李思佳，孫衛(wèi)東*，張業(yè)輝，劉磊, ，劉容

1. 廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院（南寧 530004）；2. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所（廣州 510610）

我國(guó)甘蔗資源豐富，是產(chǎn)糖大國(guó)，年產(chǎn)量超過(guò)1億 t。甘蔗除了含有豐富的蔗糖外，還含有大量對(duì)人類(lèi)有益的植物甾醇、多糖、多酚、蔗脂、維生素和氨基酸等物質(zhì)，其中多酚類(lèi)化合物含量最高，多酚存在于植物體內(nèi)，由羥基結(jié)構(gòu)和苯環(huán)組成。植物多酚類(lèi)物質(zhì)因具有顯著的抗氧化作用，能有效預(yù)防高血糖、高血脂、心腦血管等慢性疾病[1]，常被作為抑菌劑、防腐劑等應(yīng)用于藥品、營(yíng)養(yǎng)保健等眾多領(lǐng)域。因此國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)多酚成分的分離鑒定及功能特性的研究比較感興趣[2]。目前已經(jīng)有研究將甘蔗中多酚以不同的方式提取出來(lái)，但是提取出來(lái)的甘蔗多酚粗提液中含有很多蛋白質(zhì)、糖類(lèi)等雜質(zhì)，這些雜質(zhì)會(huì)對(duì)多酚的進(jìn)一步深入研究產(chǎn)生影響[3]。因此為了更好地研究甘蔗多酚的生物活性，對(duì)甘蔗多分酚粗提物進(jìn)一步的分離純化非常有必要。

聚酰胺分離純化具有選擇性強(qiáng)、試驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、理化性質(zhì)穩(wěn)定、解吸條件溫和、可再生等諸多優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)在多酚的分離純化過(guò)程中有效成分不會(huì)失活，產(chǎn)品得率高，純度好，特別適用于多酚的分離純化[4]。因此，在完成多酚化合物提取的基礎(chǔ)上，探討了利用聚酰胺法對(duì)甘蔗多酚化合物分離純化的工藝參數(shù)，為進(jìn)一步研究甘蔗多酚類(lèi)化合物的生物活性及功能特性的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)[5]。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

甘蔗，購(gòu)于廣西五里亭；冷切豬肉，市售；乙醇、甲醇、無(wú)水硫酸鈉，均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

柱層析聚酰胺（尼龍-6），浙江省臺(tái)州市路橋四甲廠(chǎng)；UV-2802H型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；HL-2衡流泵，上海滬西分析儀器有限公司；UV-1601紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)，日本島津；電子分析天平，Metter-toledo Group；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠(chǎng)；Delta 320 pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 甘蔗梢多酚濃縮液的制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量的甘蔗梢，按照料液比1∶4（g/mL），以60%無(wú)水乙醇為浸提溶在60 ℃條件下進(jìn)行水浴提取2 h。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，得到甘蔗梢多酚濃縮液，于4 ℃冷藏保存，備用。

1.2.2 多酚含量的測(cè)定[6]

采用Folin-Denis法，測(cè)定總多酚含量。以單寧酸為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)照計(jì)算樣品中多酚含量，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為y=0.043 6x+0.167，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 7，其中y表示吸光度，x表示單寧酸含量（mg·L-1）。

1.2.3 聚酰胺樹(shù)脂預(yù)處理

取一定量聚酰胺，用90%～95%乙醇進(jìn)行浸泡，除去氣泡，并裝入柱中。用3～4倍體積的90%～95%乙醇溶液洗脫，直至洗脫液呈現(xiàn)透明并在蒸干后基本無(wú)殘?jiān)?。再分別用2～2.5倍體積的5% NaOH溶液、1倍體積的蒸餾水、2～2.5倍體積的10%乙酸溶液，最后用蒸餾水洗至pH呈中性，備用[7]。

