胡貝，李麗霞，劉紅，黃偉，李曉健

湖北省藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院（武漢 430075）

合成著色劑是在食品生產(chǎn)加工過程中，為改善食品色澤、增進(jìn)人的食欲而添加的一類食品添加劑[1]，多以苯、甲苯、萘等化工產(chǎn)品為原料，經(jīng)過磺化、硝化、偶氮化等一系列有機(jī)反應(yīng)化合而成[2-3]，由于其色澤鮮艷、性質(zhì)穩(wěn)定、成本低廉等諸多優(yōu)點(diǎn)，迅速得到了廣泛的推廣與應(yīng)用[3-4]。但合成著色劑不僅沒有任何營養(yǎng)價(jià)值，而且絕大多數(shù)對人體有害，毒害作用不僅表現(xiàn)為一般毒性和致瀉性，有些品種還具有致癌性[3]。因而，建立快速、準(zhǔn)確的同時(shí)檢測多種合成著色劑的方法，對于高效監(jiān)管、保障食品安全有著重要意義。

目前，GB 2760—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中明確規(guī)定了各種合成著色劑的使用范圍和使用限量。GB 5009.35—2016及SN/T 1743—2006中分別規(guī)定了食品中7種及4種合成著色劑的檢測方法，其中凈化步驟所使用的聚酰胺粉吸附法操作繁瑣、試劑消耗量大、耗時(shí)長，已不能滿足大批量食品樣品中多種合成著色劑的同時(shí)檢測工作。文獻(xiàn)報(bào)道合成著色劑的檢測方法主要有固相萃取-高效液相色譜法[2,5-18]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[19-21]，其中固相萃取-高效液相色譜法的使用更為廣泛。固相萃取法作為食品檢測中常用的一種前處理方法，對樣品的凈化、富集有著重要的作用。而此前對于檢測食品中多種合成著色劑所適用的固相萃取小柱的篩選報(bào)道較少。因此，試驗(yàn)選擇了4種適用于同時(shí)檢測食品中8種合成著色劑（檸檬黃、日落黃、胭脂紅、莧菜紅、亮藍(lán)、誘惑紅、新紅、酸性紅）的固相萃取小柱進(jìn)行比較，并優(yōu)化色譜條件，建立了一種高效、準(zhǔn)確的測定食品中8種合成著色劑含量的固相萃取-高效液相色譜方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

1260型高效液相色譜儀（安捷倫科技（中國）有限公司）；N-EVAP型氮吹儀（美國Organomation公司）；ST 16型臺式離心機(jī)（德國Thermo公司）；XP 205型電子天平（瑞士梅特勒公司）；VM 24型固相萃取儀（天津博納艾杰爾科技有限公司）；Milli-Q純水機(jī)（德國默克公司）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與試劑

檸檬黃、日落黃、胭脂紅、莧菜紅、亮藍(lán)（中國計(jì)量科學(xué)研究院）；誘惑紅（北京海岸鴻蒙標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)有限責(zé)任公司）；新紅（農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所）；酸性紅（德國Dr. Ehrenstorfer GmbH）。

甲醇（色譜級，德國默克公司）；乙酸銨（優(yōu)級純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；甲酸、氨水（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；試驗(yàn)用水（GB/T 6682規(guī)定的一級水）；Cleanert JXA固相萃取小柱（1 g/6 mL，天津博納艾杰爾科技有限公司）；Cleanert PWAX固相萃取小柱（150 mg/6 mL，天津博納艾杰爾科技有限公司）；WAX固相萃取小柱（150 mg/6 mL，OASIS，Waters公司）；ProElut PWA-2固相萃取小柱（150 mg/6 mL，迪馬科技）；親水PTFE針孔式過濾器（月旭科技（上海）股份有限公司）。

1.3 色譜條件

色譜柱：Thermo AcclaimTM120 C18色譜柱（5 μ m，4.6 mm×250 mm），流速1 mL/min，柱溫30 ℃。檢測波長：檸檬黃、日落黃、胭脂紅、莧菜紅、誘惑紅、新紅均為254 nm；亮藍(lán)為628 nm；酸性紅為520 nm；進(jìn)樣量10 μL，流動相梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序

