朱燕燕，馬桂娟，龔慧

寧夏回族自治區(qū)食品檢測(cè)研究院（銀川 750001）

近年來(lái)，補(bǔ)腎壯陽(yáng)及緩解疲勞類(lèi)保健食品中非法添加5型磷酸二酯酶抑制劑（Phosphodiesterase-5，PDE-5）現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生。PDE-5中僅有西地那非、他達(dá)拉非、伐地那非批準(zhǔn)上市，均為處方類(lèi)藥物，是臨床上治療男性勃起障礙的常用藥[1]。臨床上，PDE-5有嚴(yán)格的服用限量要求，消費(fèi)者長(zhǎng)期服用這些違禁保健食品，對(duì)人體健康造成嚴(yán)重威脅。

目前，PDE-5在保健食品中的檢測(cè)手段主要有理化鑒別法、免疫法、近紅外光譜法、薄層色譜法、顯微共聚焦拉曼光譜法、高效液相色譜法[2-8]。理化鑒別法、免疫法、近紅外光譜法、薄層色譜法、顯微共聚焦拉曼光譜法及高效液相色譜法預(yù)處理比較簡(jiǎn)單，但其靈敏度低，選擇性差，可能會(huì)造成假陽(yáng)性。HPLCMS/MS法具有靈敏度高、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，成為保健食品等基質(zhì)復(fù)雜樣品的痕量物質(zhì)確證的首選方法。國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局制定相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)指導(dǎo)此類(lèi)物質(zhì)的檢測(cè)[9]，但檢測(cè)保健食品時(shí)應(yīng)用該方法存在線(xiàn)性不好、回收率不高等情況，并且隨著檢測(cè)手段和儀器的不斷發(fā)展，標(biāo)準(zhǔn)中的一些儀器參數(shù)及操作步驟需要進(jìn)一步優(yōu)化。試驗(yàn)旨在優(yōu)化HPLC-MS/MS法同時(shí)檢測(cè)11種壯陽(yáng)類(lèi)非法添加藥物的方法并做出方法學(xué)的論證，為標(biāo)準(zhǔn)修訂及有效監(jiān)控保健食品中非法添加提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

保健食品（市售）。

11種那非類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)品（伐地那非、那紅地那非、紅地那非、羥基豪莫西地那非、西地那非、豪莫西地那非、氨基他達(dá)拉非、他達(dá)拉非、硫代艾地那非、偽伐地那非、那莫西地那非對(duì)照品，德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司，純度＞99%）；甲醇、乙腈（色譜純，Thermo Fisher公司）；甲酸（色譜純，德國(guó)Sigma公司）；超純水（美國(guó)Milli-Q超純水系統(tǒng)純化）。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（6410，美國(guó)Agilent公司，配有AJS ESI離子源及Mass Hunter數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)）；超聲機(jī)（B2200S-7，上海必能信超聲有限公司）；氮吹儀（EVA50A，北京普利泰科有限公司）；分析天平（BT25S，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；Milli-Q超純水儀（美國(guó)Millinpore公司）。

1.3 分析條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse plus C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）；流速0.30 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣體積10 μ L；運(yùn)行時(shí)間20 min；流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液；流動(dòng)相B為0.1%甲酸乙腈溶液；梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 液相色譜梯度洗脫程序

1.3.2 質(zhì)譜條件

離子源，電噴霧離子源；掃描模式，正離子掃描；反應(yīng)方式，MRM（多反應(yīng)監(jiān)測(cè)）模式；鞘氣溫度350 ℃，流速10.0 L/min；霧化器壓力40 psi；毛細(xì)管電壓4 kV，具體參數(shù)詳見(jiàn)表2。

表2 11種壯陽(yáng)類(lèi)物質(zhì)的質(zhì)譜優(yōu)化參數(shù)

1.4 試驗(yàn)步驟

1.4.1 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱(chēng)取11種那非對(duì)照品，各10 mg左右，置于10 mL容量瓶中，用乙腈制成約1.0 mg/mL的單標(biāo)溶液。分別精密量取1.0 mL 11種標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于100 mL容量瓶中，用乙腈稀釋成10.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。同法將混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液分別稀釋至0.010，0.025，0.050，0.100，0.200，0.500，1.000和2.000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.4.2 樣品前處理

稱(chēng)取2.0 g（精確至0.02 g）樣品于50 mL容量瓶中，加入30 mL乙腈后超聲10 min，冷卻至室溫，用乙腈定容至刻度。用移液管準(zhǔn)確移取2.0 mL定容液于試管中，40 ℃氮吹至干，用初始流動(dòng)相（0.1%甲酸水溶液與0.1%甲酸乙腈溶液體積比80∶20）定容至2.0 mL，渦旋混勻，經(jīng)0.22 μ m水相濾膜過(guò)濾，上機(jī)待測(cè)。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作

分別準(zhǔn)確移取0.010，0.025，0.050，0.100，0.200，0.500，1.000和2.000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液各100 μ L，準(zhǔn)確移取空白基質(zhì)提取液各900 μL稀釋成濃度為1.0，2.5，5.0，10.0，20.0，50.0，100.0和200.0 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。上機(jī)測(cè)定，記錄數(shù)據(jù)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.4.4 加標(biāo)回收率試驗(yàn)及精密度試驗(yàn)

