魏荷琳，毛霞，南澤東，封家福

樂山職業(yè)技術(shù)學(xué)院（樂山 614000）

胡蘆巴是豆科一年生草本植物，又名蘆巴子、香豆子。在我國(guó)，胡蘆巴主要產(chǎn)于安徽、河南、四川、新疆、陜西等地，富含有多種有效成分如薯蕷皂苷、有機(jī)酸、油脂和色素等，具有很好的滋補(bǔ)和營(yíng)養(yǎng)功效[1-5]。近年來，雖然就其有效成分的提取分離開展一些研究，然而大部分研究主要集中在提取物的藥理作用方面[6-7]。薯蕷皂苷元作為甾體工業(yè)的一種原料，主要是從薯蕷科植物中提制而得，通常被用來合成一些甾體激素類藥物和避孕藥等，同時(shí)還具有抑制癌細(xì)胞增殖[8]、肝臟保護(hù)[9]和抗糖尿病等功效[10-11]。隨著葫蘆巴種植業(yè)和制膠工業(yè)發(fā)展，人們?cè)絹碓揭庾R(shí)到從制膠后葫蘆巴渣中提取薯蕷皂苷元的重要性和必要性。從葫蘆巴中提取薯蕷皂苷元，通常采用水回流提取法、有機(jī)溶劑提取法和酶解法等[5,12]，這些提取工藝直接影響薯蕷皂苷元的純度及產(chǎn)品質(zhì)量[13-14]。

采用預(yù)浸泡-超聲法提取工藝，考察浸泡時(shí)間、液料比、原料目數(shù)、超聲時(shí)間對(duì)薯蕷皂苷元提取率的影響，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為葫蘆巴的資源化綜合利用和質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 主要儀器與設(shè)備

1525 EF高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；501-A型超級(jí)恒溫水?。ㄉ虾Ｆ謻|榮豐科學(xué)儀器有限公司）；101 A-1電熱鼓風(fēng)干燥箱（蘇州同福烘箱制造有限公司）；JJ-1定時(shí)電動(dòng)攪拌器（上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司）；RE-52 AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海嘉鵬科技公司）；TG 328-A分析天平（沈陽天平儀器有限責(zé)任公司）；UT-40超聲波發(fā)生器（廣州蘭泰儀器有限公司）；SHZ-CB立式循環(huán)水真空泵（上海普渡生化科技有限公司）；TG 16臺(tái)式高速離心機(jī)（北京瑞利分析儀器公司）；JC 517-201/525雙波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器（北京百萬電子科技中心）；WFH-203 B暗箱式三用紫外分析儀（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）。

1.2 主要試劑與藥品

脫膠葫蘆巴豆粉（脫膠率≥25%，楊凌上禾植物科技有限公司）；醋酸鈉（分析純，天津化學(xué)試劑廠）；羧甲基纖維素鈉（分析純，天津化學(xué)試劑廠）；薯蕷皂苷元標(biāo)準(zhǔn)品（98%，上海喬羽生物科技有限公司）；纖維素酶（活力單位6萬 u/g，日本Yakult）；氫氧化鈉、乙醇、石油醚、鹽酸、冰乙酸（分析純，西安試劑廠）；甲醇（液相色譜純，天津瑞金特化學(xué)品公司）；硫酸（分析純，天津化學(xué)試劑廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 薯蕷皂苷元含量測(cè)定

2.1.1 HPLC色譜條件

Waters C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）色譜柱；流動(dòng)相：甲醇-水溶液，體積比90∶10；柱溫25 ℃；流速1 mL/min；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)206 nm；進(jìn)樣量20 μ L。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取薯蕷皂苷元標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg，用甲醇溶解后放置與5 mL容量瓶中，定容、搖勻即可得1.0 mg/mL的薯蕷皂苷元標(biāo)準(zhǔn)品貯備液。

