張悅，張川，李中媛，宋亞囝，羅學(xué)剛

1. 省部共建食品營(yíng)養(yǎng)與安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院（天津 300457）；2. 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)（天津 300457）；3. 天津市微生物代謝與發(fā)酵過程控制技術(shù)工程中心（天津 300457）

酸粥是我國(guó)河套地區(qū)（內(nèi)蒙古、山西、陜西部分地帶）傳統(tǒng)谷物自然發(fā)酵食品，蘊(yùn)含著大量微生物，營(yíng)養(yǎng)豐富[1-2]。張春林[3]利用PCR-DGGE技術(shù)對(duì)內(nèi)蒙古地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵酸粥中的微生物進(jìn)行多樣性分析，研究發(fā)現(xiàn)酸粥中乳酸菌種類居多。Qin等[4]通過宏基因組學(xué)檢測(cè)山西地區(qū)傳統(tǒng)酸粥中的微生物，發(fā)現(xiàn)乳酸菌和醋酸菌為優(yōu)勢(shì)菌屬，并且研究發(fā)現(xiàn)酸粥中乳酸、乙酸、游離氨基酸含量較高。

傳統(tǒng)制作酸粥的最佳原料就是沿黃河一帶生長(zhǎng)的糜米。流傳于民間的做法是將糜米淘洗干凈后放入陶瓷罐中，加入酸漿引子發(fā)酵一夜，撈出糜米加水煮熟，煮至糜米開花便可食用。將煮米水晾涼補(bǔ)充回酸漿罐中，便可重復(fù)使用[5]。但目前，酸粥的制作一般只在家庭中完成，生產(chǎn)工藝各有不同，導(dǎo)致不同家庭的酸粥品質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)成分不穩(wěn)定[6]。并且，酸粥的食用安全性難以保證，難于大規(guī)模推廣生產(chǎn)。

響應(yīng)面法是先通過合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)并對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，建立各影響因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，得到一個(gè)回歸方程，經(jīng)分析后給出最優(yōu)工藝參數(shù)[7-9]。目前，這種方法已被廣泛應(yīng)用于糧油食品、化學(xué)化工等方面的工藝配方設(shè)計(jì)及加工工藝條件的優(yōu)化[10-13]。因此，試驗(yàn)采用響應(yīng)面法探究酸粥穩(wěn)定的制作工藝，優(yōu)化傳統(tǒng)發(fā)酵食品風(fēng)味，為實(shí)現(xiàn)我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸漿（山西河曲縣）、糜米（山西河曲縣）、陶瓷罐（10.8 cm×10.8 cm）。

1.2 儀器與設(shè)備

普通生化培養(yǎng)箱（上海科諾希莫儀器有限公司）、電磁爐。

2 試驗(yàn)方法

2.1 工藝流程

糜米→淘洗→瀝干→加水→預(yù)煮殺菌→冷卻→裝入陶瓷罐→添加酸漿發(fā)酵→加水蒸煮至糜米開花→酸粥成品

操作要點(diǎn)：準(zhǔn)確稱取30 g糜米作為原料米，淘洗后瀝干水分，置于超凈臺(tái)中紫外滅菌，添加180 mL高壓滅菌后的水，置于電磁爐上預(yù)煮殺菌（65 ℃、30 min），冷卻后裝入預(yù)先高壓滅菌過的陶瓷罐內(nèi)，添加150 mL酸漿作為發(fā)酵引子，密封置于32 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，發(fā)酵20 h后，取出置于鐵容器中，加150 mL水，蒸煮至糜米開花，即得酸粥成品。

2.2 單因素試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取30 g糜米，按照質(zhì)量體積比，根據(jù)單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以感官評(píng)分為指標(biāo)，以酸度作為參考。分別考察加水量倍數(shù)、預(yù)煮殺菌條件、添加酸漿倍數(shù)、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間及蒸煮時(shí)加水倍數(shù)對(duì)酸粥口感的影響。因素水平見表1。

表1 單因素試驗(yàn)因素水平表

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素的試驗(yàn)結(jié)果，采用軟件Design-Expert 8.0.6，選擇添加酸漿倍數(shù)、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間為因素進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化傳統(tǒng)酸粥的制備工藝，因素水平見表2。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)因素水平表

根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)，建立以添加酸漿倍數(shù)、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間為自變量的回歸方程，通過ANOVA分析，對(duì)傳統(tǒng)酸粥的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化。并對(duì)優(yōu)化所得結(jié)果進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，證明所得工藝的可行性。

2.4 感官評(píng)定方法

為統(tǒng)一產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、探究傳統(tǒng)酸粥最佳制備工藝，制定感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[14]，如表3所示。邀請(qǐng)10名本專業(yè)學(xué)生對(duì)蒸煮后酸粥進(jìn)行綜合評(píng)定：產(chǎn)品總得分=（風(fēng)味+口感+色澤+質(zhì)地）/4，最終得分為10名學(xué)生分?jǐn)?shù)加和后的平均值。

