何鳳平，雷朝云，范建新，康專苗，劉榮，韓樹權(quán)

貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院亞熱帶作物研究所（興義 562400）

澳洲堅(jiān)果（Macadamia internifolia）亦稱夏威夷果，為山龍眼科澳洲堅(jiān)果屬的多年生常綠果樹，原種植于澳大利亞昆士蘭州東南部沿海地區(qū)及新南威爾士州東北部沿岸的亞熱帶雨林地區(qū)[1-2]。目前，澳大利亞、南非、美國、中國等為其主要栽培國家，在我國的廣東、云南、廣西、貴州、四川等地均有種植[2-3]。近年來，澳洲堅(jiān)果發(fā)展十分迅猛，應(yīng)用前景相當(dāng)廣闊，吸引眾多國內(nèi)外學(xué)者在栽培和品質(zhì)方面作了深入的研究，然而集中于澳洲堅(jiān)果其他方面的國內(nèi)外研究相當(dāng)少，尤其是枝葉方面的報(bào)道更是微乎其微，當(dāng)前僅有的少數(shù)研究均是關(guān)于其葉面積的測定[4-6]。

目前，貴州省乃至全國各地均是將澳洲堅(jiān)果枝葉修剪之后丟棄在地，任其腐爛當(dāng)作自身的肥料或是回收至家焚燒取暖，既污染空氣，又未發(fā)揮出它自身的最大價值，嚴(yán)重不符合可持續(xù)發(fā)展的理念。有前期試種研究發(fā)現(xiàn)，貴州省南北盤江、紅水河流域海拔1 000 m以下、赤水河流域海拔650 m以下等地區(qū)均適宜種植澳洲堅(jiān)果，貴州適宜種植面積在9.87萬 hm2以上，種植推廣空間巨大[7]。目前貴州現(xiàn)有澳洲堅(jiān)果栽培面積約1 333 hm2，全國13.33萬 hm2以上，每年修剪遺棄的澳洲堅(jiān)果葉片不計(jì)其數(shù)。隨著產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，意味著修剪遺棄掉的澳洲堅(jiān)果葉片將越來越多，急需為修剪遺棄的澳洲堅(jiān)果葉尋找出路，做出適宜處理以使它價值最大化，從而變廢為寶。

精油是存在于植物體內(nèi)（如：花、果實(shí)、葉、根、皮等）的一類可隨水蒸氣蒸餾且具有一定氣味的揮發(fā)性油狀液體的總稱，屬植物體自身的次級代謝產(chǎn)物，享有“液體黃金”的美譽(yù)。國內(nèi)外眾多的研究均表明，植物精油是由多種成分組合的天然混合物，具有抗氧化、抑菌、保鮮等作用，廣泛應(yīng)用于化妝品、洗滌用品、食品（果蔬及肉類）、煙酒以及其他工業(yè)用香精中[8-15]。目前植物精油提取方法有很多，例如水蒸氣蒸餾法、分子蒸餾法、同時蒸餾萃取法、有機(jī)溶劑萃取法、超臨界二氧化碳流體萃取法、亞臨界水萃取法、微膠囊-雙水相萃取法、超聲微波輔助提取法等[8,16-17]，其中水蒸氣蒸餾法因設(shè)備簡單、操作簡便、提取成本低等優(yōu)點(diǎn)應(yīng)用廣泛，同時也是植物精油提取最為常用的方法[18-19]。

迄今國內(nèi)外有大量植物精油相關(guān)的研究報(bào)道，但其中卻鮮有關(guān)于澳洲堅(jiān)果葉片提取精油的報(bào)道。前期預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)能從澳洲堅(jiān)果葉片中提取出精油，但方法還需要不斷改進(jìn)和優(yōu)化，從而達(dá)到變廢為寶、提高澳洲堅(jiān)果附加值的目的，進(jìn)一步促進(jìn)澳洲堅(jiān)果產(chǎn)業(yè)健康綠色發(fā)展。因此，研究通過單因素試驗(yàn)（浸泡時間、料液比、NaCl質(zhì)量濃度和蒸餾時間）和正交試驗(yàn)來確定水蒸氣蒸餾法提取澳洲堅(jiān)果精油的最佳工藝條件，旨在為澳洲堅(jiān)果葉的相關(guān)研究提供理論參考及依據(jù)，同時對于澳洲堅(jiān)果葉的開發(fā)利用也具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