2.1.3 供試品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取脫脂后的胡蘆巴粉末20 g加入700 mL水溶液中預(yù)浸泡若干小時(shí)，在功率300 W、頻率50 kHz的超聲波下提取20 min后濃縮，將其酸濃度調(diào)節(jié)到1.2 mol/L，90 ℃下回流水解5 h，過濾掉酸液，將水解物通過Na2CO3中和水洗至中性，干燥濾餅并加入一定量的石油醚索氏抽提5 h，濃縮提取液稱質(zhì)量并干燥，得到皂苷元樣品，準(zhǔn)確稱取該樣品20 g用甲醇溶解，定容搖勻后過濾，即得供試品溶液，備用。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取薯蕷皂苷元標(biāo)準(zhǔn)品稀釋并溶解于流動(dòng)相，制備薯蕷皂苷元系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，其薯蕷皂苷元含量分別為0.10，0.20，0.40，0.60，0.80，0.10和1.2 mg/mL。按照2.1.1色譜條件分別進(jìn)樣20 μL，以薯蕷皂苷元的峰面積為縱坐標(biāo)Y，標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)X，得到線性回歸方程：Y=5.573 7×106X-3.221 5×104，R=0.999 9。表明質(zhì)量濃度在0.10～1.2 mg/mL范圍內(nèi)的線性關(guān)系較好。

2.1.5 薯蕷皂苷元提取率的計(jì)算

采用外標(biāo)準(zhǔn)法測(cè)定，按2.1.1中色譜條件將2.1.3下制備的供試品溶液進(jìn)樣20 μL，用兩針重復(fù)進(jìn)樣所得數(shù)據(jù)的平均值計(jì)算結(jié)果。薯蕷皂苷元提取率可根據(jù)式（1）計(jì)算。

式中：V為樣品溶液體積，mL；M為原料中薯蕷皂苷元的總含量，mg；C1為標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度，mg/mL；S1為標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積，μV·s；S2為樣品溶液峰面積，μV·s。

2.1.6 精密度試驗(yàn)

取2.1.2配制的1.0 mg/mL薯蕷皂苷元標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在2.1.1所述色譜條件下進(jìn)樣20 μL，重復(fù)進(jìn)樣8次，測(cè)定峰面積，求得RSD值為1.03%（n=8），表明儀器精密度良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取薯蕷皂苷元樣品10 g，按照2.1.3供試品溶液的制備方法制備樣品溶液，分別于0，2，4，6和8 h按2.1.1所述色譜條件進(jìn)樣20 μL，測(cè)定峰面積，求得RSD值為1.29%（n=5），表明供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.1.8 重復(fù)性試驗(yàn)

按2.1.3供試品溶液的制備方法制備6份樣品溶液，按2.2.1所述色譜條件測(cè)定峰面積，求得RSD值為1.56%（n=6），表明該檢測(cè)方法重復(fù)性比較好。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 原料粒度

在浸泡時(shí)間4 h、料水比1∶14（g/mL）、超聲時(shí)間30 min條件下測(cè)定原料粒度對(duì)薯蕷皂苷元提取率的影響，結(jié)果見圖1（A）所示。原料粒度較小情況下，薯蕷皂苷元提取率隨目數(shù)增大而提高，40目以后繼續(xù)減小粒度，提取率趨于平緩，且有略微下降趨勢(shì)，這是因?yàn)樵狭６忍蟛焕诔暡ㄆ票冢瑥亩沟糜行С煞州^難溶出，粒度太小又會(huì)使粉碎物料容易凝集，致使濾餅中殘留液較多影響過濾效果，從而導(dǎo)致提取率反而下降。因此實(shí)際操作過程中應(yīng)以40～60目為宜。

2.2.2 料液比

在浸泡時(shí)間4 h、原料粒度40目、超聲時(shí)間30 min條件下考察料液比對(duì)薯蕷皂苷元提取率的影響。結(jié)果如圖1（B）所示。料液比1∶14（g/mL）以下時(shí)隨著料液比提高提取率逐漸增加，且增加幅度較大，再繼續(xù)增加料液比，提取率雖然有所增加，但增加幅度較相對(duì)小了很多，這是因?yàn)榱弦罕冗^小時(shí)容器無法有效潤(rùn)濕樣品，致使提取率明顯較低，料液比過大又會(huì)阻礙超聲波破碎細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞破碎程度下降，從而影響薯蕷皂苷元的提取率。

2.2.3 浸泡時(shí)間

在料液比1∶14（g/mL）、原料粒度40目、超聲時(shí)間30 min條件下考察浸泡時(shí)間對(duì)提取率的影響，結(jié)果見圖1（C）所示。預(yù)浸泡時(shí)間少于6 h時(shí)，隨著浸泡時(shí)間增加提取率逐漸升高，且在6 h時(shí)達(dá)到最高值，在6 h以后繼續(xù)增加浸泡時(shí)間，提取率開始呈下降趨勢(shì)，表明合適的預(yù)浸泡時(shí)間能有效使溶劑深入到原料細(xì)胞內(nèi)部，有利于薯蕷皂苷元提取，但是浸泡時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)使得溶液濃度增大，從而致使提取過程中的傳質(zhì)阻力增加，反而對(duì)提取效果不利。因此，預(yù)浸泡時(shí)間6 h左右為宜。