表3 感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)表

2.5 酸粥理化指標(biāo)的測(cè)定

對(duì)優(yōu)化后的酸粥進(jìn)行酸度和總糖的測(cè)定。酸度根據(jù)GB/T 12456—2008進(jìn)行酸度滴定，總糖采用苯酚硫酸法[15]測(cè)定。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 原料米與加水量固液比探究

加水量的多少在很大程度上影響酸粥發(fā)酵后的口感。如圖1（A）所示，隨著加水量倍數(shù)的增加，酸度呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，可能是水在其中起到了稀釋的作用。感官評(píng)價(jià)呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，加水量較少，酸味過重，感官評(píng)分較低；加水量過多，無明顯酸味。當(dāng)加水量為原料的6倍時(shí)，酸度適中，感官評(píng)價(jià)最高。

3.1.2 預(yù)煮殺菌條件的探究

為了不影響所購(gòu)買的酸漿引子中微生物的獨(dú)特性，在發(fā)酵之前將糜米預(yù)煮殺菌。如圖1（B）所示，當(dāng)改變預(yù)煮殺菌條件時(shí)，酸度均在82～87 g/kg之間，酸味無明顯差別。但是，當(dāng)蒸煮溫度較高時(shí)，米粒的粒形被破壞。65 ℃/30 min作為巴氏低溫殺菌常用條件，通常有較好的殺菌作用。且經(jīng)過此條件處理過的樣品，酸味怡人，且米湯稠度適中，感官評(píng)價(jià)最好。

3.1.3 添加酸漿倍數(shù)的探究

酸漿為自然發(fā)酵谷物的產(chǎn)物，其中蘊(yùn)含著大量的微生物。如圖1（C）所示，隨著酸漿添加倍數(shù)（接種量）的增加，酸度和感官評(píng)價(jià)均呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)接種量較少時(shí)，酸味不足；當(dāng)接種量為4倍時(shí)，酸度最高，酸味過重，明顯遮蓋了糜米的香味；當(dāng)接種量為5倍時(shí)，酸度適中，感官評(píng)價(jià)最好。接種量過高，酸度有所下降，可能是谷物營(yíng)養(yǎng)成分及罐體空間有限，不利于菌株生長(zhǎng)代謝。

3.1.4 發(fā)酵溫度的探究

發(fā)酵溫度對(duì)微生物的生長(zhǎng)代謝具有很大影響，在很大程度上影響著酸粥的口感。如圖1（D）所示，隨著溫度的增高，酸度與感官評(píng)價(jià)均呈現(xiàn)出先增加后下降的趨勢(shì)。溫度較低時(shí)，菌株代謝能力較差，產(chǎn)酸能力較低，無明顯酸味。當(dāng)溫度為35 ℃時(shí)，酸味明顯，口感怡人。但是當(dāng)溫度升高至40 ℃時(shí)，酸度明顯下降，可能是高溫不適宜菌株的生長(zhǎng)，且口感較粗糙。

3.1.5 發(fā)酵時(shí)間的探究

發(fā)酵時(shí)間影響著酸粥的口感，不宜過短或過長(zhǎng)。如圖1（E）所示，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，前18 h內(nèi)酸度變化明顯，但18～36 h之間酸度無明顯變化?？赡苁且?yàn)殡S著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，無可利用底物，產(chǎn)酸停止。感官評(píng)價(jià)呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，當(dāng)酸度較低時(shí)，酸味略淺；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間過長(zhǎng)時(shí)，有異味。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為24 h時(shí)，酸味適中，感官評(píng)分最高。

3.1.6 蒸煮時(shí)加水量的探究

對(duì)發(fā)酵后的酸粥進(jìn)行蒸煮，加水量影響食用口感。加水量過少，酸粥口感過酸；加水量過多，則反之。如圖1（F）所示，隨著蒸煮時(shí)加水量倍數(shù)的增加，感官評(píng)分先增加后減小。當(dāng)蒸煮時(shí)加水量體積為糜米質(zhì)量的5倍時(shí)，酸甜適中，感官評(píng)分最高。

圖1 單因素水平優(yōu)化圖

3.2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

3.2.1 回歸模型的建立

采用軟件Design-Expert 8.0.6進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)處理，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表4。經(jīng)多元回歸擬合，得到以感官評(píng)分（Y）為響應(yīng)值的回歸方程：

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表5可知，所得二次方程模型極其顯著（p＜0.000 1），失擬項(xiàng)不顯著（p=0.878 4＞0.05），說明該模型能充分反映酸粥發(fā)酵的實(shí)際情況。與此同時(shí)，方程的相關(guān)系數(shù)R2=0.988 1，調(diào)整相關(guān)系數(shù)R2Adj=0.972 8，說明該模型能解釋97.28%的響應(yīng)值的變化。由方差分析可知，一次項(xiàng)因素A、B，二次項(xiàng)因素A2、B2、C2，交互項(xiàng)AB對(duì)響應(yīng)值有極顯著的影響；一次項(xiàng)因素C，交互項(xiàng)AC對(duì)響應(yīng)值有顯著影響；而交互項(xiàng)BC對(duì)響應(yīng)值無顯著影響。3個(gè)因素中對(duì)響應(yīng)值的影響按從大到小的順序排列為A＞B＞C，即發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時(shí)間＞酸漿倍數(shù)。