澳洲堅(jiān)果鮮葉，采摘于貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院亞熱帶作物研究所基地，根據(jù)葉片的色澤及形態(tài)挑選成熟的葉片采摘。

NaCl，購自成都金山化學(xué)試劑有限公司，分析純；無水乙醇，購自天津市富宇精細(xì)化工有限公司，分析純。

蒸餾裝置（1 000 mL）；JM-B 5003型電子天平，余姚紀(jì)銘稱重校驗(yàn)設(shè)備有限公司；艾柯超純水機(jī)，成都唐氏康寧科技發(fā)展有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 前處理方法

將采摘的澳洲堅(jiān)果鮮葉運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，挑選新鮮、無病蟲害的葉片洗凈，自然晾干葉片表面水分待用。精油提取之前去掉葉片的葉柄，然后剪成1～2 cm2的碎片備用。

1.2.2 提取方法

澳洲堅(jiān)果鮮葉精油提取采用水蒸氣蒸餾法，以《中華人民共和國藥典》中揮發(fā)油提取方法為參照[20]。準(zhǔn)確稱取澳洲堅(jiān)果碎葉片50.00 g，裝入到1 000 mL的圓底燒瓶中，然后按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)中的料液比加入蒸餾水，改變浸泡時間、NaCl質(zhì)量濃度和蒸餾時間，連接好蒸餾裝置開始進(jìn)行不同條件下的蒸餾。第一滴液滴滴出時開始計(jì)時，蒸餾結(jié)束之后，采用油水分離器分離精油，收集精油稱質(zhì)量，計(jì)算精油提取率。

1.2.3 精油提取率計(jì)算

1.2.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.4.1 浸泡時間對澳洲堅(jiān)果精油提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5份澳洲堅(jiān)果碎葉片50.00 g，分別按照1∶5（g/mL）的料液比加入2.5 g/100 mL的NaCl溶液，在室溫條件下浸泡0，2，4，6和8 h，蒸餾提取2 h之后，采用油水分離器分離精油，收集精油稱質(zhì)量，計(jì)算精油提取率，確定澳洲堅(jiān)果精油提取的最理想浸泡時間。

1.2.4.2 料液比對澳洲堅(jiān)果精油提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5份澳洲堅(jiān)果碎葉片50.00 g，分別按照1∶3，1∶4，1∶5，1∶6和1∶7（g/mL）的料液比加入2.5 g/100 mL的NaCl溶液，在室溫條件下浸泡2 h，蒸餾提取2 h之后，采用油水分離器分離精油，收集精油稱質(zhì)量，計(jì)算精油提取率，確定澳洲堅(jiān)果精油提取的最佳料液比。

1.2.4.3 NaCl質(zhì)量濃度對澳洲堅(jiān)果精油提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5份澳洲堅(jiān)果碎葉片50.00 g，分別按照1∶5（g/mL）的料液比加入0，2.5，5，7.5和10 g/100 mL的NaCl溶液，在室溫條件下浸泡2 h，蒸餾提取2 h之后，采用油水分離器分離精油，收集精油稱質(zhì)量，計(jì)算精油提取率，確定澳洲堅(jiān)果精油提取的最適宜NaCl質(zhì)量濃度。

1.2.4.4 蒸餾時間對澳洲堅(jiān)果精油提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5份澳洲堅(jiān)果碎葉片50.00 g，分別按照1∶5（g/mL）的料液比加入2.5 g/100 mL的NaCl溶液，在室溫條件下浸泡2 h，蒸餾提取1，2，3，4和5 h之后，采用油水分離器分離精油，收集精油稱質(zhì)量，計(jì)算精油提取率，確定澳洲堅(jiān)果精油提取的最合適蒸餾時間。

1.2.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以澳洲堅(jiān)果精油提取率為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取料液比、NaCl質(zhì)量濃度和蒸餾時間作為主要因素設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，確定澳洲堅(jiān)果精油提取的最佳工藝條件。正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)表見表1。

