周艷華，張鵬飛，李濤，羅慶華，王建文

1. 長(zhǎng)沙環(huán)境保護(hù)職業(yè)技術(shù)學(xué)院（長(zhǎng)沙 410004）；2. 湖南湘典食品有限公司（長(zhǎng)沙 410031）；3. 湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院（長(zhǎng)沙 410111）；4. 吉首大學(xué)大鯢資源保護(hù)與綜合利用湖南省工程實(shí)驗(yàn)室（張家界 427000）；5. 張家界金鯢生物工程股份有限公司（張家界 427000）

隨著中國(guó)大鯢（學(xué)名Andrias davidianus，簡(jiǎn)稱大鯢）的規(guī)?；B(yǎng)殖，每年生產(chǎn)商品大鯢約12 000萬(wàn) kg，其中有大量大鯢皮作為大鯢加工副產(chǎn)物而被丟棄。據(jù)報(bào)道，大鯢皮中含有豐富的蛋白質(zhì)，其粗蛋白含量占大鯢皮干質(zhì)量的96.46%，大鯢皮中膠原蛋白含量換算成干質(zhì)量達(dá)60.66%，約占大鯢皮中蛋白質(zhì)總量的62.89%[1]。近年來(lái)，有少量關(guān)于從濕態(tài)大鯢皮中提取膠原蛋白的報(bào)道。其中，李莉等[2]優(yōu)化人工養(yǎng)殖大鯢皮中膠原蛋白的提取工藝，結(jié)果表明，大鯢皮膠原蛋白提取率可達(dá)66.99%。顧賽麒等[1]提取大鯢皮中酸溶性膠原蛋白和酶溶性膠原蛋白，提取率分別為28.88%和66.99%，結(jié)果表明，膠原蛋白的三股螺旋結(jié)構(gòu)較為完整。袁通等[3]優(yōu)化大鯢皮膠原蛋白提取工藝，結(jié)果表明，膠原蛋白提取率可達(dá)71.94%。李靜等[4]以膠原蛋白肽提取率為指標(biāo)，研究高溫高壓對(duì)提高大鯢皮膠原蛋白肽提取率的影響，結(jié)果表明，在優(yōu)化的條件下其提取率可達(dá)80.76%。金文剛等[5]研究從大鯢皮中提取明膠的工藝條件，其中明膠提取率可達(dá)13.76%。目前鮮見從干制大鯢皮中提取膠原蛋白的報(bào)道。新鮮濕態(tài)大鯢皮水分高，在常溫下保存易滋生細(xì)菌致腐爛變質(zhì)，需采用低溫保存。但低溫保存存在耗能高導(dǎo)致成本高等問(wèn)題。此外，采用新鮮濕態(tài)大鯢皮樣品加工，存在地域性要求高等問(wèn)題。若異地加工，需采用冷凍車等工具運(yùn)輸，導(dǎo)致物流成本大大提高。因此，試驗(yàn)以經(jīng)干燥粉碎后的大鯢皮為試驗(yàn)樣品，研究從干制大鯢皮中提取膠原蛋白的最適提取工藝條件。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用紫外光譜掃描、紅外光譜掃描分析干制大鯢皮膠原蛋白理化性質(zhì)，旨在為大鯢皮跨地區(qū)加工，節(jié)約冷凍、運(yùn)輸?shù)壬a(chǎn)加工成本，并為后續(xù)大鯢皮膠原蛋白應(yīng)用研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

大鯢皮（張家界金鯢生物股份有限公司）；羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品（美國(guó)Sigma公司）；透析袋（上海源葉生物科技有限公司）；胃蛋白酶（1 200 U/g）、乙酸、氫氧化鈉、正丁醇等（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

AR-2140電子分析天平（美國(guó)奧豪斯儀器（上海）有限公司）；1-4 LD型冷凍干燥機(jī)（德國(guó)ALPHA公司）；Avanti J-26 XP冷凍離心機(jī)（美國(guó)Beckman Coulter公司）；pHS-3 C型精密pH計(jì)（上海雷磁儀器廠）；DK-98-11 A恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；SHA-B水浴恒溫振蕩器（常州國(guó)華電器有限公司）；FYL-C 020 E料理機(jī)（九陽(yáng)股份有限公司）；FW 100萬(wàn)能粉碎機(jī)（天津泰斯特儀器有限公司）；NEXUS-470傅立葉紅外光譜儀（Nicolet Instrument Corp）；UV 1800紫外可見分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 干制大鯢皮粉末的制備