表5 回歸方程的方差分析

3.2.2 響應(yīng)面分析

響應(yīng)曲面坡度的陡峭程度說明隨著影響因素的變化，其對(duì)響應(yīng)值的變化情況[8]；而等高線的形狀可反映交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，橢圓形表示兩因素交互作用對(duì)響應(yīng)值顯著，而圓形則與之相反[16]。從圖2～圖4中能夠看出，感官評(píng)分（Y）隨發(fā)酵溫度的升高而先增大后減?。煌瑯?，隨發(fā)酵時(shí)間的增長(zhǎng)也先增大后減小。然而，酸漿倍數(shù)的變化對(duì)感官評(píng)分（Y）的影響相對(duì)不明顯。

綜合圖2～圖4響應(yīng)面圖可知，發(fā)酵溫度與發(fā)酵時(shí)間的交互作用，發(fā)酵溫度與酸漿倍數(shù)的交互作用對(duì)感官評(píng)分的影響較大。

綜合圖2～圖4等高線圖可知，發(fā)酵溫度對(duì)感官評(píng)分的影響最大，其次是發(fā)酵時(shí)間、酸漿倍數(shù)。

圖2 發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間的相互影響及等高線分析圖

圖3 發(fā)酵溫度和酸漿倍數(shù)的相互影響及等高線分析圖

圖4 發(fā)酵時(shí)間和酸漿倍數(shù)的相互影響及等高線分析圖

3.3 最優(yōu)發(fā)酵工藝的確定和驗(yàn)證

利用軟件對(duì)回歸方程進(jìn)行分析處理，獲得最優(yōu)工藝參數(shù)：發(fā)酵溫度31.82 ℃、發(fā)酵時(shí)間19.11 h、酸漿倍數(shù)5.29倍?？紤]到實(shí)際操作的可行性，實(shí)際操作中取值為發(fā)酵溫度32 ℃、發(fā)酵時(shí)間20 h、酸漿倍數(shù)5倍。為了驗(yàn)證響應(yīng)面法的可靠性，取最優(yōu)工藝條件進(jìn)行3組重復(fù)試驗(yàn)，所得感官評(píng)分平均取值為32.8分，與理論值33.0分非常接近。在允許范圍內(nèi)，說明響應(yīng)面法對(duì)傳統(tǒng)酸粥制備工藝的優(yōu)化是可行、有效的。

3.4 優(yōu)化后酸粥理化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

優(yōu)化后酸粥酸度：取適量?jī)?yōu)化后酸粥樣品，根據(jù)GB/T 12456—2008，優(yōu)化后酸粥酸度為46.61 g/kg。

優(yōu)化后總糖：測(cè)定不同濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)。通過Origin Pro 8.0分析，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=13.070 99x-0.005 48（R2=0.998 26）。優(yōu)化后酸粥樣品的總糖質(zhì)量濃度為0.916 mg/mL。

4 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化酸粥傳統(tǒng)制備工藝。方差分析得出影響酸粥感官評(píng)分的因素依次為：發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、酸漿倍數(shù)。其中，發(fā)酵溫度及其二次項(xiàng)因素、發(fā)酵時(shí)間及其二次項(xiàng)因素、酸漿倍數(shù)二次項(xiàng)因素、發(fā)酵溫度與發(fā)酵時(shí)間交互作用對(duì)感官評(píng)分的影響極顯著（p＜0.01）；酸漿倍數(shù)、發(fā)酵溫度與酸漿倍數(shù)交互作用對(duì)感官評(píng)分的影響顯著（p＜0.05）；發(fā)酵時(shí)間與酸漿倍數(shù)的交互作用對(duì)感官評(píng)分無顯著影響。通過響應(yīng)面法優(yōu)化得到最佳工藝參數(shù)，并按照實(shí)際操作情況修改得出傳統(tǒng)酸粥制備工藝：發(fā)酵溫度32 ℃、發(fā)酵時(shí)間20 h、酸漿倍數(shù)5倍。在此工藝下，經(jīng)3次重復(fù)試驗(yàn)驗(yàn)證，酸粥感官評(píng)分為32.8分，與理論值（33.0分）十分接近，優(yōu)化效果明顯，優(yōu)化后酸粥口感得到改善，風(fēng)味獨(dú)特，口感怡人。利用響應(yīng)面法得到的傳統(tǒng)酸粥制備工藝參數(shù)真實(shí)有效。優(yōu)化后的酸粥酸度為46.61 g/kg，總糖質(zhì)量濃度為0.916 mg/mL。