蔣曙光，曹琥靚

1. 上海市營養(yǎng)食品質量監(jiān)督檢驗站（上海 200082）；2. 上海源本食品質量檢驗有限公司（上海 200082）

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）屬于假單胞菌屬，是一類致病性較低但抗藥力強的菌，其普遍分布于自然界中，如泥土中、動植物上、正常人的皮膚上和腸道呼吸道中。

銅綠假單胞菌可以在水環(huán)境中生存很長時間，可引起人的腹瀉等疾病，世界衛(wèi)生組織和我國都將此菌作為瓶裝飲用水的污染危害指示菌，日本和加拿大等國家已經對水的銅綠假單胞菌的存在作出限量規(guī)定；國際食品法典委員會（CAC）和歐盟成員國都明確作出了相應的規(guī)定，并指出在水中不得檢出此菌[1-2]。因此，銅綠假單胞菌被認為是水源性致病菌，是危害人類健康的一大威脅[3]。

目前國內外檢驗標準中，使用CN假單胞菌選擇性培養(yǎng)基并結合濾膜法是檢測水中銅綠假單胞菌最常用的手段[3]，水樣經過過濾后將濾膜移到CN假單胞菌選擇性培養(yǎng)基上，于36 ℃培養(yǎng)48 h，若在濾膜上有褐色或產有熒光的菌落，需純化培養(yǎng)后進一步生化鑒定，其檢驗過程繁瑣，通常要耗時5～7 d。

針對我國的水質污染情況，為進一步加快和提高檢驗水樣的效率，特別是大量水樣現(xiàn)場檢驗，試驗通過使用銅綠假單胞菌顯色培養(yǎng)基結合濾膜法，24～48 h就可以完成銅綠假單胞菌的檢驗，與國標使用的培養(yǎng)基和檢驗過程比較，具有很大的優(yōu)越性，可推廣應用于瓶（桶）裝水、水源水、城市二次供水等領域的銅綠假單胞菌的檢驗。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標準菌株

銅綠假單胞菌（ATCC 9027，ATCC 27853）、熒光假單胞菌（ATCC13525）、大腸埃希氏菌（ATCC 25922）、糞鏈球菌（ATCC 29212）、金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）、沙門氏菌（ATCC 14028）：美國菌種保藏中心。

1.1.2 儀器與試劑

密理博便攜式過濾系統(tǒng)；密理博過濾膜0.45 μm；海爾生物安全柜；三洋SANYO MLS-3050型高壓滅菌鍋；VDRTEX-5型旋渦混合儀；PL230型梅特勒電子天平；超凈工作臺。

CN假單胞菌選擇性培養(yǎng)基、乙酰胺液體培養(yǎng)基、金氏B培養(yǎng)基、API 20NE、銅綠假單胞菌顯色培養(yǎng)基等試劑，北京陸橋技術有限責任公司。

據(jù)《中國農民工調研報告》顯示，新生代農民工的受教育程度逐步提升，其受教育程度在農民工中的占比由20世紀80年代的小學教育水平為主，逐步過渡到90年代以初中教育水平為主，2000年后，這個群體中的高中生比重最大，到今天，新生代農民工多半接受了中?；虼髮＝逃?，有的還接受了正規(guī)的大學教育。相比于老一代農民工，這些農民工在今天的信息時代，他們完全可以與城市同齡人一樣，借助于現(xiàn)代手段和信息技術完全可以獲取自己想要的不同知識，他們具有較強的信息獲取能力，其運用的途徑、手段和方式也多種多樣，網絡和自媒體成為其了解外部世界的常用手段，這些新生代農民工的知識獲取和知識更新速度和能力都與城市同齡人一樣。

1.2 方法

1.2.1 顯色培養(yǎng)基的特異性測試

將銅綠假單胞菌、熒光假單胞菌、大腸埃希氏菌、糞鏈球菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌在營養(yǎng)肉湯中過夜復蘇，挑取1環(huán)轉種于銅綠假單胞菌顯色平板，于36±1 ℃培養(yǎng)24 h，觀察各個菌株在顯色平板上的生長狀況，測試顯色平板的特異性。

