范小龍，吳婉琴，曾妮，黎星，黃坤，王會霞

湖北省食品質量安全監(jiān)督檢驗研究院，湖北省食品質量安全檢測工程技術研究中心（武漢 430000）

隨著對養(yǎng)生保健日趨重視，保健食品種類越來越多，然而市場競爭加劇，保健品的促銷方向出現(xiàn)向保健品中非法添加化合物的情況[1]，以暫時的速效、高效或特效，謀取高額非法利潤，致使患者出現(xiàn)嚴重不良反應，甚至導致死亡，其中補腎壯陽類保健品是那非類藥物違規(guī)添加的重點[2-4]。那非類藥物是一種壯陽的精神類藥物，西地那非等均屬于磷酸二酯酶5（PDE5）抑制劑的處方藥，1998年經(jīng)美國食品藥品監(jiān)督管理局批準，是治療男子陰莖勃起功能障礙（ED）有效藥物，但長期或超劑量服用易對心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等造成嚴重損傷[5]，國家嚴禁在保健食品中違規(guī)添加。

那非類物質檢測標準主要是液相串聯(lián)質譜方法，液相色譜方法較少[6]。《藥品檢驗補充檢驗方法和檢驗項目批準編2009030》中講述的是液相方法，但其方法過于陳舊，且部分那非物質并沒有良好的分離度，那非類藥物檢測最新的方法為《市場監(jiān)管總局關于發(fā)布〈食品中那非類物質的測定〉食品補充檢驗方法的公告》[7]，其中方法一規(guī)定的為液相串聯(lián)質譜法，方法二為液相串聯(lián)質譜-高分辨質譜方法，均為質譜方法，質譜方法檢出限低、檢測更靈敏。試驗前期對收集的陽性樣品檢測，發(fā)現(xiàn)那非類物質的添加量很高，因此用質譜測定時需要稀釋數(shù)萬倍甚至百萬倍，若稀釋倍數(shù)不當直接進行質譜測試，則會污染質譜，試驗表明西地那非容易殘留于質譜中；同時，反復稀釋容易造成定量誤差。因此，建立同時測定13種那非類物質的液相色譜定量及液相串聯(lián)質譜定性的分析方法將有助于解決這一問題。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Waters e2695高效液相色譜；Waters PDA 2998紫外檢測器；Waters TQ-S型超高液相色譜-串聯(lián)質譜儀；Talboys渦旋儀；Elma超聲儀。

超純水；乙腈、甲醇、乙酸、乙酸銨（色譜級，F(xiàn)isher公司）；標準物質（詳細信息見表1）：那紅地那非、紅地那非、伐地那非、羥基豪莫西地那非、西地那非、豪莫西地那非、氨基他達那非、他達那非、硫代艾地那非、偽伐地那非、那莫西達那非（含量≥98%，中國食品藥品檢定研究院）；去甲基他達那非、硫代西地那非（含量≥99.5%，TRC公司）。

表1 那紅地那非等13種物質相關信息

1.2 樣品

10種聲稱具有抗疲勞、提高免疫力保健食品，10種保健酒。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的制備

1.3.1.1 固體樣品

片劑：樣品研細、混勻；膠囊：直接混勻，稱取約0.5 g一次口服劑量，置于50 mL容量瓶中，加入乙腈，超聲20 min溶解，放至室溫，用乙腈定容至刻度，混勻后過0.22 μ m濾膜，待上機。

1.3.1.2 液體樣品

直接稱取約10 g一次口服劑量，置于100 mL容量瓶中，加入乙腈，超聲20 min溶解，放至室溫，用乙腈定容至刻度，混勻后過0.22 μm濾膜，待上機。

1.3.2 標準溶液制備

1.3.2.1 標準儲備液

分別精密稱取適量13種標準品置于10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，搖勻，制成質量濃度約2 mg/mL標準儲備液，于-20 ℃保存，有效期3個月。

1.3.2.2 混合標準中間工作液

分別精密吸取適量標準儲備液，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，制成質量濃度41.65 μg/mL西地那非、18.8 μg/mL紅地那非、43.05 μg/mL那莫西達那非、38.32 μg/mL去甲基他達那非、39.375 μg/mL硫代西地那非、其他8種質量濃度40.75 μ g/mL的混合標準中間液。

