-gal存在的情況下能夠顯藍(lán)色。挑選5株藍(lán)色轉(zhuǎn)化子進(jìn)行單交換培養(yǎng)，挑取白色菌落。質(zhì)粒pKVM1上帶有的Amp抗性，即使發(fā)生單交換，其Amp抗性仍存在（BacilluscereusEN34原始菌無(wú)Amp抗性）。如果質(zhì)粒與基因組沒(méi)有發(fā)生重組，菌落顯示藍(lán)色，只有白色菌落有可能發(fā)生同源重組[18]。進(jìn)行雙交換試驗(yàn)，沒(méi)有菌株生長(zhǎng)在LB平板上，說(shuō)明發(fā)生雙交換，SAM無(wú)法合成，即使補(bǔ)充適量SAM，菌體也會(huì)死亡，所以最終只能獲得單交換的菌株，單交換僅僅是弱化了metK基因[19]。

以metKUF/R為引物，不同菌株的電泳結(jié)果如圖5所示。選取的5株菌中均含有重組后的metK′基因（約600bp）和約1700bp較弱的metK完整基因，比7號(hào)泳道中BacilluscereusEN34擴(kuò)增的片段稍大，應(yīng)該是metK-metK′結(jié)構(gòu)。電泳圖中2～6號(hào)菌株中出現(xiàn)更大的片段，應(yīng)該有質(zhì)粒插入到metK基因中，質(zhì)粒大小約為11000bp。

2.5蛋氨酸產(chǎn)量分析

將BacilluscereusEN34（pEB03-P43-SD-metI）、BacilluscereusEN34Δ（metK）、BacilluscereusEN34均接種到完全培養(yǎng)基，過(guò)夜培養(yǎng)后接種到發(fā)酵培養(yǎng)基。培養(yǎng)72h后，利用氨基酸分析儀分析發(fā)酵液中蛋氨酸產(chǎn)量（圖6）。BacilluscereusEN34發(fā)酵液中蛋氨酸產(chǎn)量平均值為38.89mg/L，BacilluscereusEN34（pEB03-P43-SD-metI）產(chǎn)量平均值為29.46mg/L。說(shuō)明雖然metI基因增加了拷貝數(shù)，但蛋氨酸產(chǎn)量并沒(méi)有提高。原因可能是發(fā)酵培養(yǎng)基中硫源的量不足，也可能是拷貝數(shù)增加了，但表達(dá)量還未提高。BacilluscereusEN34Δ（metK）產(chǎn)量平均值為79.58mg/L。

2.6培養(yǎng)條件優(yōu)化

針對(duì)BacilluscereusEN34（pEB03-P43-SD-metI）菌株，梯度添加不同濃度的Na2SO4后，蛋氨酸產(chǎn)量有明顯上升（圖7），當(dāng)Na2SO4添加量達(dá)到15g/L時(shí)，蛋氨酸產(chǎn)量達(dá)到最大值。由數(shù)據(jù)計(jì)算結(jié)果可知，此時(shí)蛋氨酸產(chǎn)量達(dá)26.53mg/L，與“2.5”節(jié)中結(jié)果一致。說(shuō)明增加有強(qiáng)啟動(dòng)子P43的表達(dá)質(zhì)粒，沒(méi)有強(qiáng)化硫酸鈉的代謝通路，須要進(jìn)一步加強(qiáng)表達(dá)整個(gè)通路中的其他酶。Na2SO4濃度高于15g/L時(shí)蛋氨酸產(chǎn)量變化不大，因此Na2SO4最佳添加量為15g/L。圖8展現(xiàn)的是Na2SO4對(duì)BacilluscereusEN34Δ（metK）菌株的影響，當(dāng)Na2SO4添加濃度達(dá)到15g/L時(shí)，蛋氨酸產(chǎn)量達(dá)到最大值，為151.8mg/L。

如圖9所示，梯度添加甲基硫醇鈉和二甲基硫醚混合物，添加量從0到200μL/L，蛋氨酸產(chǎn)量迅速增加。添加量從200到350μL/L，蛋氨酸產(chǎn)量上升幅度極小，因此此混合物添加量選擇200μL/L，此時(shí)蛋氨酸產(chǎn)量為159.5mg/L。甲基硫醇鈉的利用，需要一定比例的二甲基硫醚配合才能發(fā)揮它的作用。甲基硫醇鈉在發(fā)酵過(guò)程中，主要提供硫源和甲基源[20]。

在優(yōu)化試驗(yàn)中，將2類硫源都加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，即200μL甲基硫醇鈉和二甲基硫醚的混合物、15g/L的Na2SO4。蛋氨酸產(chǎn)量如圖10所示，[JP2]BacilluscereusEN34出發(fā)菌株的產(chǎn)量為22.24mg/L，metK基因表達(dá)弱化的菌株產(chǎn)量為440.66mg/L，相當(dāng)于出發(fā)菌株的20倍。進(jìn)一步說(shuō)明metK基因缺失或表達(dá)弱化阻止了蛋氨酸向S-腺苷蛋氨酸的轉(zhuǎn)變，增加了蛋氨酸產(chǎn)量。而B(niǎo)acilluscereusEN34（pEB03-P43-SD-metI）菌株蛋氨酸[JP2]產(chǎn)量反而更低，進(jìn)一步證明metI單獨(dú)增強(qiáng)，不會(huì)提高蛋氨酸產(chǎn)量。

