于亞輝，謝昭鵬，張帆，蘇煌杰，方婷

福建農(nóng)林大學食品科學學院（金山 350002）

中國的咸味香精發(fā)展歷程可追溯至20世紀80年代，經(jīng)過30余年的開發(fā)研究，形成一套具有鮮明區(qū)域特色與產(chǎn)品類型的工業(yè)化生產(chǎn)體系，其生產(chǎn)技術(shù)和研發(fā)水平也達到世界前列[1-2]。伴隨著中國食品工業(yè)的高速發(fā)展，對于食品色、香、味等呈現(xiàn)日益多元化的追求，咸味香精的發(fā)展也將迎來新的機遇期[3]。

目前國內(nèi)咸味香精的生產(chǎn)方式主要采用動植物蛋白及骨骼組織的酶解技術(shù)、脂肪調(diào)控氧化技術(shù)、美拉德反應技術(shù)、辛香料提取技術(shù)、調(diào)香技術(shù)及干燥技術(shù)等技術(shù)手段，生產(chǎn)出具備各種肉香味的咸味香精[3]。生產(chǎn)上以動植物蛋白酶解物、還原糖、氨基酸等風味前體物質(zhì)為原料，經(jīng)過熱反應來生產(chǎn)風味基料，并經(jīng)過加香調(diào)香從而達到商業(yè)水平，采用非肉源前體物質(zhì)為原料生產(chǎn)的產(chǎn)品且成本較低，但其肉類特征香味較少且不夠濃郁。

大豆分離蛋白（Soybean protein isolate，SPI），蛋白含量高，營養(yǎng)豐富，是一種全價植物蛋白，其酶解物可作為動物蛋白酶解物的替代物，但其不同的水解度、添加量、不同酶酶解產(chǎn)物等因素對產(chǎn)品品質(zhì)影響較大。試驗以大豆分離蛋白及雞肉的酶解物為原料，經(jīng)過熱反應制備風味基料，研究大豆分離蛋白酶解物對制備雞肉風味基料的影響，為采用植物蛋白酶解物制備風味基料及成品香精提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與設備

雞胸肉（市售）。

大豆分離蛋白（蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)＞90%，安陽齊天生物技術(shù)有限公司）；風味蛋白酶（500 LA-PU/g）、復合蛋白酶（1.5 AU/g）均為丹麥諾維信酶制劑公司；動物蛋白酶（30萬 U/g）、木瓜蛋白酶（200萬U/g）均為南寧龐博生物工程有限公司；胃蛋白酶（3 000 U/g）、堿性蛋白酶（20萬 U/g）、葡萄糖、甘氨酸、亮氨酸、精氨酸、硫胺素（VB1）、半胱氨酸均為西格瑪試劑公司；酵母提取物（安琪酵母股份有限公司）；牛磺酸（潛江永安藥業(yè)股份有限公司）；磷酸鹽緩沖液（自制）。

精密電子天平（AX523ZH奧豪斯）；pH計（雷磁PHS-3C型，上海儀電科學儀器股份有限公司）；切碎機（廣東小熊電器有限公司）；Centrifuge 5430 R小型高速冷凍式離心機（德國艾本德股份公司）；電熱鼓風干燥箱（上海-恒科學儀器有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司）；立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅）。

1.2 方法

1.2.1 雞肉酶解產(chǎn)物的制備

將雞胸肉絞碎至肉糜，控制料液比1∶3（g/mL），采用分步加酶法：第一步加入底物質(zhì)量0.2%的木瓜蛋白酶和風味蛋白酶，調(diào)節(jié)初始pH 6.0，于55 ℃恒溫水浴鍋中攪拌酶解2.0 h；第二步加入底物質(zhì)量0.2%的復合蛋白酶和動物蛋白酶，調(diào)節(jié)初始pH 6.5，于50 ℃恒溫水浴鍋中攪拌酶解2.0 h，煮沸滅酶10 min，冷卻后以6 500 r/min在4 ℃離心15 min后取上清液即得酶解產(chǎn)物，測得水解度為20.32%。

