蔣鵬飛，彭 俊，歐 晨，姚 震，田 野，王 英，彭清華,

0引言

視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)是一種遺傳性視網(wǎng)膜病，遺傳方式有常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳及性連鎖隱性遺傳等，其特征是雙眼發(fā)病，慢性進行性視力損害并伴有眼底色素變化[1]。影響全世界約250萬人，我國人群發(fā)病率約為1/4000，男女比例約3∶2[2]。其特征在于視桿細胞和視錐細胞的逐漸喪失，由此導(dǎo)致嚴重的視覺功能障礙和雙眼最終失明。除了來自約70個基因的超過3 000個基因突變點之外，已經(jīng)報道了RP與其他類型的視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良的廣泛遺傳重疊[3]。這種遺傳病理生理學(xué)的多樣性使得治療極具挑戰(zhàn)性。雖然已經(jīng)使用各種藥理學(xué)試劑(神經(jīng)營養(yǎng)因子、抗氧化劑和抗凋亡劑)進行了嘗試治療，但大多數(shù)并未針對RP的根本原因，并且其臨床療效尚未得到明確證實[4]。目前正在進行或已完成的臨床試驗中RP的治療包括基因治療、細胞治療和視網(wǎng)膜假體等[5]。眼科學(xué)者對視網(wǎng)膜色素變性進行了大量實驗研究，取得了一定進展，本文對近年來視網(wǎng)膜色素變性的實驗研究進行了綜述，并對其未來研究方向進行了展望。

1藥物治療

1.1中藥RP的特征在于視桿細胞的死亡，隨后是視錐細胞的死亡，逐漸導(dǎo)致部分或完全失明。所有能延緩視網(wǎng)膜感光細胞死亡的藥物均能在一定程度上治療RP。對4、12、24周齡的視網(wǎng)膜色素變性小鼠灌胃中藥復(fù)方夜明顆粒(由熟地10g，枸杞子10g，黃芪15g，丹參15g，當(dāng)歸10g，制首烏10g，山萸肉10g，靈芝6g，白芍10g，枳殼6g等組成)，給藥28d后發(fā)現(xiàn)不同周齡的視網(wǎng)膜色素變性小鼠視網(wǎng)膜光感受器細胞層數(shù)均多于空白組，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明夜明顆粒能延緩視網(wǎng)膜感光細胞死亡[6]。視網(wǎng)膜色素變性皇家外科學(xué)院(Royal College Surgeons，RCS)大鼠是一種較成熟的視網(wǎng)膜退化的動物模型，與人類RP有許多相似之處[7]。對RCS大鼠灌胃中藥復(fù)方益氣明目丸(由黨參10g，黃芪15g，白術(shù)10g，菟絲子15g，山藥10g，茯苓10g，黃精15g，北柴胡10g，葛根10g，丹參15g，當(dāng)歸10g等組成)懸濁溶液，30d后，HE染色觀察RCS大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)，免疫組織化學(xué)染色法檢測各組視網(wǎng)膜組織中Bax、Caspase-3表達，Western Blot法測定各組視網(wǎng)膜組織中Bax、Caspase-3蛋白相對表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)益氣明目丸組大鼠視網(wǎng)膜厚度明顯較模型組大鼠視網(wǎng)膜增厚，光感受器細胞核數(shù)目較模型組多，且益氣明目丸組大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)較模型組清晰；益氣明目丸組視網(wǎng)膜凋亡因子Bax、Caspase-3平均光密度值均較模型組減少(P<0.01)[8-9]，說明益氣明目丸可有效緩解視網(wǎng)膜感光細胞的凋亡，從而對RP起到治療作用。

夜明顆粒與益氣明目丸均含有中藥丹參，宋厚盼等[10]基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)方法分析了丹參治療RP的分子機制，篩選丹參的入血活性成分和作用靶點，得到與丹參相關(guān)的化學(xué)成分202個，篩得活性成分65個，其中入血活性成分13個，包括隱丹參酮、木犀草素、丹參酮ⅡA等；得到這些成分可能作用的靶點117個；得到85個丹參影響RP病理過程的特征性基因，這些基因主要涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)控、凋亡信號通路調(diào)控、DNA核內(nèi)復(fù)制調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程[10-11]。劉家琪等[12]從實驗研究方面證實了中藥枸杞子-丹參對RCS大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)有改善作用，還可升高αB多肽(alpha B-crystalline，CRYAB)的表達，而CRYAB能抑制凋亡下游基因Caspase-3的激活。