2.2.4 超聲時(shí)間

在料液比1∶14（g/mL）、原料粒度40目、浸泡時(shí)間4 h條件下考察超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響。結(jié)果見圖1（D），超聲提取時(shí)間30 min以內(nèi)，提取率隨超聲時(shí)間增加而增大，繼續(xù)增加超過30 min以后，提取率開始下降。因此，超聲時(shí)間30 min為宜。

圖1 原料粒度（A）、料液比（B）、浸泡時(shí)間（C）和超聲時(shí)間（D）對(duì)提取率的影響

2.3 響應(yīng)面分析

2.3.1 因素水平的選取

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇浸泡時(shí)間2～10 h、料液比1∶12～1∶18（g/mL）、原料粒度20～100目、超聲時(shí)間10～50目，根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗(yàn)原理進(jìn)行設(shè)計(jì)，-alpha、-1、0、+1、+alpha代表自變量水平設(shè)計(jì)試驗(yàn)，表1列出自變量的試驗(yàn)水平范圍及其編碼。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平

2.3.2 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果分析見表2，同時(shí)利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析及二次多項(xiàng)式回歸擬合，方差分析結(jié)果見表3，擬合得到的回歸方程：薯蕷皂苷元提取率Y=81.99+2.72A+4.79B+2.34C+3.11D-1.12AB-1.26AC+1.83AD-0.56BC+0.41BD+0.36CD-1.08A2-1.40B2-2.73C2-3.89D2。

從表2的數(shù)據(jù)可以看出，試驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值很接近，表明該模型的適用性很好。從方差分析表3可知，各因素對(duì)薯蕷皂苷元提取率影響程度依次為：B（料液比）＞D（超聲時(shí)間）＞A（浸泡時(shí)間）＞C（原料粒度）。模型p＜0.000 1，失擬差p＞0.05，表明該方程擬合度良好、模型顯著、預(yù)測(cè)性理想、可應(yīng)用其優(yōu)化提取工藝。同時(shí)，相關(guān)系數(shù)R=0.988 4，驗(yàn)證實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值高度相關(guān)。

各因素之間交互作用對(duì)提取率的影響可通過響應(yīng)面曲面較為直觀地反映。薯蕷皂苷元提取率的響應(yīng)曲面3D圖譜如圖2所示。從圖2可以看出，料液比與超聲時(shí)間、超聲時(shí)間與浸泡時(shí)間、料液比與浸泡時(shí)間的交互作用均非常顯著。運(yùn)用Design-Expert 8.0.6軟件優(yōu)化所得的預(yù)浸泡-超聲法提取葫蘆巴中薯蕷皂苷元最佳工藝為：浸泡時(shí)間6.70 h、料液比1∶15.98 g/mL、原料粒度62.4目、超聲時(shí)間34.80 min，此時(shí)薯蕷皂苷元的提取率為86.89%。

圖2 響應(yīng)面分析圖

2.4 模型驗(yàn)證試驗(yàn)

為驗(yàn)證該模型的適用性，在優(yōu)化出的最優(yōu)工藝條件下進(jìn)行3組平行試驗(yàn)，所得薯蕷皂苷元收率分別為87.36%，85.88%和86.73%，平均收率為86.66%，與模型預(yù)測(cè)值86.89%基本一致，該模型擬合良好，有良好重現(xiàn)性。

3 討論

通過選取合適參數(shù)水平，考察浸泡時(shí)間、料液比、原料粒度和超聲時(shí)間對(duì)薯蕷皂苷元提取率的影響，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法對(duì)預(yù)浸泡-超聲法提取薯蕷皂苷元工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到最優(yōu)提取工藝條件為：浸泡時(shí)間6.70 h、料液比1∶15.98 g/mL、原料粒度62.4目、超聲時(shí)間34.80 min。此時(shí)薯蕷皂苷元的收率為86.89%，并對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證，試驗(yàn)證明該模型擬合良好，有良好重現(xiàn)性。研究為從胡蘆巴中提取薯蕷皂苷元提供依據(jù)。