表1 澳洲堅(jiān)果葉精油提取正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)表

1.2.6 澳洲堅(jiān)果精油最佳提取工藝條件驗(yàn)證

在正交試驗(yàn)中得出的最佳提取工藝條件下，按照1.2.2項(xiàng)中的方法進(jìn)行精油提取，重復(fù)5次，計(jì)算澳洲堅(jiān)果葉精油提取率平均值，與正交試驗(yàn)中的精油提取率最大值進(jìn)行比較，驗(yàn)證正交試驗(yàn)是否有效。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析及處理

各指標(biāo)測定均重復(fù)3次。運(yùn)用Excel 2007和SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及分析，Sigma Plot 12.0繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 浸泡時間對澳洲堅(jiān)果葉精油提取率的影響

由圖1可知，浸泡時間對澳洲堅(jiān)果葉精油提取率的影響效果不太明顯，在其他條件一定的情況下，隨著浸泡時間的延長，澳洲堅(jiān)果葉精油提取率增加幅度不大。在浸泡2 h之后，精油提取率還存在稍微降低的趨勢，可能原因在于浸泡時間過長，澳洲堅(jiān)果葉中部分精油也許會溶于水中，另外或許是因?yàn)榘闹迗?jiān)果葉中某些能產(chǎn)生乳化作用的成分溶出而抑制精油被蒸出，最終導(dǎo)致其精油提取率降低[21-23]。因此，綜合精油提取率、時間成本等因素，選擇浸泡時間2 h為宜。

2.1.2 料液比對澳洲堅(jiān)果葉精油提取率的影響

在植物精油提取中，料液比是一個較為重要的影響因素。由圖2可知，隨著料液比增加，澳洲堅(jiān)果葉精油提取率逐漸上升，在料液比為1∶5（g/mL）時，澳洲堅(jiān)果葉精油提取率達(dá)到最大值，原因在于：一是隨著料液比的增加，蒸汽釋放速率會提高，從而對精油的攜帶能力會增強(qiáng)，致使精油提取率增大[24]；二是對于固定質(zhì)量的原料來講，添加進(jìn)去的水量增多，精油濃度會隨之降低，使得精油與水接觸面處的濃度差反而會增大，可提髙傳質(zhì)速率，同時還能讓原料得到充分地浸泡，細(xì)胞更容易破裂，精油也更易滲透出來，從而可在一定程度上增加精油提取率[18,21,25]。當(dāng)料液比繼續(xù)增大，精油提取率卻呈現(xiàn)出緩慢下降的趨勢，主要是由于蒸汽所攜帶出的精油量在增多，而冷凝回收的效率卻在降低[24]。因此，在一定的冷凝效果及固定質(zhì)量的原料條件下，適宜的料液比對精油提取率有很大的影響，綜合精油提取率、節(jié)能等方面考慮，料液比選擇1∶5（g/mL）為宜。

圖1 浸泡時間對澳洲堅(jiān)果葉精油提取率的影響

圖2 料液比對澳洲堅(jiān)果葉精油提取率的影響

2.1.3 NaCl質(zhì)量濃度對澳洲堅(jiān)果葉精油提取率的影響

NaCl在整個蒸餾過程中主要起到鹽析的作用[26]。在水蒸氣蒸餾法提取植物精油過程中，加入適量的NaCl之后，可以極大程度地提高精油提取率，主要是因?yàn)橐欢ㄙ|(zhì)量濃度的NaCl溶液可以改變植物組織細(xì)胞的滲透壓，促使細(xì)胞破裂，讓位于細(xì)胞內(nèi)的精油可以更多地滲透出來，同時NaCl還能降低精油在水中的溶解度，從而使得精油更容易被蒸出[25]。由圖3可知，隨著NaCl質(zhì)量濃度增加，澳洲堅(jiān)果葉精油提取率升高，NaCl質(zhì)量濃度為2.5 g/100 mL時達(dá)到最大值；隨后NaCl質(zhì)量濃度增大，澳洲堅(jiān)果葉精油提取率反而呈現(xiàn)出不斷下降的趨勢。綜合精油提取率、節(jié)能等方面考慮，NaCl質(zhì)量濃度選擇2.5 g/100 mL較為合理。