1.4 溶液配制

1.0 mg/mL酸性紅標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：稱取適量酸性紅標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，搖勻即得。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別量取適量標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，加水定容至刻度，依次配制成質(zhì)量濃度為1.0，5.0，10.0，20.0和50.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.5 樣品處理

1.5.1 提取

液體類或可直接溶于水的樣品，如飲料（含二氧化碳樣品加熱或超聲10 min驅(qū)除二氧化碳）、配制酒（加熱10 min驅(qū)除乙醇）、硬糖等，將樣品均質(zhì)化處理后，準(zhǔn)確稱取約2.0 g樣品于50 mL塑料離心管中，加入20 mL提取液（水-甲醇-甲酸體積比10∶5∶3）（必要時(shí)可40 ℃水浴加熱溶解），混勻后，超聲提取15 min，所得樣液待凈化。

其他半固體或固體樣品，如炒貨食品及堅(jiān)果制品、豆制品、米面及其制品、肉制品、醬腌菜、冰淇淋、雪糕、蜜餞、水果干制品、果醬、水果罐頭等，將樣品均質(zhì)化處理后，準(zhǔn)確稱取約2.0 g樣品于50 mL塑料離心管中，加入20 mL提取液（水-甲醇-甲酸體積比10∶5∶3），混勻后，超聲提取15 min，以5 000 r/min離心10 min，取上清液過濾，所得樣液待凈化。

1.5.2 凈化

將全部樣液轉(zhuǎn)移至經(jīng)5 mL甲醇、5 mL 10%甲酸水溶液活化的ProElut PWA-2固相萃取小柱中，以1.0 mL/min的流速使樣液全部通過固相萃取柱，棄去流出液。用5 mL甲醇淋洗，用5 mL 15%氨化甲醇溶液洗脫并收集，收集液于50 ℃氮?dú)獯抵两?，然后? mL 0.02 mol/L乙酸銨溶液復(fù)溶，過0.45 μ m PTFE濾膜，上機(jī)測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 固相萃取小柱的選擇

試驗(yàn)選擇了4種固相萃取小柱進(jìn)行試驗(yàn)。其中，Cleanert JXA柱為聚酰胺粉成品柱，填料與GB 5009.35—2016中聚酰胺粉使用量相同。Cleanert PWAX柱、WAX柱均為混合型弱陰離子交換柱，具有弱陰離子交換與反相混合機(jī)理，均以水可浸潤型聚合物為基質(zhì)，在pH 0～14范圍內(nèi)穩(wěn)定，對強(qiáng)酸性化合物具有高的選擇性和靈敏度；ProElut PWA-2柱的固定相為含親水基團(tuán)的聚苯乙烯、二乙烯基苯的共聚物，作用基團(tuán)為哌嗪基團(tuán)、苯基、乙烯基和吡咯烷酮基，保留機(jī)理主要為陰離子交換相互作用和非極性相互作用，其次是極性相互作用，主要用于分離純化強(qiáng)酸性化合物。

對4種固相萃取小柱分別進(jìn)行低、中、高濃度（加標(biāo)量為0.5，5.0和10.0 mg/kg）的加標(biāo)回收試驗(yàn)（每組6個平行樣），結(jié)果顯示：使用Cleanert JXA柱進(jìn)行凈化時(shí)，樣液流經(jīng)小柱的速度緩慢，且目標(biāo)化合物不易洗脫，凈化時(shí)間明顯長于其他3種小柱，雖然8種合成著色劑在Cleanert JXA柱上的平均回收率為84.3%～99.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.3%～4.8%，但耗時(shí)長，試劑消耗量多，不能達(dá)到高效凈化的目的。使用WAX柱進(jìn)行凈化，當(dāng)加標(biāo)量為0.5 mg/kg時(shí)，胭脂紅的平均回收率僅為25.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.8%；酸性紅的平均回收率為38.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.6%；其余6種合成著色劑的平均回收率為82.7%～100.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6%～4.8%。結(jié)果表明，WAX柱對低濃度的合成著色劑，特別是胭脂紅和酸性紅的回收率低，難以進(jìn)行準(zhǔn)確定量。使用Cleanert PWAX柱和ProElut PWA-2柱進(jìn)行凈化時(shí)，凈化過程均較快，但ProElut PWA-2柱對8種合成著色劑的回收率均高于Cleanert PWAX柱，重現(xiàn)性更好。因此，試驗(yàn)采用ProElut PWA-2柱。