按照1.4.2的方法制備3份樣品溶液，分別向其中加入200 μ L 10.0 μ g/mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液、200和400 μ L 1.0 μ g/mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，分別同時(shí)制備10組平行樣，其余步驟同上，記錄數(shù)據(jù)，計(jì)算回收率及RSD。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

由于11種那非的分子結(jié)構(gòu)中均含有氨基，因此均采用正離子模式對(duì)其進(jìn)行電離。分別對(duì)濃度為1.0 μg/mL的各目標(biāo)化合物進(jìn)行單針進(jìn)樣，對(duì)其質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化。當(dāng)目標(biāo)化合物進(jìn)入一級(jí)質(zhì)譜后，可以產(chǎn)生穩(wěn)定的[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰。對(duì)準(zhǔn)分子離子峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，得到子離子的質(zhì)量數(shù)，在MRM（多反應(yīng)監(jiān)測(cè)）模式下優(yōu)化碰撞能等參數(shù)，使得子離子達(dá)到最佳響應(yīng)。為11種那非類(lèi)分別選取質(zhì)譜響應(yīng)最佳的2對(duì)MRM離子對(duì)及相應(yīng)的參數(shù)作為最終質(zhì)譜采集參數(shù)，詳見(jiàn)表2。采集得到的MRM色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 11種那非類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)品的MRM色譜圖

2.2 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是在提取基質(zhì)中的目標(biāo)組分時(shí)，基質(zhì)中的干擾物影響目標(biāo)組分的離子化，使得目標(biāo)組分在儀器上的響應(yīng)發(fā)生增強(qiáng)或者抑制效應(yīng)的現(xiàn)象[10]，影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性?？疾斓?1種那非類(lèi)化合物在保健品中均有基質(zhì)抑制效應(yīng)。為提高目標(biāo)化合物測(cè)量的準(zhǔn)確度，該方法使用空白基質(zhì)提取液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，降低基質(zhì)干擾的影響。

2.3 方法的線(xiàn)性范圍和檢出限

將系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液分別進(jìn)行測(cè)定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，定量離子峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。結(jié)果表明，11種那非在1.0～200.0 ng/mL的范圍內(nèi)，其濃度與各待測(cè)物的峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。11種添加物的線(xiàn)性回歸方程、線(xiàn)性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限（信噪比S/N≥3）見(jiàn)表3。

表3 11種那非類(lèi)物質(zhì)的線(xiàn)性回歸方程，相關(guān)系數(shù)，線(xiàn)性范圍和檢出限

2.4 方法的準(zhǔn)確度和精密度

由不含目標(biāo)組分的保健品作為空白樣品進(jìn)行3個(gè)水平的加標(biāo)回收率試驗(yàn)，加標(biāo)濃度水平分別為0.1，0.2和1.0 mg/kg，其中伐地那非的回收率范圍為72.6%～108.6%，紅地那非的回收率范圍為86.5%～120.7%，那紅地那非的回收率范圍為83.7%～116.5%，豪莫西地那非的回收率范圍為77.6%～116.4%，枸櫞酸羥基豪莫西地那非的回收率范圍為85.4%～116.4%，西地那非的回收率范圍為82.3%～114.7%，氨基他達(dá)拉非的回收率范圍為86.5%～111.5%，硫代艾地那非的回收率范圍為62.5%～79.4%，他達(dá)拉非的回收率范圍為83.2%～120.1%，偽伐地那非的回收率范圍為82.1%～106.3%，那莫西地那非的回收率范圍為85.5%～108.2%。其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為4.2%～9.5%，其精密度符合方法學(xué)要求。11種那非類(lèi)的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差的數(shù)據(jù)見(jiàn)表4。

表4 11種那非類(lèi)回收率及精密度試驗(yàn)

2.5 色譜條件的優(yōu)化

11種那非在不同的流動(dòng)相中分離程度不同，對(duì)比三種流動(dòng)相甲醇-乙酸銨溶液，乙腈-乙酸銨溶液，甲酸乙腈-甲酸水溶液。通過(guò)試驗(yàn)，各待測(cè)物在甲酸乙腈-甲酸水溶液流動(dòng)相中的分離度及峰型良好。因此，選擇0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相；在Agilent ZORBAX Eclipse plus C18色譜柱，通過(guò)梯度洗脫對(duì)11種添加物進(jìn)行分離，目標(biāo)化合物的保留時(shí)間在5～15 min之間。

2.6 樣品測(cè)定

采用該方法對(duì)市售保健品進(jìn)行測(cè)定，隨機(jī)采購(gòu)50個(gè)批次市售保健酒及功能性飲料，其中49個(gè)批次未檢測(cè)出，1個(gè)批次的人參酒中檢測(cè)出西地那非，樣品譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 人參酒樣品的色譜圖

3 結(jié)論

采用乙腈直接提取，同時(shí)測(cè)定保健食品中11種那非的含量。該法簡(jiǎn)單、可靠、重現(xiàn)性好、靈敏度高，適用于保健品基質(zhì)樣品中11種壯陽(yáng)類(lèi)物質(zhì)的同時(shí)檢測(cè)。