1.3.2.3 混合標準工作液

取適量混合標準中間液，用乙腈稀釋至樣品檢測的濃度。

1.3.3 色譜條件

色譜柱，Waters Symmetry Shield C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A，乙腈；流動相B，20 mmol/L乙酸銨水溶液（含0.1%乙酸），梯度見表2，柱溫35℃，進樣量10 μL。

表2 流動相梯度程序

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇

比較Waters Symmetry Shield C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）和Waters XBridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱對13種那非類的分離效果，在同一流動相條件下，其中羥基豪莫西地那非和氨基他達那非最大吸收波長均在290 nm左右，在XBridge色譜柱上色譜峰疊加在一起，始終無法分離，而在Symmetry Shield C18色譜柱上均能實現(xiàn)良好分離，而且靈敏度更高，峰形更尖銳，高液相色譜圖及各物質最大吸收波長見圖1。因此試驗選用Waters Symmetry Shield C18色譜柱作為分離色譜柱。

2.1.2 流動相的選擇

試驗比較乙腈-純水、乙腈-20 mmol/L乙酸銨溶液（0.1%乙酸）和乙腈-20 mmol/L乙酸銨溶液（0.1%甲酸）3種流動相體系分離效果。采用乙腈-水時，13種那非類化合物，峰形拖尾，導致分離度不理想；采用乙腈乙腈-20 mmol/L乙酸銨溶液（0.1%甲酸）時，其中硫代艾地那非和偽伐地那非無法分離；采用乙腈-20 mmol/L乙酸銨溶液（0.1%乙酸）時，13種那非類均有良好的分離度和峰形。因此試驗選擇乙腈-20 mmol/L乙酸銨溶液（0.1%乙酸）作為流動相。

2.2 標準曲線、線性范圍、方法檢出限及方法定量限

配制系列的混合標準溶液，以各分析物的峰面積（Y）和相應的質量濃度（X，μg/mL）繪制標準曲線，得到線性回歸方程。結果表明，各目標化合物在線性范圍內13種那非類的線性關系良好；配制標準溶液混標，用空白基質溶液稀釋到適量濃度，以儀器3倍和10倍信噪比確定方法檢出限和方法定量限，結果見表3。

2.3 回收率和精密度

以空白基質樣品進行低（1倍定量限）、中（5倍定量限）、高（10倍定量限）3個水平加標回收試驗，每個水平測定6次，結果見表4。結果表明，13種那非類的平均回收率為92.64%～109.17%，相對標準偏差（RSD）為0.75%～5%。說明該方法具有良好的準確度和精密度。

2.4 實際樣品分析

應用該方法對市售的保健食品（標稱具有抗疲勞功效）共計20份進行測定，其中6份均檢測出西地那非，含量為10～20 mg/g；1份樣品檢測出他達那非，含量為3.71 mg/g；1份樣品檢測出伐地那非，含量為2.83 mg/g；剩余12份未檢出那非類，見圖2。在測定時有2份樣品在液相色譜圖上出現(xiàn)保留時間和紫外光譜圖和西地那非標準色譜圖一樣的峰，由于含量在檢出限附近，最后通過超高液相串聯(lián)質譜的確證，確定該樣品中含有西地那非。

圖1 13種化合物液相色譜圖及其紫外吸收光譜圖

表3 13種那非類物質的標準曲線、線性范圍、方法檢出限、方法定量限

表4 13種那非類物質的回收率及精密度

圖2 陰性樣品液相色譜圖及不同陽性樣品色譜圖

3 結論

在測定保健食品樣品時，13種那非類中西地那非檢出率最高，約30%，主要原因可能是西地那非是當前市場上流行的治療勃起功能障礙的口服速效處方藥，且價格低廉，質量有保證，故被不良廠商非法添加到保健食品，以達到速效、高效的保健、滋補、壯陽、強身等目的，從而拓展銷路且非法牟利[8]。為打擊不良廠商在保健食品中非法添加那非類物質，試驗建立高效液相色譜同時分離測定13種那非類物質及采用液相色譜串聯(lián)質譜對不確定的陽性樣品進行快速確證的分析方法，該方法操作簡單、靈敏度高，可滿足保健食品中那非類物質非法添加的檢測要求，為保健食品中那非類藥物非法添加監(jiān)管理提供檢測技術。