圖3 NaCl質(zhì)量濃度對澳洲堅(jiān)果葉精油提取率的影響

2.1.4 蒸餾時間對澳洲堅(jiān)果葉精油提取率的影響

水蒸氣蒸餾法提取植物精油，若蒸餾時間太短，水分將不能充分地浸入到植物組織的各個部位，導(dǎo)致精油不能完全被提取出來，從而使得提取率降低。通過延長蒸餾時間可以更徹底地將精油提出，獲得較為理想的提取效果，但是蒸餾時間若過長，將會浪費(fèi)掉很多資源，同時在蒸餾后期蒸汽量太大反而還會致使少部分精油損失[24-25]。由圖4可知，隨著蒸餾時間的延長，澳洲堅(jiān)果葉精油提取率逐漸增大，當(dāng)蒸餾時間為4 h時，澳洲堅(jiān)果葉精油提取率達(dá)到最大值；隨后呈降低的趨勢。綜合精油提取率、節(jié)約能耗及時間成本等方面考慮，蒸餾時間宜選擇4 h。

圖4 蒸餾時間對澳洲堅(jiān)果葉精油提取率的影響

2.2 澳洲堅(jiān)果葉精油提取工藝的正交試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

由各因素的單因素試驗(yàn)結(jié)果得知，料液比、NaCl質(zhì)量濃度和蒸餾時間對澳洲堅(jiān)果葉精油提取率的影響最大，由此確定料液比、NaCl質(zhì)量濃度和蒸餾時間為影響澳洲堅(jiān)果精油提取率的主要因素，為確定其最佳提取工藝條件，設(shè)計(jì)了正交試驗(yàn)。以精油提取率為指標(biāo)，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，得出水蒸氣蒸餾法提取澳洲堅(jiān)果葉精油的最佳工藝條件，其中加入空白列的目的在于能更好地檢驗(yàn)是否存在對試驗(yàn)結(jié)果有重要影響的因子被遺漏[18]。

極差R越大表明該因素對精油提取率的影響就越大[18]。從表2中可知，極差分析結(jié)果顯示RA＞RC＞RB，由此可得知各因素對澳洲堅(jiān)果葉精油提取率影響程度大小排序?yàn)锳＞C＞B，即料液比＞蒸餾時間＞NaCl質(zhì)量濃度。正交試驗(yàn)結(jié)果中的提取率越大表明精油提取效果越好，以澳洲堅(jiān)果葉精油提取率為指標(biāo)，選擇k1、k2、k3中最大值對應(yīng)的水平為最佳提取工藝因素水平。綜合分析得出，水蒸氣蒸餾法提取澳洲堅(jiān)果葉精油的最佳工藝條件為A3B2C2或A3B2C3，由于考慮成本因素，選擇A3B2C2，即料液比1∶5（g/mL）、NaCl質(zhì)量濃度2.5 g/100 mL、蒸餾時間3 h。

表2 澳洲堅(jiān)果葉精油提取工藝的正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析表

澳洲堅(jiān)果葉精油正交試驗(yàn)效應(yīng)曲線見圖5。圖中各因素對提取率影響變化趨勢同單因素試驗(yàn)中基本一致。

圖5 澳洲堅(jiān)果葉精油正交試驗(yàn)效應(yīng)曲線

2.3 澳洲堅(jiān)果葉精油提取工藝條件驗(yàn)證結(jié)果

為考察上述最佳工藝條件的穩(wěn)定性，按照正交試驗(yàn)得出澳洲堅(jiān)果葉精油的最佳提取條件：料液比1∶5（g/mL）、NaCl質(zhì)量濃度2.5 g/100 mL、蒸餾時間3 h、重復(fù)5次。計(jì)算得出精油提取率平均值為1.061%，與正交試驗(yàn)中的精油提取率最大值1.067%極為接近，說明正交優(yōu)化試驗(yàn)有效。

表3 澳洲堅(jiān)果葉精油提取工藝條件驗(yàn)證結(jié)果表

3 結(jié)論

研究中，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)行了正交試驗(yàn)，綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果和正交試驗(yàn)結(jié)果，分析得到水蒸氣蒸餾法提取澳洲堅(jiān)果葉精油的最佳工藝條件為料液比1∶5（g/mL）、NaCl質(zhì)量濃度2.5 g/100 mL、蒸餾時間3 h。通過極差分析得出，各因素對澳洲堅(jiān)果葉精油提取率的影響程度大小排序?yàn)榱弦罕龋菊麴s時間＞NaCl質(zhì)量濃度。