將大鯢皮去除皮下脂肪，剪成小塊，于50～60 ℃下加熱烘至干。將干制大鯢皮置于粉碎機(jī)中粉碎，包裝待用。

1.3.2 干制大鯢皮膠原蛋白的制備

將干制大鯢皮粉末先采用0.1 mol/L NaOH溶液浸泡24 h以去除非膠原蛋白，其間更換1次堿液，用去離子水洗滌至中性后，用體積分?jǐn)?shù)10%正丁醇溶液浸泡24 h以去除脂肪，其間更換1次溶液，用去離子水洗滌至中性[4]。在此基礎(chǔ)上，加入0.5 mol/L乙酸溶液（料液比1∶20 g/mL），于4 ℃下溶脹大鯢皮24 h，組織搗碎，得到大鯢皮勻漿液。加入一定量胃蛋白酶，于4 ℃下酶解。酶解完成后，于100 ℃滅酶10 min，過(guò)濾，濾液10 000 r/min冷凍離心10 min得上清液，上清液即為大鯢皮膠原蛋白粗提液。向上清液中加入NaCl鹽析，至NaCl濃度0.9 mol/L，過(guò)夜，冷凍離心收集沉淀。沉淀溶于0.5 mol/L乙酸，以0.5 mol/L醋酸透析2 d，用純水透析2 d，透析時(shí)每天更換3次透析外液，透析后得到膠原蛋白提取液，冷凍干燥，得大鯢皮膠原蛋白成品，純化后的膠原蛋白呈白色海綿狀。

1.3.3 胃蛋白酶酶解大鯢皮制備膠原蛋白工藝條件單因素試驗(yàn)

1.3.3.1 酶添加量的確定

以3 000，4 000，5 000，6 000和7 000 U/g（以干制大鯢皮質(zhì)量計(jì)，下同）的胃蛋白酶添加量，于pH 2.0下酶解4 h，測(cè)定膠原蛋白提取率，確定胃蛋白酶添加量。

1.3.3.2 酶解pH的確定

其他條件不變，按上述確定的酶添加量，分別選擇pH 1.5，2.0，2.5，3.0和3.5時(shí)酶解，測(cè)定膠原蛋白提取率，確定最適pH。

1.3.3.3 酶解時(shí)間的確定

其他條件不變，按上述確定的酶添加量、pH，分別選擇酶解時(shí)間3，4，5，6和7 h時(shí)酶解，測(cè)定膠原蛋白提取率，確定最適酶解時(shí)間。

1.3.4 胃蛋白酶酶解大鯢皮制備膠原蛋白工藝條件正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以膠原蛋白提取率為指標(biāo)，對(duì)酶添加量、pH和酶解時(shí)間3個(gè)因素設(shè)計(jì)L9(33)正交試驗(yàn)，以確定酶解的最佳工藝條件，各因素及水平表如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

1.3.5 干制大鯢皮膠原蛋白理化性質(zhì)的測(cè)定

1.3.5.1 干制大鯢皮膠原蛋白紫外光譜掃描

將干制大鯢皮膠原蛋白樣品溶于0.5 mol/L乙酸溶液中，配制1 mg/mL的膠原蛋白溶液，采用紫外-可見分光光度計(jì)于波長(zhǎng)190～400 nm對(duì)其進(jìn)行掃描，記錄試驗(yàn)結(jié)果。

1.3.5.2 干制大鯢皮膠原蛋白紅外光譜掃描

將干制大鯢皮膠原蛋白樣品與KBr在瑪瑙研缽中混合研磨，手動(dòng)壓片，置于傅里葉紅外光譜儀中掃描，掃描范圍4 000～400 cm-1，記錄試驗(yàn)結(jié)果。

1.3.6 大鯢皮中膠原蛋白含量的測(cè)定

參照GB/T 9695.23—2008進(jìn)行羥脯氨酸含量測(cè)定。膠原蛋白的質(zhì)量可由其所含的羥脯氨酸質(zhì)量乘以其換算系數(shù)得到[6]。

