葉曉利，康文懷，李巧玲，李慧，秦玲

河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院（石家莊 050018）

葉酸（Folic acid，F(xiàn)A或Folate）又稱維生素B9，是天然存在的葉酸的總稱，是人體正常發(fā)育和生長(zhǎng)所必需的B族水溶性維生素，由喋啶（Pteridine）、對(duì)氨基苯甲酸（p-aminobenzoate）和帶有一個(gè)或多個(gè)谷氨酸鹽（Glutamate tail）三部分組成，葉酸分子結(jié)構(gòu)及其衍生物如圖1所示。葉酸是人體內(nèi)關(guān)鍵的輔助因子，在核酸、蛋白質(zhì)、甲硫氨酸、絲氨酸等生物合成和代謝的單碳轉(zhuǎn)移反應(yīng)中充當(dāng)輔酶[1-2]，其缺乏可以增加許多疾病的風(fēng)險(xiǎn)，如誘發(fā)神經(jīng)管缺陷、脊柱裂、無(wú)腦畸形[3]、心血管疾病、兒童白血病[4]、巨幼紅細(xì)胞性貧血[5]、老年人的神經(jīng)認(rèn)知衰退以及某些類型的癌癥等[6-7]，懷孕期間攝入葉酸可有效降低新生兒神經(jīng)管缺陷的發(fā)生[8]。

圖1 葉酸分子結(jié)構(gòu)及其衍生物

人體自身不能合成葉酸，必須從日常膳食中獲得[9]，因此有必要尋找富含葉酸的食物。天然葉酸來(lái)源有綠葉蔬菜、豆類、谷類、水果、堅(jiān)果、肝臟等[10-12]。水果是一類容易得到、加工簡(jiǎn)單或無(wú)需加工的日常食物，且富含水分和各種維生素，天然葉酸的含量相對(duì)較高。盡管許多食物含有豐富的天然葉酸，但葉酸不穩(wěn)定，受溫度、紫外線、溶液pH、儲(chǔ)存時(shí)間、氧等因素影響[13-14]，因此需要對(duì)葉酸的穩(wěn)定性進(jìn)行分析。檢測(cè)葉酸的常用方法有微生物法[15]、熒光檢測(cè)法[16]、高效液相色譜法，微生物法能檢測(cè)葉酸及衍生物的總量，但高效液相色譜法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法能測(cè)出單種葉酸的含量[17]，且快速、靈敏度高。試驗(yàn)以常見(jiàn)的10種水果為原料，采用三酶法[18]提取水果中的葉酸（PteGlu）、四氫葉酸（H4PteGlu）、5-甲基-四氫葉酸（5-CH3-H4PteGlu），通過(guò)HPLCMS/MS進(jìn)行測(cè)定，并選取不同的溫度、處理時(shí)間、pH進(jìn)行穩(wěn)定性研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

水果（市售）；PteGlu、H4PteGlu、5-CH3-H4Pte-Glu、LC-MS級(jí)乙腈、甲酸（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；2-巰基乙醇（成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司）；抗壞血酸（天津市大茂化學(xué)試劑產(chǎn)）；二硫蘇糖醇（DTT）：麥克林化學(xué)試劑有限公司；蛋白酶（鏈絲菌蛋白酶E）、α-淀粉酶（美國(guó)Merck公司）；未過(guò)濾的大鼠血清、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、磷酸氫二鉀（K2HPO4）、活性炭：中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

安捷倫1290高效液相色譜-安捷倫G6420三重串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀（安捷倫科技有限公司）；TGL-16高速冷凍離心機(jī)（湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；MHY-22769旋渦振蕩器（北京美華儀科技有限公司）；ME104E電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；ZWY-100H/240恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

用50 mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH 7，含有1%的抗壞血酸和0.2% DTT[19]）制備0.1 mg/mL的3種葉酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，作為儲(chǔ)備液，再用緩沖液配制PteGlu、H4PteGlu和5-CH3-H4PteGlu的系列質(zhì)量濃度：10，20，40，60，80和100 ng/mL。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：Aglient UPLC Poroshell C18柱（75 mm×2.1 mm×1.7 μ m）。流動(dòng)相：A為0.1%甲酸-水溶液，B為0.1%甲酸-乙腈溶液。流速：0.2 mL/min。進(jìn)樣量：1 μL。梯度洗脫程序：0～1 min（10% B），1～5 min（10%～80% B），5～10 min（80%～10% B），10～13 min（10% B）。柱溫：30 ℃。

1.3.3 質(zhì)譜條件

電噴霧正離子模式，多反應(yīng)檢測(cè)（MRM）模式；電噴霧電壓4 000 V，離子源溫度250 ℃，干燥氣溫度300 ℃，干燥氣流量10 L/min。