以補腎益精方藥液灌胃RCS大鼠，分別于給藥7、28d時以TUNEL法檢測視網(wǎng)膜感光細胞凋亡情況，與蒸餾水組相比，補腎益精方組視網(wǎng)膜感光細胞凋亡均有所減少(P<0.05)，實時熒光定量PCR顯示給藥7、28d時補腎益精方組視網(wǎng)膜睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子表達均較蒸餾水組增加(P<0.05)[13]。補腎益精方抑制RCS大鼠感光細胞凋亡的作用可能與神經(jīng)營養(yǎng)因子的增加有關(guān)。

1.2抗氧化劑視網(wǎng)膜感光細胞是除了腦細胞以外氧耗量最多的細胞，隨著RP的進展，視桿細胞死亡，聚集在視網(wǎng)膜的氧無法被消耗，引起視網(wǎng)膜細胞氧化損傷[14]。Sulforaphane(SFN)已被證實是治療許多疾病的有效抗氧化劑，視網(wǎng)膜色素變性小鼠和野生型(wild type，WT)小鼠分別用SFN和生理鹽水處理，檢測其視網(wǎng)膜電圖及視網(wǎng)膜細胞凋亡情況，與生理鹽水組相比，SFN治療組視網(wǎng)膜電圖a波和b波振幅明顯增高，視網(wǎng)膜細胞凋亡基因下調(diào)，光感受器細胞死亡率降低[15]。表明抗氧化劑SFN對視網(wǎng)膜色素變性有一定的治療效果。

1.3抗凋亡劑補體激活被認為可抑制視網(wǎng)膜病變中的神經(jīng)變性[16]，多種補體成分在人與rd10小鼠中光感受器變性時顯著上調(diào)，C3表達的增加激活了視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞，小膠質(zhì)細胞可清除凋亡光感受器，如果C3缺乏，會減少凋亡光感受器的小膠質(zhì)細胞吞噬作用并增加對光感受器的神經(jīng)膠質(zhì)細胞神經(jīng)毒性。CR3是C3激活產(chǎn)物iC3b的小膠質(zhì)細胞表達的受體，增加其表達可有效減少小膠質(zhì)細胞神經(jīng)毒性，增加凋亡感光細胞清除率[17]。

1.4神經(jīng)營養(yǎng)因子3,4-二羥基苯甲酸甲酯(methyl 3,4-dihydroxybenzoate，MDHB)是一種在體外發(fā)揮神經(jīng)保護作用的小分子，有神經(jīng)營養(yǎng)作用和減少反應(yīng)性神經(jīng)膠質(zhì)增生的能力，可用于治療視網(wǎng)膜的退行性疾病，而RP存在視網(wǎng)膜感光細胞的退化，在機制上MDHB可以治療RP。視網(wǎng)膜色素變性rd10小鼠從出生后第12d直到第26d，每天在rd10小鼠腹膜內(nèi)注射MDHB或等體積的載體。與未處理的動物相比，MDHB處理顯著促進視網(wǎng)膜光感受器存活并保持錐體形態(tài)；在MDHB處理的rd10小鼠中，視覺行為和ERG反應(yīng)也大大增強；MDHB還可抑制rd10小鼠視網(wǎng)膜中小膠質(zhì)細胞激活和Müller細胞膠質(zhì)增生；使用拮抗劑ANA-12可以阻斷MDHB對光感受器存活和結(jié)構(gòu)的保護作用，證明MDHB確實可用于RP的治療[18]。

殷曉貝等[19]以不同劑量腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子玻璃體腔注射治療RP小鼠，發(fā)現(xiàn)劑量越高，RP小鼠視網(wǎng)膜抗凋亡蛋白表達越高。證明神經(jīng)營養(yǎng)因子對RP有治療作用。在出生10d的RP小鼠玻璃體腔內(nèi)注射睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子，在14、18、22、30d的視網(wǎng)膜電圖a波和b波波幅均高于空白對照組，說明在玻璃體腔內(nèi)注射睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子能有效延緩RP小鼠視網(wǎng)膜感光細胞的凋亡[20]。