式中：1.11為羥脯氨酸換算系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶添加量的確定

酶添加量對(duì)干制大鯢皮膠原蛋白提取率的影響如圖1所示。干制大鯢皮膠原蛋白提取率隨酶添加量增加而逐漸增強(qiáng)，這是由于隨著酶添加量增加，酶與底物接觸位點(diǎn)增多，反應(yīng)加劇，提取率提高。但酶添加量大于6 000 U/g時(shí)，膠原蛋白提取率增長(zhǎng)緩慢，這是由于酶添加量達(dá)到一定程度后，胃蛋白酶作用于底物的位點(diǎn)基本反應(yīng)完全，故膠原蛋白提取率趨于穩(wěn)定。因此，選用胃蛋白酶添加量6 000 U/g為宜。

圖1 酶添加量對(duì)干制大鯢皮膠原蛋白提取率的影響

2.2 酶解pH的確定

酶解液pH對(duì)干制大鯢皮膠原蛋白提取率的影響如圖2所示。隨著酶解液pH升高，干制大鯢皮膠原蛋白提取率先升高后下降，酶解液pH 2.0時(shí)，膠原蛋白提取率最高。這可能是pH 2.0時(shí)，胃蛋白酶活性高，因此膠原蛋白提取率也高。因此，選擇酶解液pH 2.0為宜。

圖2 pH對(duì)干制大鯢皮膠原蛋白提取率的影響

2.3 酶解時(shí)間的確定

酶解時(shí)間對(duì)干制大鯢皮膠原蛋白提取率的影響如圖3所示。隨著酶解時(shí)間增加，干制大鯢皮膠原蛋白提取率不斷提高，但時(shí)間超過(guò)6 h后，其提取率趨于平緩。這是由于隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，適用于胃蛋白酶的專一位點(diǎn)已基本反應(yīng)完畢。因此，選擇酶解時(shí)間6 h為宜。

圖3 酶解時(shí)間對(duì)干制大鯢皮膠原蛋白提取率的影響

2.4 胃蛋白酶酶解大鯢皮制備膠原蛋白工藝條件正交試驗(yàn)

在單因素基礎(chǔ)上，根據(jù)正交試驗(yàn)因素水平表，以干制大鯢皮膠原蛋白提取率為指標(biāo)，對(duì)酶添加量、酶解pH和時(shí)間3個(gè)因素設(shè)計(jì)L9(33)正交試驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。

由表2正交試驗(yàn)極差k值分析結(jié)果可知，影響干制大鯢皮膠原蛋白提取率的各個(gè)因素的主次關(guān)系為：pH＞酶解時(shí)間＞酶添加量。從k值和經(jīng)濟(jì)效益綜合考慮，確定最適工藝條件為A2B2C2，即酶添加量6 000 U/g、pH 2.0、酶解時(shí)間6 h。驗(yàn)證試驗(yàn)表明，在此工藝條件下，大鯢皮膠原蛋白提取率為86.7%。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.5 干制大鯢皮膠原蛋白理化性質(zhì)的測(cè)定結(jié)果

2.5.1 干制大鯢皮膠原蛋白紫外光譜掃描

干制大鯢皮膠原蛋白紫外光譜掃描圖如圖4所示。干制大鯢皮膠原蛋白在230 nm左右處出現(xiàn)特征吸收峰，這是Ⅰ型膠原蛋白的特征紫外吸收峰，這個(gè)強(qiáng)吸收峰主要包括電子的n→π*和n→σ*躍遷[7]。試驗(yàn)結(jié)果表明提取的干制大鯢皮膠原蛋白為Ⅰ型膠原蛋白。