1.3.4 樣品的提取及含量的計(jì)算

取2.50 g水果于研缽中，加入5 mL 50 mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH 7，含有1%的抗壞血酸和0.2% DTT）進(jìn)行研磨[20]，之后放入10 mL的試管并在旋渦振蕩器上混勻，將樣品煮沸10 min，冰上冷卻10 min，加入25 μL α-淀粉酶（20 mg/mL）混勻，放置10 min，加入200 μL蛋白酶（4 mg/mL）混勻，放恒溫培養(yǎng)振蕩器中（37 ℃，250 r/min，1 h），煮沸滅菌10 min，冰上快速冷卻20 min，加入100 μL經(jīng)活性炭處理過(guò)的大鼠血清[21]，將樣品于恒溫培養(yǎng)振蕩器中（37 ℃，250 r/min，1 h），冰上冷卻20 min，離心（4 ℃，14 000 r/min，30 min）。取上清液，用超濾管（10 kDa Millipore）在離心機(jī)上過(guò)濾（4 ℃，12 000 r/min，30 min）[13]，取濾液分析。每個(gè)樣品重復(fù)3次，提取全過(guò)程在避光或弱光下進(jìn)行。

提取溶液用HPLC-MS/MS進(jìn)行檢測(cè)，得出的峰面積帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，得提取溶液中葉酸的溶度，并按式（1）計(jì)算葉酸的提取含量。

式中：m為葉酸的提取含量，μg/100 g；c為提取液的質(zhì)量濃度，ng/mL；V為提取液的體積，mL；M為水果的質(zhì)量，g。

1.3.5 葉酸的穩(wěn)定性研究及葉酸回收率計(jì)算

分別用pH為6，7和8的磷酸鉀緩沖液（50 mmol/L，含有1%的抗壞血酸和0.2% DTT）制備1 μg/mL的PteGlu、H4PteGlu和5-CH3-H4PteGlu 3種標(biāo)準(zhǔn)溶液，3種pH不同的標(biāo)準(zhǔn)溶液在室溫（25 ℃）、37 ℃條件下分別放置4，8和12 h和在100 ℃條件下煮沸10，15和20 min，冷卻后進(jìn)行測(cè)定。3種葉酸回收率計(jì)算為處理后檢測(cè)到的葉酸峰面積和未處理葉酸峰面積的百分比，如式（2）所示。

式中：s為處理后葉酸的峰面積；S為未處理葉酸的峰面積。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 17.0軟件進(jìn)行方差分析（Analysis of variance，ANOVE），使用Origin 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜和質(zhì)譜條件的優(yōu)化

試驗(yàn)對(duì)流動(dòng)相（乙腈-水溶液、0.1%乙酸乙腈溶液-0.1%乙酸溶液、0.1%甲酸乙腈溶液-0.1%甲酸溶液）進(jìn)行了考察。結(jié)果表明，流動(dòng)相采用加酸體系有助于化合物的離子化，使響應(yīng)值增大，增加靈敏度；加入甲酸較乙酸分析時(shí)間短，峰形更好，如圖2所示。因此選用0.1%甲酸乙腈溶液-0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相，以獲得更好的分離效果和儀器響應(yīng)。

在電噴霧正離子（ESI+）模式下，對(duì)3種葉酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行稀釋和母離子全掃描，確定各分子離子峰；再以化合物的分子離子為母離子，對(duì)其子離子進(jìn)行全掃描，選擇信噪比高、峰形好、干擾小的離子對(duì)作為定量、定性離子對(duì)，對(duì)子離子的破碎電壓、碰撞能量等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 工作曲線、定量檢出限和回收率

試驗(yàn)以3種葉酸濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制PteGlu、H4PteGlu、5-CH3-H4PteGlu的工作曲線，質(zhì)量濃度為10～100 ng/mL，得到線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)，3種葉酸均有較好的線性關(guān)系。以信噪比（S/N）為3確定檢出限（LOD），以信噪比（S/N）為10確定定量限（LOQ）。取橙子和獼猴桃，加入3種葉酸標(biāo)品，質(zhì)量濃度為40，60和80 ng/mL，按照1.3.4小節(jié)進(jìn)行操作，每個(gè)添加濃度平行3次，計(jì)算平均回收率，結(jié)果如表2所示。檢出限、定量限和回收率

2.3 常見(jiàn)水果中3種葉酸的提取含量

表3表示10種常見(jiàn)水果中PteGlu、H4PteGlu、5-CH3-H4PteGlu的含量。不同的水果PteGlu含量差異較大，含量范圍在3.11～27.33 μg/100 g之間，其中獼猴桃、芒果、香蕉PteGlu含量相對(duì)較多，含量在20 μg/100 g以上，而橙子、檸檬、火龍果、葡萄PteGlu含量相對(duì)較少，含量在6 μg/100 g以下。水果中H4PteGlu的含量，獼猴桃中H4PteGlu的含量明顯多于其他水果，含量約為26.87 μ g/100 g，剩余水果含量在10.65～12.46 μ g/100之間。葡萄中5-CH3-H4PteGlu的含量明顯高于PteGlu、H4PteGlu，含量達(dá)到32.72 μg/100 g。獼猴桃中3種葉酸的總含量最高，達(dá)到63.09 μg/100 g，檸檬的含量最低，含量為27.47 μ g/100 g。