1.2.2 大豆分離蛋白酶解物的制備

使用去離子水配制濃度10.0%的大豆分離蛋白溶液250 mL，攪拌均勻，使用磷酸緩沖液及2 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH，分別采用堿性蛋白酶[4]、木瓜蛋白酶[5]、風味蛋白酶[6]、復合蛋白酶[7]、胃蛋白酶[8]進行酶解，酶解6 h，測定不同時刻的水解度，使用pH-stat法測定酶解液的水解度[9]，分別選擇水解度為4.5%±0.1%，5.5%±0.1%，6.5%±0.1%，7.5%±0.1%和8.5%±0.1%的酶解液，冷凍室保存。

1.2.3 風味基料的制備

取雞肉與大豆分離蛋白酶解產(chǎn)物共30 mL，依次按比例加入葡萄糖、甘氨酸、亮氨酸、精氨酸、硫胺素（VB1）、半胱氨酸、?；撬釘嚢杈鶆颍⑹褂昧姿猁}緩沖溶液調(diào)節(jié)至pH 6.5，裝入反應瓶后置于立式壓力蒸汽滅菌器中，在100 ℃下進行反應55 min。

1.2.4 單因素試驗

1) 大豆分離蛋白不同酶種類水解液對雞肉風味基料的影響

按表1的基本配方，分別添加10 mL用堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風味蛋白酶、復合蛋白酶、胃蛋白酶酶解的酶解度5.5%±0.1%的大豆分離蛋白酶解液，其中添加雞肉酶解液20 mL。

2) 木瓜蛋白酶水解的大豆分離蛋白其不同水解度雞肉風味基料的影響

按表1的基本配方，分別加入10 mL水解度為4.5%±0.1%，5.5%±0.1%，6.5%±0.1%，7.5%±0.1%和8.5%±0.1%的大豆分離蛋白酶解液，其中添加雞肉酶解液20 mL。

3) 木瓜蛋白酶水解的大豆分離蛋白其不同添加量對雞肉風味基料的影響

按表1的基本配方，分別加入0，5，10，15，20和25 mL水解度5.5%±0.1%的大豆分離蛋白酶解液，并使用雞肉酶解液補足30 mL。

4) 葡萄糖添加量對雞肉風味基料的影響

按表1的基本配方，加入10 mL使用木瓜蛋白酶酶解的水解度5.5%±0.1%的大豆分離蛋白酶解液，20 mL雞肉酶解液，并分別添加0，4.0%，4.5%，5.0%，5.5%和6.0%的葡萄糖。

5) 甘氨酸添加量對雞肉風味基料的影響

按表1的基本配方，加入10 mL使用木瓜蛋白酶酶解的水解度5.5%±0.1%的大豆分離蛋白酶解液，20 mL雞肉酶解液，并分別添加0，0.4%，0.8%，1.2%，1.6%和2.0%的甘氨酸。

6) 亮氨酸添加量對雞肉風味基料的影響

按表1的基本配方，加入10 mL使用木瓜蛋白酶酶解的水解度5.5%±0.1%的大豆分離蛋白酶解液，20 mL雞肉酶解液，并分別添加0，0.4%，0.6%，0.8%，1.0%和1.2%的甘氨酸。

7) 精氨酸添加量對雞肉風味基料的影響

按表1的基本配方，加入10 mL使用木瓜蛋白酶酶解的水解度5.5%±0.1%的大豆分離蛋白酶解液，20 mL雞肉酶解液，并分別添加0，0.4%，0.6%，0.8%，1.0%和1.2%的精氨酸。

8) 硫胺素添加量對雞肉風味基料的影響

按表1的基本配方，加入10 mL使用木瓜蛋白酶酶解的水解度5.5%±0.1%的大豆分離蛋白酶解液，20 mL雞肉酶解液，并分別添加0，0.02%，0.04%，0.06%，0.08%和0.10%的硫胺素。

9) 半胱氨酸添加量對雞肉風味基料的影響

按表1的基本配方，加入10 mL使用木瓜蛋白酶酶解的水解度5.5%±0.1%的大豆分離蛋白酶解液，20 mL雞肉酶解液，并分別添加0，0.03%，0.06%，0.09%，0.12%和0.15%的半胱氨酸。