1.2.2 顯色培養(yǎng)基的抑菌性測試

將大腸埃希氏菌、糞鏈球菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌在營養(yǎng)肉湯中過夜復蘇，分別制成104～105CFU菌懸液，涂布于顯色平板，于36±1 ℃培養(yǎng)24 h，觀察顯色平板上的雜菌生長狀況。

1.2.3 培養(yǎng)基靈敏度測試

將銅綠假單胞菌在營養(yǎng)肉湯中過夜復蘇，挑取1環(huán)至10 mL滅菌鹽水中，制成10-1CFU的菌懸液，然后對其進行十倍稀釋，制成10-2～10-7CFU的菌液。用微量移液器移取100 μL分別涂布于銅綠假單胞菌顯色培養(yǎng)基、CN假單胞菌選擇性培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂，置36℃生化培養(yǎng)箱中，24 h后對各個培養(yǎng)基上銅綠假單胞菌的數(shù)量計數(shù)。比較各個培養(yǎng)基的靈敏度。

1.2.4 過濾系統(tǒng)的使用

按要求將0.45 μ m密理博濾膜、250 mL無菌濾杯、濾器、真空泵等抽濾設備組合，對水樣進行過濾。

1.2.5 加標水樣測試

將銅綠假單胞菌在營養(yǎng)肉湯中過夜復蘇，挑取1環(huán)至10 mL滅菌鹽水中，制成10-1CFU的菌懸液，然后對其進行十倍稀釋，制成10-5～10-7的菌液。各取0.2 mL菌液加入250 mL水樣中，過濾檢測，將濾膜移置銅綠假單胞菌顯色培養(yǎng)基和CN假單胞菌選擇性培養(yǎng)基上，在36±1 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h，觀察計數(shù)，比較兩種培養(yǎng)基的檢驗效果。

1.2.6 實際水樣的的檢驗

采集瓶（桶）裝水、水源水、環(huán)境水和城市二次供水，共計100份，對其進行銅綠假單胞菌檢驗。將250 mL水用0.45 μm密理博濾膜過濾，可根據(jù)污染情況適當稀釋，過濾檢驗，將濾膜移置銅綠假單胞菌顯色培養(yǎng)基和CN假單胞菌選擇性培養(yǎng)基上，在36±1 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h，比較銅綠假單胞菌在這兩種培養(yǎng)基的檢出效果。

1.3 銅綠假單胞菌的鑒定

從濾膜上挑取1～5個可疑菌落，銅綠假單胞菌在顯色培養(yǎng)基上呈藍綠色、1～2 mm菌落，CN假單胞菌選擇性培養(yǎng)基上呈褐色或有熒光的菌落。轉種到營養(yǎng)瓊脂（NA）平板上純化培養(yǎng)，置36±1 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h。進行確證試驗 。

氧化酶試驗：取新配制的氧化酶試劑滴在干凈濾紙上，用玻璃棒將純化培養(yǎng)物涂布在濾紙上，顯深藍紫色的判為陽性反應。銅綠假單胞菌應為陽性反應。

金氏B試驗：將純化培養(yǎng)物轉種于金氏B培養(yǎng)基上，于36±1 ℃生化箱培養(yǎng)24～120 h。每天從培養(yǎng)箱中取出觀察是否產生熒光，將120 h內有熒光產生的記為陽性。

乙酰胺試驗：將純化培養(yǎng)物轉種于乙酰胺培養(yǎng)基中，在36±1 ℃下培養(yǎng)過夜，后向培養(yǎng)物滴加1～2滴鈉氏試劑，如出現(xiàn)磚紅色現(xiàn)象則為陽性，反之為陰性。

最終的鑒定采用API 20NE生化鑒定條。

2 結果與討論

2.1 銅綠假單胞菌顯色培養(yǎng)基的特異性測試結果

2.1.1 顯色培養(yǎng)基生長情況

如表1所示，銅綠假單胞菌在顯色平板上生長較好，有藍綠色菌落。熒光假單胞菌顯色平板上為白色菌落。其他菌不能良好生長或被抑制，表明顯色平板對銅綠假單胞菌有良好的特異性。

2.1.2 抑菌性測試

將大腸埃希氏菌、糞鏈球菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌在營養(yǎng)肉湯中過夜復蘇，分別制成104～105CFU菌懸液，涂布于顯色平板上都不能生長，證明顯色平板可以有效抑制104～105CFU數(shù)量的雜菌。