2.4 葉酸的穩(wěn)定性

2.4.1 不同的溫度、時(shí)間、pH對(duì)PteGlu穩(wěn)定性的影響

圖3表示不同的溫度（A室溫、B 37 ℃、C 100℃）、時(shí)間、pH對(duì)PteGlu穩(wěn)定性的影響。由圖3（A）可以看出，在室溫條件下，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，PteGlu的保留率略有減少，不同pH對(duì)PteGlu的穩(wěn)定性有影響，在pH 7和8較pH 6穩(wěn)定。由圖3（B）可以看出，在37 ℃條件下，時(shí)間對(duì)PteGlu穩(wěn)定性的影響不大，PteGlu在pH 7較pH 6和8條件下穩(wěn)定。由圖3（C）可以看出，在100 ℃條件下，PteGlu在pH 7和8條件下保留率在87%以上，在pH 6時(shí)穩(wěn)定性明顯下降，保留率在65%左右，這可能是PteGlu在酸性高溫條件下轉(zhuǎn)化為葉酸的其他衍生物[22]。

圖3 不同的溫度、時(shí)間、pH對(duì)PteGlu穩(wěn)定性的影響

2.4.2 不同的溫度、時(shí)間、pH對(duì)H4PteGlu穩(wěn)定性的影響

圖4 不同的溫度、時(shí)間、pH對(duì)H4PteGlu穩(wěn)定性的影響

圖4 表示不同的溫度（A室溫、B 37 ℃、C 100℃）、處理時(shí)間、pH對(duì)H4PteGlu穩(wěn)定性的影響。由圖4（A和B）可以看出，在室溫和37 ℃條件下，時(shí)間對(duì)H4PteGlu的穩(wěn)定性影響較小，但pH對(duì)H4PteGlu的穩(wěn)定性較大，pH在6時(shí)，H4PteGlu的保留率在90%以上。在100 ℃條件下，隨著煮沸時(shí)間的延長(zhǎng)，H4PteGlu保留率逐漸降低，且在pH 6較pH 7和8穩(wěn)定。H4PteGlu不穩(wěn)定可能是H4PteGlu在中性或弱堿性條件下轉(zhuǎn)化成5，10-CH2-H4PteGlu或H2PteGlu[13]。

2.4.3 不同的溫度、時(shí)間、pH對(duì)5-CH3-H4PteGlu穩(wěn)定性的影響

圖5表示不同的溫度（A室溫、B 37 ℃、C 100℃）、時(shí)間、pH對(duì)5-CH3-H4PteGlu穩(wěn)定性的影響。在pH 6的條件下，5-CH3-H4PteGlu在不同溫度和時(shí)間下都很穩(wěn)定，保留率在95%以上，但不同的pH對(duì)5-CH3-H4PteGlu穩(wěn)定性的影響較大，這可能是5-CH3-H4PteGlu在中性和偏堿性條件下轉(zhuǎn)換為5-CH3-5，6-H2PteGlu，使其保留率下降[23]。

圖5 不同的溫度、時(shí)間、pH對(duì)5-CH3-H4PteGlu穩(wěn)定性的影響

3 結(jié)論

試驗(yàn)建立了HPLC-MS/MS測(cè)定水果中葉酸、四氫葉酸、5-甲基-四氫葉酸的方法。該方法靈敏度高、檢出限低，5-甲基-四氫葉酸的檢出限為1 ng/mL，葉酸、四氫葉酸的檢出限均為2 ng/mL，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99，平均回收率在59.34%～65.67%之間。研究發(fā)現(xiàn)，10種水果中3種葉酸的含量差異較大，葉酸的含量范圍在3.11～27.33 μ g/100 g之間，四氫葉酸的含量范圍在10.65～26.87 μg/100 g之間，5-甲基-四氫葉酸的含量范圍在8.33～32.72 μg/100 g之間，3種葉酸的總含量的大小為獼猴桃＞香蕉＞芒果＞葡萄＞梨＞橙子＞蘋果＞桔子＞火龍果＞檸檬。pH對(duì)3種葉酸穩(wěn)定性的影響較大，溫度和時(shí)間影響相對(duì)較小，葉酸在pH 7較穩(wěn)定，四氫葉酸和5-甲基-四氫葉酸在pH 6較穩(wěn)定。該研究為人們合理攝入葉酸提供參考依據(jù)，也為葉酸及衍生物的分析提供技術(shù)支持。