10) ?；撬崽砑恿繉﹄u肉風味基料的影響

按表1的基本配方，加入10 mL使用木瓜蛋白酶酶解的水解度5.5%±0.1%的大豆分離蛋白酶解液，20 mL雞肉酶解液，并分別添加0，0.3%，0.6%，0.9%，1.2%和1.5%的牛氨酸。

表1 制備風味基料基本配方

1.2.5 正交試驗優(yōu)化工藝條件

根據(jù)大豆分離蛋白酶解液對制備風味基料的影響因素，并考慮單因素試驗結(jié)果，選擇蛋白酶種類（A）、水解度（B）、水解液添加量（C）、半胱氨酸添加量（D）4個因素進行正交優(yōu)化，以感官評價為考慮依據(jù)，進行正交優(yōu)化，因素及水平選取見表2。

表2 正交試驗因素水平表

1.2.6 感官評價方法及評價標準

選取20名感官評價人員，對其進行感官評價的相關知識培訓，并進行練習培訓考核，從中選擇10名感官評價人員對樣品進行評價，每個樣品交叉重復2～3次，評價標準見表3，滿分100分，取10名評價人員的平均分數(shù)為最終結(jié)果。

表3 風味基料評價標準

1.2.7 模糊數(shù)學評價方法[5-6]

由10名感官評價人員組成評價小組，并按照感官評價手冊對樣品進行評價。根據(jù)樣品實際情況，確定評判對象集為U=（u1，u2，…，ui，…，un），其中U為因素集，ui為第i個因素，根據(jù)評價小組根據(jù)風味基料的評價標準研究決定，選取5項指標組成因素集即U=（香味u1，色澤u2，逼真度u3，整體協(xié)調(diào)性u4，口感u5）；根據(jù)評判因素為V=（v1，v2，…，vi，…，vn），確定風味基料的評語集為V=（喜歡v1，一般喜歡v2，不喜歡v3，討厭v4），感官評定表見表4；并確定因素集中指標相對應的權(quán)重向量為K=（0.25，0.20，0.25，0.15，0.15）。

表4 風味基料感官評定表

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果與分析

單因素試驗結(jié)果見圖1。

單一酶酶解大豆分離蛋白試驗中，胃蛋白酶酶解的酶解液對制備風味基料具有最佳作用，原因可能在于胃蛋白酶選擇性水解11S大豆球蛋白[10]，產(chǎn)生游離巰基及含有二硫鍵的小分子肽對生成含氮、氧、硫香味化合物起到促進作用。采用木瓜蛋白酶作為單因素試驗酶，其酶解物作為風味基料反應液的最佳水解度為7.5%，木瓜蛋白酶選擇性水解7S大豆球蛋白，隨著水解度升高蛋白質(zhì)水解為小分子肽，含有疏水性氨基酸及苦味氨基酸。植物蛋白酶解物的加入使得風味基料口感柔和香味協(xié)調(diào)濃郁，但隨著加入大豆分離蛋白酶解物增加，非肉源前體物質(zhì)增加產(chǎn)生的關鍵肉香味化合物減少，對風味基料的制備起到相反的作用，其最佳添加量為10 mL。采用10 mL木瓜蛋白酶酶解的大豆分離蛋白酶解液，其水解度為5.5%±0.1%與20 mL雞肉酶解物為反應基料，確定單因素葡萄糖、甘氨酸、亮氨酸、精氨酸、硫胺素（VB1）、半胱氨酸和?；撬岬淖罴烟砑恿糠謩e為5.00%，1.20%，0.80%，0.60%，0.04%，0.06%和0.60%。

圖1 單因素試驗結(jié)果

2.2 正交試驗優(yōu)化工藝條件

試驗結(jié)果和數(shù)據(jù)處理見表5和表6。

表5 正交試驗結(jié)果

表6 方差分析表

由方差分析表5可知，F(xiàn)0.05＜F（蛋白酶種類）＜F0.01，F(xiàn)0.05＜F（水解度）＜F0.01，F(xiàn)0.05＜F（酶解液添加量）＜F0.01差異顯著。