2細胞移植

細胞移植是將細胞引入患者眼內(nèi)產(chǎn)生健康細胞，以期能夠替代無功能的細胞并與剩余的視網(wǎng)膜細胞連接。多能干細胞(pluripotent stem cells，PSCs)，包括胚胎干細胞(embryonic stem cells，ESCs)和誘導(dǎo)多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)，在分子上與功能上都具備與體內(nèi)的視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelial，RPE)細胞相同的分化潛能，相較于PSCs，人類胚胎干細胞(human embroynic stem cells，hESCs)來源的RPE細胞移植更能有效挽救感光細胞[21]。

視網(wǎng)膜色素變性GTP酶調(diào)節(jié)劑(retinitis pigmentosa GTPase regulator，RPGR)的突變可導(dǎo)致X連鎖RP，RPGR定位于連接纖毛的感光器，未突變的RPGR與肌動蛋白的凝溶膠蛋白相互作用并將其激活，凝溶膠蛋白可調(diào)節(jié)連接纖毛中的肌動蛋白分解，從而促進視紫紅質(zhì)(Rhodopsin，RHo)轉(zhuǎn)運到光感受器外部區(qū)域。RPGR的突變擾亂了這種RPGR-凝溶膠蛋白相互作用，損害了凝溶膠蛋白的活化。RPGR和凝溶膠蛋白敲除小鼠均顯示光感受器中肌動蛋白聚合和Rho錯誤定位的異常。使用鼠和人誘導(dǎo)的PSCs模型可恢復(fù)光感受器中肌動蛋白的聚合，最終阻止RP的進展[22]。

3基因治療

基因療法是一種利用病毒或非病毒載體糾正遺傳缺陷的治療策略，有可能通過替換或沉默致病基因來實現(xiàn)最終治療，隱性遺傳或X連鎖突變的RP患者對基因治療更敏感。對已確定致病基因的RP來講，基因治療是目前最有潛力的治療方式。RP基因治療的相關(guān)研究日益增多，涉及多種RP相關(guān)基因。其中，RPE65是恢復(fù)視網(wǎng)膜色素上皮中感光細胞功能所必需視覺色素必需酶，目前已鑒定出60多種不同的RPE65基因突變。在遺傳性視網(wǎng)膜疾病基因治療的許多臨床試驗中，voretigene neparvovec(AAV2-hRPE65v2，Luxturna)的3期臨床試驗顯示對RPE65介導(dǎo)的遺傳性視網(wǎng)膜疾病有顯著療效，包括Leber先天性黑矇和RP。Luxturna即將被批準(zhǔn)作為第一個眼部基因治療生物制品[23]。

導(dǎo)致RP的基因突變點較多，近來發(fā)現(xiàn)p75NTR基因突變可導(dǎo)致RP，在rd10小鼠中，也發(fā)現(xiàn)了p75NTR基因，與WT小鼠相比，在感光細胞死亡峰值之前的早期退化階段，rd10小鼠視網(wǎng)膜中p75NTR的下游細胞因子proNGF水平增加；在光感受器細胞喪失期間，ProNGF也保持升高。對rd10小鼠單次玻璃體內(nèi)或結(jié)膜下注射p75NTR的拮抗劑THX-B，對視網(wǎng)膜感光細胞有神經(jīng)保護作用[24]。

在Rho中超過150種不同的突變均可引起RP，Rho突變是常染色體顯性遺傳RP的最常見原因，常染色體隱性遺傳RP多與Rho功能喪失有關(guān)。以生長相關(guān)蛋白43慢病毒載體轉(zhuǎn)染脂肪間充質(zhì)干細胞可提高視網(wǎng)膜外核層厚度，提高Rho蛋白表達，對視網(wǎng)膜色素變性具有較好的作用[25]。P23H是Rho基因中最常見的突變位點，CRISPR/Cas9組分可在視網(wǎng)膜P23H基因位點中呈現(xiàn)高速率切割，在WT型小鼠中Rho等位基因中則不切割，這種特異性破壞P23H突變體同時又保留WT功能性等位基因的方式有效地減緩了感光細胞變性。同時，該方法在P23H基因突變的人感光細胞中也成功翻譯[26-27]。雖然約45%的突變P23H等位基因在DNA水平上被編輯，但相對RNA表達在P23H突變小鼠中更加靈敏，WT小鼠Rho突變相對RNA表達是P23H突變小鼠Rho相對RNA表達的約2.8倍。利用SpCas9變體和截短RNA間隔介導(dǎo)的等位基因特異性敲除方法，可以實現(xiàn)P23H突變小鼠中相對RNA突變的有效區(qū)分，對視網(wǎng)膜感光細胞變性的延遲更加顯著[28]。以基因消融聯(lián)合基因替換治療的方式破壞內(nèi)源性Rho基因的表達，治療后視網(wǎng)膜外核層厚度比單純AAV注射高17%～36%[29]，基因消融聯(lián)合基因替換可以治療由不同Rho突變引起的RP，而不單單針對某一基因突變位點，因此該種治療方式可用于治療眼科和其他領(lǐng)域中的多種遺傳性疾病。