3討論

BacilluscereusEN34是在實(shí)驗(yàn)室篩選獲得的一株野生型菌株，產(chǎn)少量蛋氨酸。蛋氨酸代謝通路復(fù)雜，存在較多反饋抑制，為提高蛋氨酸產(chǎn)量，本試驗(yàn)從2個(gè)方向分析，改變metI、metK2個(gè)基因?qū)Φ鞍彼岙a(chǎn)量的影響[21]。加強(qiáng)MetI催化向蛋氨酸的反應(yīng)，減弱或阻止metK催化蛋氨酸向SAM的轉(zhuǎn)化。加強(qiáng)metI，采用導(dǎo)入表達(dá)質(zhì)粒pEB03，連接強(qiáng)啟動(dòng)子P43。P43來(lái)源于枯草芽孢桿菌，與BacilluscereusEN34同屬于芽孢桿菌，易于強(qiáng)化所連接基因的表達(dá)。馬磊等增強(qiáng)啟動(dòng)子P43構(gòu)建了pYG43穿梭表達(dá)載體，成功提高了宿主體內(nèi)堿性纖維素酶活性的5～7倍[22]。本次試驗(yàn)，如果pEB03-P43-SD-metI轉(zhuǎn)化到BacilluscereusEN34中能提高蛋氨酸產(chǎn)量，后期可設(shè)計(jì)試驗(yàn)重組質(zhì)粒上的P43強(qiáng)啟動(dòng)子到BacilluscereusEN34基因組metI基因前面，再去除質(zhì)粒。此次試驗(yàn)是對(duì)加強(qiáng)metI基因?qū)Φ鞍彼岙a(chǎn)量的影響探索。但本試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，單獨(dú)加強(qiáng)metI的表達(dá)，不能提高蛋氨酸產(chǎn)量。減弱或阻止metK的表達(dá)，采用改變metK基因，試驗(yàn)順利構(gòu)建成穿梭性質(zhì)粒pKVM1：：metK′載體，并轉(zhuǎn)化到BacilluscereusEN34。雙交換未獲得，這與文獻(xiàn)[19]中報(bào)道的一致，雙交換徹底破壞了metK，無(wú)法合成SAM，導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)。試驗(yàn)中為彌補(bǔ)這一現(xiàn)象，培養(yǎng)基中補(bǔ)充適量的SAM，但菌體仍然無(wú)法生長(zhǎng)。說(shuō)明metK的表達(dá)只能弱化，不能刪除。metK′與metK的重組，導(dǎo)致metK基因序列發(fā)生改變，對(duì)于其表達(dá)產(chǎn)物也會(huì)產(chǎn)生影響，理解為弱化表達(dá)，試驗(yàn)結(jié)果表明metK的弱化有利于蛋氨酸的積累。

甲基硫醇鈉和二甲基硫醚都是還原性硫源，可以在代謝通路中直接轉(zhuǎn)為O-乙酰高絲氨酸，通過(guò)O-乙酰高絲氨酸巰基酶（MetY）催化O-乙酰高絲氨酸生成蛋氨酸[20]。Na2SO4進(jìn)入細(xì)胞后經(jīng)一系列反應(yīng)[21]，生成H2S，再經(jīng)metI催化與琥珀酰高絲氨酸反應(yīng)形成L-高半胱氨酸，最終轉(zhuǎn)為蛋氨酸。相當(dāng)于前者是直接硫源，后者是間接硫源。試驗(yàn)結(jié)果表明，2種硫源同時(shí)加入，有利于提高蛋氨酸產(chǎn)量。

4結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建表達(dá)載體質(zhì)粒pEB03-P43-SD-metI、穿梭質(zhì)粒pKVM1：：metK′，電轉(zhuǎn)化等流程，成功將metI基因與強(qiáng)啟動(dòng)子P43連接到表達(dá)質(zhì)粒pEB03中，并轉(zhuǎn)化到BacilluscereusEN34，使metI表達(dá)加強(qiáng);另成功將metK部分基因插入到穿梭質(zhì)粒pKVM1中，轉(zhuǎn)化到BacilluscereusEN34發(fā)生重組，弱化metK的表達(dá)。通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基硫源，得出最佳硫源為2種：200μL/L甲基硫醇鈉和二甲基硫醚的混合物、15g/L的Na2SO4。試驗(yàn)也確定單獨(dú)增強(qiáng)metI基因不能提高蛋氨酸產(chǎn)量，而改變metK基因可以增加蛋氨酸產(chǎn)量，但不能完全去除metK基因，會(huì)導(dǎo)致菌株死亡。本試驗(yàn)結(jié)果可以為后期繼續(xù)改造芽孢桿菌與提高蛋氨酸產(chǎn)量提供技術(shù)支持和數(shù)據(jù)參考。

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