圖4 干制大鯢皮膠原蛋白的紫外光譜圖

2.5.2 干制大鯢皮膠原蛋白紅外光譜掃描

干制大鯢皮膠原蛋白紅外光譜掃描圖如圖5所示。干制大鯢皮膠原蛋白在酰胺A帶（3 287.86 cm-1）、酰胺B帶（2 956.93 cm-1）、酰胺Ⅰ（1 600～1 700 cm-1）、酰胺Ⅱ（1 500～1 600 cm-1）、酰胺Ⅲ（1 200～1 400 cm-1）均有特征吸收峰，表明提取的干制大鯢皮膠原蛋白其三股螺旋結(jié)構(gòu)較為完整[1,8]。其中，酰胺A帶主要是由N—H伸縮振動(dòng)和氫鍵的締合體引起的，一般在3 300 cm-1左右[9-10]；酰胺B帶是由CH2不對(duì)稱伸縮振動(dòng)引起。酰胺Ⅰ帶是由C＝O伸縮振動(dòng)引起的，因其對(duì)膠原蛋白三股螺旋結(jié)構(gòu)的變化較為敏感，所以與膠原蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)關(guān)系密切[11]。酰胺Ⅱ帶是由C—N伸縮振動(dòng)和N—H彎曲振動(dòng)引起的，本質(zhì)為α-螺旋、β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲疊加形成吸收帶，同時(shí)Arg，Asp，Glu和Tyr側(cè)鏈在此區(qū)域也有吸收[12]。酰胺Ⅲ帶是由N—H變形引起的，可以證明膠原蛋白三股螺旋結(jié)構(gòu)的存在[13]。此外，位于酰胺Ⅱ帶和酰胺Ⅲ帶之間的一系列吸收峰也表明膠原蛋白三股螺旋結(jié)構(gòu)的完整性[14]。

圖5 干制大鯢皮膠原蛋白紅外光譜掃描圖

3 討論

從濕態(tài)大鯢皮中提取膠原蛋白存在地域性要求高和物流成本高等問(wèn)題，限制大鯢皮的開發(fā)利用。試驗(yàn)提出從干制大鯢皮中提取膠原蛋白，并對(duì)其提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。大鯢皮皮質(zhì)致密、粗厚且韌性較強(qiáng)，往往造成膠原蛋白提取率低下。為提高干制大鯢皮中膠原蛋白的提取率，試驗(yàn)將干制后的大鯢皮粉碎的方式進(jìn)行預(yù)處理，經(jīng)粉碎后的大鯢皮粉在后續(xù)提取中，提高物料與提取溶劑的接觸比表面積，因此膠原蛋白提取率得到提高。此外，在后續(xù)預(yù)處理過(guò)程中進(jìn)一步創(chuàng)新，將除去雜蛋白和脂肪的大鯢皮采用乙酸溶脹，溶脹后的大鯢皮組織結(jié)構(gòu)膨脹、松散，有利于后續(xù)胃蛋白酶的作用，使干制大鯢皮的膠原蛋白提取率進(jìn)一步得到提高。

現(xiàn)有研究主要是從濕態(tài)的大鯢皮中提取膠原蛋白，從干制大鯢皮中提取膠原蛋白還鮮見報(bào)道。與從濕態(tài)大鯢皮中提取膠原蛋白相比較，從提取率來(lái)看，試驗(yàn)提取率相對(duì)較高，這與提取方法創(chuàng)新密切相關(guān)；從提取工藝來(lái)看，創(chuàng)新了粉碎、勻漿等工藝，因此增大物料與胃蛋白酶接觸的比表面積，所以酶解時(shí)間縮短，提取率提高；從提取成本來(lái)看，節(jié)約濕態(tài)大鯢皮冷凍、運(yùn)輸?shù)壬a(chǎn)加工成本，實(shí)現(xiàn)大鯢皮資源的跨區(qū)域加工；從提取得到的膠原蛋白來(lái)看，保留了膠原蛋白的三股螺旋結(jié)構(gòu)，具有膠原蛋白生物活性。在后續(xù)研究中，可進(jìn)一步探究大鯢皮膠原蛋白所具有的獨(dú)特生物活性。

4 結(jié)論

膠原蛋白是一種天然高分子蛋白質(zhì)，具有良好的生物相容性、乳化性、保濕性，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域中。試驗(yàn)首次采用干制大鯢皮為原料，研究干制大鯢皮制備膠原蛋白工藝條件。以膠原蛋白提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)法，分別研究胃蛋白酶添加量、酶解pH和時(shí)間對(duì)大鯢皮膠原蛋白提取率的影響。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)法進(jìn)一步優(yōu)化大鯢皮提取膠原蛋白的工藝，確定最適工藝條件：酶添加量6 000 U/g、pH 2.0、酶解時(shí)間6 h。在此工藝條件下，大鯢皮膠原蛋白提取率為86.7%。將干制大鯢皮膠原蛋白進(jìn)行紫外光譜和紅外光譜掃描分析，結(jié)果表明，試驗(yàn)中提取的大鯢皮膠原蛋白保留膠原蛋白較為完整的三股螺旋結(jié)構(gòu)，具有生物活性。