分離和培養(yǎng)人臍帶來源間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells，hUCMSCs)，以色素上皮衍生因子(pigment epithelial-derived factor，PEDF)重組慢病毒轉(zhuǎn)染hUCMSCs，攜帶PEDF基因的重組慢病毒載體，能高效感染hUCMSCs，感染后的hUCMSCs進行傳代培養(yǎng)，慢病毒可延長目的基因在細胞內(nèi)的表達。將PEDF-hUCMSCs注射到RCS大鼠視網(wǎng)膜下，注射8wk后視網(wǎng)膜外核層厚度高于注射hUCMSCs組[30]，說明基因治療較單純細胞移植有更好的治療作用。

許多X連鎖遺傳RP動物模型中成功地建立了RPGR的基因替換腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus，AAV)載體，RPGR富含嘌呤的區(qū)域因含有高度重復(fù)的核苷酸序列，其固有序列不穩(wěn)定，常導(dǎo)致病毒載體克隆過程中出現(xiàn)重組錯誤，給實驗帶來較大難度。有研究指出[31]，病毒載體中重組錯誤出現(xiàn)的主要原因是RPGR蛋白中的谷氨?；Ｊ脚cWT變體無法區(qū)分。以針對人X連鎖遺傳RP的AAV8載體是一種優(yōu)化的基因替代療法，該載體可一致地產(chǎn)生全長正確的RPGR蛋白，通過AAV8載體遞送并由Rho激酶啟動子驅(qū)動時，密碼子優(yōu)化的RPGR在兩種RP動物模型均表現(xiàn)出較好的療效，并且有良好的安全性，為臨床試驗提供了治療基礎(chǔ)。在GRK1啟動子控制下的RPGR突變體狗中使用密碼子優(yōu)化的人RPGR(hRPGRstb)和RPGR(hRPGRco)兩種基因，可抑制狗視網(wǎng)膜感光細胞的退化，從而保持視力[32]。

磷酸二酯酶6-α(phosphodiesterase 6-alpha，PDE6A)基因的突變被廣泛認為是人視網(wǎng)膜色素變性的原因，AAV-8的PDE6A在PDE6A突變狗視網(wǎng)膜中有快速的轉(zhuǎn)基因表達，對10只PDE6A突變狗進行視網(wǎng)膜下注射，與未治療的眼睛相比，治療眼視網(wǎng)膜感光細胞層厚度得以保留，感光細胞也得以存活[33]，但是也存在一些副作用，如視網(wǎng)膜脫離等。多項研究[34-35]均將人類RP的突變基因在動物RP中進行了基因增強，以往研究的基因突變動物多為小鼠和大鼠，現(xiàn)在越來越多的基因突變動物為大型動物，如犬類等，結(jié)果表明基因增強療法可提高視網(wǎng)膜感光細胞的存活率，降低視網(wǎng)膜感光細胞死亡速度，從而挽救視力。

4展望

眼科學(xué)者對RP進行了大量的實驗研究，開發(fā)出多種RP治療方法，本文對其進行了一些總結(jié)。其中藥物治療與其它治療方式相比，無侵入性，且方便價廉，如能對藥物尤其是中藥的作用機制進行更加深入的研究，將有利于研發(fā)出效高的新型藥物。自體干細胞植入被認為是治療RP的一種有效方法，但也有報道稱自體干細胞移植會引起視網(wǎng)膜前膜及黃斑皺褶[36]，因此干細胞移植的安全性仍需進一步實驗研究論證。基因治療雖然存在一定的局限性，如靶基因過于單一，而導(dǎo)致RP的突變基因較多；給藥方式有侵入性，會有患者眼睛帶來損傷；臨床療效不確切等。但隨著基因編輯技術(shù)和新型基因遞送載體的發(fā)展，基因治療在未來會成為RP和其他遺傳性視網(wǎng)膜疾病最有希望的治療方式之一，但將實驗研究成果運用于臨床仍有很長的道路要走。