1.2.4 聚酰胺樹(shù)脂篩選

準(zhǔn)確稱(chēng)取3 g（約15 mL）經(jīng)預(yù)處理的聚酰胺各置于錐形瓶中，加20 mL蔗梢多酚濃縮液，搖勻并過(guò)夜，過(guò)濾測(cè)其總多酚含量；40 mL 95%乙醇加入到聚酰胺中，浸泡10 h，測(cè)定總多酚含量。并按式（1）～（3）計(jì)算聚酰胺的吸附量、解吸率和吸附率。

式中：Q為總吸附量，mg；E為吸附量，%；D為解吸率，%；C0為起始溶液質(zhì)量濃度，mg·mL-1；V0為起始溶液體積，mL；Ce為吸附平衡溶液質(zhì)量濃度，mg·mL-1；Ve為吸附平衡溶液體積，mL；Cd為解吸溶液質(zhì)量濃度，mg·mL-1；Vd為解吸溶液體積，mL。

1.2.5 靜態(tài)吸附試驗(yàn)上樣液pH的確定

室溫下取3 g（3份）聚酰胺，置于3個(gè)100 mL三角瓶中，分別加水浸泡3 h，使其吸水飽和，濾掉多余水分，然后加入蔗梢多酚濃縮液20 mL，加入鹽酸調(diào)節(jié)pH為2.0，4.0和6.0。按70次/min振蕩吸附8 h，保溫靜置10 h，測(cè)其多酚含量。

1.2.6 動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)

1.2.6.1 上樣流速的確定

取3 g（約15 mL）聚酰胺聚酰胺裝入層析柱中，徑高比1∶10，將3份質(zhì)量濃度為4 mg·mL-1甘蔗多酚提取液以2，4和6 mL/min通過(guò)層析柱，測(cè)定多酚含量，繪制泄漏曲線(xiàn)[8]。聚酰胺的動(dòng)態(tài)飽和吸附量按式（4）計(jì)算。

式中：C0為上樣質(zhì)量濃度，g·mL-1；V0為上樣總體積，mL；Ci為流分i的質(zhì)量濃度，g·mL-1；Vi為流分i的體積，mL。

1.2.6.2 洗脫劑用量的確定

取甘蔗梢多酚濃縮液稀釋至4 mg·mL-1，調(diào)pH為4，以3 mL·min-1的流速通過(guò)預(yù)處理好的聚酰胺柱（50 mL）。先用純化水洗至Molish反應(yīng)為陰性后，再用無(wú)水乙醇進(jìn)行洗脫，洗脫劑濃度為20%，40%，60%和80%，濃縮洗脫液并檢驗(yàn)[9]。

1.2.7 蔗梢多酚保鮮作用的研究

配制5組抗氧化劑溶液，分別為A組（Skip+test，蒸餾水）、B組（STP，0.02%甘蔗梢多酚溶液）、C組（STP+VC，0.04% VC溶液+0.02%甘蔗梢多酚）、D組（STP+VE，0.04% VE溶液+0.02%甘蔗梢多酚）、E組（STP+VC+VE，0.04% VC+0.04% VE溶液+0.02%甘蔗梢多酚），加入到冷鮮肉中，置于溫度為4±0.5 ℃冷藏。分別于0，1，3，5，7和9 d對(duì)肉樣進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定，每次取3個(gè)重復(fù)試驗(yàn)的平均值，考察各組抗氧化劑的保鮮效果[10]。

1.2.7.1 pH的測(cè)定

采用酸度計(jì)法GB/T 5009.45—2003，取10.00 g絞碎的冷鮮肉樣品于燒杯中，加入20 mL蒸餾水，攪拌均勻，靜置15 min，然后用pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定[11]。

1.2.7.2 過(guò)氧化值（POV）的測(cè)定[12]

POV按GB/T 5009.37—2003中滴定法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

采用Origin軟件作圖和SPSS分析處理數(shù)據(jù)。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 樹(shù)脂篩選