2.1.3 培養(yǎng)基靈敏度測試

統(tǒng)計30～300 CFU之間的菌落數(shù)，使用SPSS統(tǒng)計分析軟件進行方差分析，比較三種平板上菌落數(shù)。如表2所示，銅綠假單胞菌在三種培養(yǎng)基上的生長數(shù)量無顯著差異（p=0.901＞0.05），顯色平板能達到國標中使用的傳統(tǒng)培養(yǎng)基（CN假單胞菌選擇性培養(yǎng)基）的相同效果和靈敏度。

表1 各菌株在顯色平板上的生長狀況

表2 銅綠假單胞菌在三種平板的菌落數(shù)

2.2 加標水樣測試

統(tǒng)計濾膜上30～300 CFU之間的菌落數(shù)，使用SPSS統(tǒng)計分析軟件進行方差分析，比較兩種培養(yǎng)基在濾膜上菌落數(shù)。如表3所示，銅綠假單胞菌在這兩種平板濾膜上的生長數(shù)量無顯著差異（p=0.716 0＞0.05），銅綠假單胞菌顯色平板能達到國標中使用的傳統(tǒng)培養(yǎng)基（CN假單胞菌選擇性培養(yǎng)基）的相同效果和靈敏度。

表3 加標水樣在濾膜上菌落結果

2.3 實際水樣的的檢驗

如表4所示，試驗采集瓶（桶）裝水、水源水、環(huán)境水和城市二次供水，共計100份，其中桶裝水樣檢出3株銅綠假單胞菌，水源水檢出2株銅綠假單胞菌，環(huán)境水桶裝水檢出1株銅綠假單胞菌，其他水樣的結果均是未檢出。可疑水樣通過過濾檢驗，濾膜上出現(xiàn)銅綠假單胞菌可疑菌落，經純培養(yǎng)、初步鑒定、API 20NE鑒定試劑盒最終確認都是銅綠假單胞菌，兩種培養(yǎng)基的檢驗結果相同，表明銅綠假單胞菌顯色平板能達到國標中使用的傳統(tǒng)培養(yǎng)基（CN假單胞菌選擇性培養(yǎng)基）的相同效果。在實際檢驗中，銅綠假單胞菌顯色培養(yǎng)基可在24 h就能觀察結果，而CN假單胞菌選擇性培養(yǎng)基則需要培養(yǎng)到48 h方可觀察結果，在CN選擇性培養(yǎng)基上還出現(xiàn)4株假陽性的菌株，這些菌經鑒定均是熒光假單胞菌，在顯色培養(yǎng)基上為白色菌落，能夠和銅綠假單胞菌在顯色培養(yǎng)基上的藍綠色菌落特征區(qū)分開，從而降低假陽性率。但在實際水樣檢驗中未發(fā)現(xiàn)顯色培養(yǎng)基有假陽性現(xiàn)象。

表4 實際水樣檢出銅綠假單胞菌的結果

3 結論

銅綠假單胞菌是水質監(jiān)測重要指標之一，此菌能使人患病，被國內外水質標準[5]列為重要的致病菌項目，并規(guī)定了銅綠假單胞菌的限量。傳統(tǒng)方法一般使用CN假單胞菌選擇性培養(yǎng)基經48 h培養(yǎng)后初步鑒定、純化、生化鑒定，檢驗周期太長，假陽性率很高。

因此，試驗采用銅綠假單胞菌顯色培養(yǎng)基經培養(yǎng)24 h可通過菌落的形態(tài)大小、顏色即可做出判斷，大大節(jié)省了勞動力和時間，且其靈敏度、特異性測試均與傳統(tǒng)培養(yǎng)基效果一致，樣品檢驗假陽性率較低，檢驗效果很好。

由于試驗采集的樣本數(shù)量、種類有一定的局限性，只是對銅綠假單胞菌顯色培養(yǎng)基的在水中檢驗初步應用做了一個介紹，還需要大量的實際樣本數(shù)據(jù)對實驗應用的支持和補充，但這一檢驗系統(tǒng)的建立對于銅綠假單胞菌的快速檢驗有重大意義，對國內水質檢驗標準的起草制定有一定的指導作用，可顯著提高水質檢驗水平，提高保障飲水和供水的安全