從表5和表6可知，4個因素中有3個因素對風味基料的綜合評分具有顯著影響（p＜0.05），對4個因素的極差R值進行分析為RB＞RC＞RA＞RD，其影響程度主次順序為：B（蛋白酶種類）＞C（酶解液添加量）＞A（水解度）＞D（半胱氨酸添加量）。以綜合評分為依據(jù)的較優(yōu)方案為A3B2C1D3，即：選用胃蛋白酶水解、水解度7.5%±0.1%、酶解液添加量10 mL、半胱氨酸添加量0.12%。

2.3 模糊數(shù)學評價檢驗

對正交試驗中得分在75分及以上的試驗方案：A1B2C2D2（第1組）、A2B3C1D2（第2組）、A3B1C3D2（第3組）、A3B2C1D3（第4組）進行重復試驗。對每個樣品的品質(zhì)指標進行歸一化處理，得到模糊矩陣。

其中j=1，2，3，4為樣品編號，i=1，2，3，4，5為樣品的品質(zhì)指標，ri1，ri2，ri3，ri4，ri5分別為第i個評價指標。依然選擇當初的10名感官評價人員，再對4組樣品依照風味基料感官評定表對樣品逐一進行評價，其對應的票數(shù)情況見表7。

表7 感官評定票數(shù)分布

得到3組樣品的模糊矩陣R11=V11/10。

2.4 模糊變換及評價結(jié)果

根據(jù)模糊矩陣變化原理R=K×A，4組樣品的評價結(jié)果分別為R1=K×A1=K=（0.25，0.20，0.25，0.15，0.15）×A1=（0.23，0.325，0.325，0.09）；R2=K×A2=K=（0.25，0.20，0.25，0.15，0.15）×A2=（0.185，0.33，0.39，0.05）；R3=K×A3=K=（0.25，0.20，0.25，0.15，0.15）×A3=（0.16，0.365，0.33，0.095）；R4=K×A4=K=（0.25，0.20，0.25，0.15，0.15）×A4=（0.37，0.245，0.345，0.04）。

由4組樣品的評價結(jié)果可知，第4組樣品具有最高的隸屬喜歡率為37%，討厭率最少為4%，喜歡及一般喜歡率為61.5%是4組樣品中最高的。根據(jù)最大隸屬原則認為第4組樣品的綜合感官最佳，且模糊數(shù)學結(jié)果與正交試驗的結(jié)果相一致，工藝條件為：選用胃蛋白酶水解、水解度7.5%×0.1%、酶解液添加量10 mL、半胱氨酸添加量0.12%。

3 結(jié)論

在一定酶解條件下的大豆分離蛋白酶解物，可代替部分雞肉酶解物作為反應基物，加入一定比例的葡萄糖、甘氨酸、亮氨酸、精氨酸、硫胺素（VB1）、半胱氨酸、?；撬岬惹绑w物質(zhì)，在一定條件下反應可得到具有一定品質(zhì)的雞肉風味基料。

通過單因素試驗及正交試驗對影響雞肉味基料品質(zhì)的因素進行研究，重點研究大豆分離蛋白酶解物的添加對雞肉風味基料的影響，其中有較大影響的4個因素的主次關系是：蛋白酶種類＞酶解液添加量＞水解度＞半胱氨酸添加量，且前3個因素具有顯著性。通過模糊數(shù)學感官評價方法確定正交試驗最優(yōu)反應條件為：選用胃蛋白酶水解、水解度7.5%×0.1%、酶解液添加量10 mL、半胱氨酸添加量0.12%，單因素試驗條件為葡萄糖5.0%、甘氨酸1.2%、亮氨酸0.8%、精氨酸0.6%、硫胺素（VB1）0.04%、半胱氨酸0.06%、?；撬?.6%，得到的雞肉風味基料品質(zhì)較高，香味突出，為利用植物蛋白酶解液制備風味基料提供理論依據(jù)，并為研究采用復合酶酶解、提高水解度等因素對風味基料的影響提供借鑒。