2.2 色譜柱的選擇

在相同色譜條件下，比較Thermo AcclaimTM120 C18（5 μ m，4.6 mm×250 mm）、COSMOSIL C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）、DIKMA PLUS-C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）三種C18柱，目標(biāo)組分均有較好的分離度及穩(wěn)定的保留時(shí)間，檢測結(jié)果無顯著性差異。試驗(yàn)選擇了Thermo AcclaimTM120 C18（5 μ m，4.6 mm×250 mm）進(jìn)行試驗(yàn)。

2.3 波長的選擇

GB 5009.35—2016和SN/T 1743—2006中僅用單波長測定不同種類著色劑，大大降低了亮藍(lán)和酸性紅的檢測靈敏度和特異性。因此，利用DAD檢測器多通道檢測功能對各種著色劑在190～640 nm范圍內(nèi)分別進(jìn)行掃描，得到的亮藍(lán)和酸性紅的最大吸收波長分別為628和520 nm。因此，確定亮藍(lán)的檢測波長為628 nm；酸性紅的檢測波長為520 nm，檸檬黃、日落黃、胭脂紅、莧菜紅、誘惑紅、新紅的檢測波長均為254 nm。8種合成著色劑的混標(biāo)色譜圖見圖1。

圖1 8種合成著色劑混標(biāo)色譜圖

2.4 線性范圍、檢出限及定量限

混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的質(zhì)量濃度分別為1.0，5.0，10.0，20.0和50.0 μ g/mL，按1.3色譜條件進(jìn)樣分析，以各個組分的峰面積和濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以3倍信噪比計(jì)算檢出限，10倍信噪比計(jì)算定量限。結(jié)果見表2。

表2 8種合成著色劑的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

2.5 加標(biāo)回收率和精密度試驗(yàn)

稱取18份均勻的空白果汁樣品（每份約2.0 g），分為3組（每組6個平行樣），分別添加適量8種合成著色劑的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使樣品中8種合成著色劑的加標(biāo)量分別為0.5（低），5.0（中）和10.0 mg/kg（高）三個水平，按1.5處理樣品進(jìn)行回收試驗(yàn)，計(jì)算回收率和測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見表3?？瞻讟悠泛?.0 mg/kg加標(biāo)樣品溶液的色譜圖見圖2。結(jié)果表明，8種合成著色劑的平均回收率為86.5%～99.5%，RSD為0.5%～2.7%。該方法回收率和重現(xiàn)性良好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可以采用外標(biāo)法進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

圖2 空白樣品及加標(biāo)樣品的色譜圖

表3 精密度與回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.6 樣品測定

對市售的20份水果干制品按照試驗(yàn)所建立的方法進(jìn)行檢測。檢出1份檸檬黃，含量為0.010 g/kg，2份日落黃，含量分別為0.001和0.020 g/kg，檢出率為15%，其余6種合成著色劑均未檢出。

3 結(jié)論

試驗(yàn)建立了一種固相萃取-高效液相色譜法測定食品中8種合成著色劑的方法，對4種固相萃取小柱進(jìn)行比較，對色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，考察了方法的線性范圍、方法檢出限、加標(biāo)回收率及精密度等，有效地解決了食品中8種合成著色劑的高效凈化富集、液相色譜條件的優(yōu)化、準(zhǔn)確定性定量的三大關(guān)鍵問題，該方法操作簡便，靈敏度高，回收率和重現(xiàn)性良好，適用于大批量食品中8種合成著色劑的日常監(jiān)測。