由表1顯示，80～100目聚酰胺的甘蔗多酚殘留量比60～80目和100～200目聚酰胺低，吸附量、解吸量和解吸率明顯比60～80目和100～200目聚酰胺高很多。由此可見(jiàn)，80～100目聚酰胺對(duì)多酚類(lèi)化合物分離富集效果較好。

2.2 上樣液pH的確定

由表2中可知，pH增大，吸附量先增加后減小。pH為4，吸附后殘余多酚含量和吸附量最大，吸附量約為36.67 mg·g-1。

2.3 上樣流速的確定

由表3可知，溶液流速增加，飽和吸附量減小，加快流速會(huì)導(dǎo)致吸附效率減小，不利于甘蔗梢多酚的分離純化，造成原料損失。所以上樣流速在2～4 mL·min-1最佳。

表3 不同流速下的泄漏參量

2.4 洗脫劑用量的確定

由圖1可知，多酚的含量隨著洗脫劑濃度的增加呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，當(dāng)洗脫劑的濃度為60%時(shí)，多酚含量最多，為175.67 mg。

圖1 不同洗脫液對(duì)甘蔗梢多酚的洗脫效果

2.5 蔗梢多酚保鮮作用的研究

2.5.1 pH測(cè)定

由圖2可知，冷鮮肉的pH是先上升后下降的，因?yàn)閯?dòng)物被屠宰后的生理變化可分為僵硬、解僵和自溶[13]。前期糖元降解不斷產(chǎn)生乳酸等酸性物質(zhì)，使pH下降，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，冷鮮肉中的氨基酸、蛋白質(zhì)等不斷分解產(chǎn)生揮發(fā)性的胺類(lèi)物質(zhì)，導(dǎo)致pH上升。對(duì)照組的pH升高較快，第3天后的pH超過(guò)新鮮肉的標(biāo)準(zhǔn)，與其他各組之間差異顯著[14-17]。其他各組第9天時(shí)仍未超過(guò)正常范圍，說(shuō)明復(fù)合化學(xué)保鮮劑和溶菌酶等能有效控制肉樣的pH變化，增強(qiáng)肉的保鮮效果[18]。

2.5.2 過(guò)氧化值的測(cè)定

過(guò)氧化值（POV）是表征脂肪酸和油脂等被氧化程度大小的一種指標(biāo)。圖3表明，不同預(yù)處理?xiàng)l件下肉樣中的過(guò)氧化物含量都是先上升再下降的趨勢(shì)。在5 d左右，所有肉樣的POV值全部升至最高值，然后下降[19]。在整個(gè)期間，1組（對(duì)照組）的POV值普遍高于其他各組；2組（甘蔗梢多酚）的POV值也較高，僅次于1組（對(duì)照組）；4組（甘蔗梢多酚+VE）的POV比3組（甘蔗梢多酚+VC）低；5組（甘蔗梢多酚+VC+VE）肉樣的POV值一直保持最低[20]。因此，各組肉樣的抗氧化效果依次為：5組＞4組＞3組＞2組＞1組。

圖2 冷鮮肉保存期間pH的變化

圖3 冷鮮肉保存期間POV值的變化

3 結(jié)論

聚酰胺吸附層析法對(duì)植物成分的純化和分離主要用于生物堿、多糖、黃酮類(lèi)、皂苷等成分的研究。它工藝操作簡(jiǎn)單，對(duì)多酚等活性物質(zhì)分離純化效果好，且再生重復(fù)使用，成本低，可以節(jié)約能源和耗材等一些輔助物品。因此被廣泛地應(yīng)用于各種功能成分的分離純化，優(yōu)化工藝條件如下：80～100目聚酰胺，溶液pH為4，上樣流速在2～4 mL·min-1之間，60%乙醇溶液洗脫。純度可達(dá)86.15%。與未加甘蔗多酚的樣品的POV值和pH對(duì)比可知，甘蔗多酚對(duì)冷鮮肉有保鮮的效果，其中保鮮效果最好的組合是甘蔗梢多酚+VC+VE，與其他幾種處理方法相比POV值處于較低水平，且pH變化非常穩(wěn)定。