王基云，王 丹，陸釗罡，姚 遙，李 娟，李艷芳，王 平，吳文利

沙棗葉為胡頹子屬植物沙棗樹(Elaeagnus angustifolia L.)的葉子。沙棗樹原產(chǎn)于西亞和中亞[1]，廣泛分布于阿富汗、俄羅斯南部、哈薩克斯坦、土耳其、伊朗及中國西北地區(qū)，具有治療慢性支氣管炎等作用[2-3]。本研究通過復制卵蛋白(OVA)致敏的小鼠哮喘動物模型，觀察沙棗葉乙醇提取物對哮喘模型小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)中炎性細胞、血清中IgE-免疫球蛋白(IgE)、白介素4(IL-4)及γ干擾素(IFN-γ)水平，肺組織中氧自由基水平，肺組織病理形態(tài)學的影響，探討其改善哮喘模型小鼠氣道炎癥藥理作用及機制。

1 資料與方法

1.1 一般材料:本試驗于2016-2017年在寧夏醫(yī)科大學基礎學院實驗室完成。選取健康BALB/c種小鼠，SPF 級，雌性90只，雄性20只，體質(zhì)量18～22 g，由寧夏醫(yī)科大學動物實驗中心提供，動物合格證號:SCXK(寧)2011-0001。其中60只雌性小鼠用于實驗分組，20只雌性小鼠和20只雄性小鼠用于最大給藥劑量試驗。

1.2 藥品與試劑:①卵白蛋白:上?？笊锛夹g(shù)有限公司，批號131225；②氫氧化鋁:天津市大茂化學試劑廠，500 g，批號20110901；③水合氯醛:天津光復精細化研究，批號CAN B035-Q；④地塞米松磷酸鈉注射液:辰欣藥業(yè)股份有限公司，1 mL:5mg 10支；⑤小鼠ELISA試劑盒:武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 儀器:402型超聲霧化器(上海魚躍醫(yī)療設備有限公司)，680型全自動酶標儀(美國Bio Rad公司)，DP71顯微鏡照相系統(tǒng)(日本Olympus公司)。

1.4 沙棗葉乙醇提取物的制備:1.2 kg沙棗葉粉碎后，加3倍量80 %乙醇加熱回流提取(1 h×3)，合并濾液，減壓濃縮，得142.3 g(約285 mL)沙棗葉浸膏。

1.5 沙棗葉乙醇提取物最大給藥劑量的測定[4]:健康BALB/c種小鼠40只，18～22 g，雌雄各半，分2組，按照制備方法制備沙棗葉乙醇提物共計135 g(0.5 g/mL)，按0.4 mL/只灌胃(最大容積，最大耐受量)，給藥前禁食10 h，正常飼水。觀察14 d，記錄小鼠一般狀況改變及死亡數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給藥后10～20 min呼吸加快，1 h后呼吸平穩(wěn)。觀察1周未見小鼠外觀及行為有任何變化，未見小鼠死亡。因此灌胃最大耐受量為10.0 g/kg。按照10g/(kg·d)、5g/(kg·d)、2g/(kg·d) 計算實驗組需要的浸膏量及配制濃度，用超聲波震蕩10 min后制備成混懸液，混懸液均現(xiàn)用現(xiàn)配，每次灌胃前充分震蕩保障溶液均勻性。

1.6 哮喘模型復制[5-6]:除正常組外，其余各組分別在第1天、第7天和第14天腹腔注射致敏液0.5 mL/只(含5 mg OVA和15 mg 氫氧化鋁)。第14 d開始，將小鼠分別置于相同大小的霧化箱內(nèi)，以1%OVA溶液霧化激發(fā)，每次10 min，連續(xù)14 d正常組的致敏液和激發(fā)均以生理鹽水代替。模型成功標準包括:①行為改變:出現(xiàn)抓耳撓鼻、煩躁不安、口鼻發(fā)紺、呼吸深快等癥狀；②病理學改變:肺泡組織結(jié)構(gòu)破壞，出現(xiàn)黏液、水腫，炎癥細胞浸潤等典型表現(xiàn)。

1.7 動物分組及給藥:將60只雌性BALB/c種小鼠稱重后隨機分為正常組、模型組、對照組[(地塞米松10mg/(kg·d)]和沙棗葉乙醇提取物高、中、低劑量組，每組10 只。激發(fā)當天開始，陽性組給予地塞米松，高、中、低劑量組分別給予10g/(kg·d)、5g/(kg·d)、2g/(kg·d)灌胃，連續(xù)給藥14 d。

1.8 標本采集與檢測:各組小鼠末次激發(fā)24 h后，測量小鼠體重，用4%水合氯醛(水合氯醛4 g，加入到96 mL無菌生理鹽水稀釋) 0.1 mL/10 g腹腔注射麻醉。①血液標本。摘眼球取血，含有40 μl肝素的抗凝管收集標本，靜置 1 h，4℃ 2 000 rpm離心15 min分離血清存-80℃?zhèn)錅y。采用小鼠ELISA試劑盒檢測其IgE、IL-4、IFN-γ含量，嚴格按照試劑盒說明書操作。②肺泡灌洗液(BALF)。自小鼠頸部切開分離并暴露氣管，結(jié)扎右肺，在左側(cè)支氣管置靜脈穿刺套管針，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)0.3 mL灌洗支氣管肺泡，反復抽吸3次。4 ℃ 1 000 r/min離心10 min，取上清液存-80℃?zhèn)錅y。下層所留沉渣，加入1 mLPBS重懸，取10 μl加入血細胞計數(shù)板，高倍鏡下細胞計數(shù)，剩余細胞懸液2 000 r/min離心1.5 min，棄上清，取少許沉淀涂片，用瑞姬氏染液染色，鏡下分類計算嗜酸粒細胞、單核細胞、巨嗜細胞、中性粒細胞(高倍視野，計數(shù)200個細胞)。③肺組織。打開胸腔切取左肺稱重后勻漿，制備成10%懸液，離心后取上清液。采用小鼠ELISA試劑盒檢測其SOD、MDA、NO含量，嚴格按照試劑盒說明書操作。切取的右肺組織用0.9%氯化鈉注射液洗凈，10%甲醛固定，常規(guī)脫水，制作蠟塊，切片后進行HE染色光鏡下觀察病理變化。

2 結(jié)果

2.1 BALF中白細胞計數(shù)及各組炎癥細胞分類比例變化：模型組除中性粒細胞比率外，嗜酸性粒細胞、單核細胞比率及白細胞總數(shù)均較正常組明顯增高(P<0.05)。正常組除中性粒細胞比率外，嗜酸性粒細胞、單核細胞比率及白細胞總數(shù)均較模型組明顯降低(P<0.05);沙棗葉乙醇提取物高劑量組白細胞總數(shù)、嗜酸性粒細胞及單核細胞比率較模型組降低(P<0.05)、中劑量組除單核細胞比率外，白細胞總數(shù)以及嗜酸性粒細胞比率較哮喘模型組降低(P<0.05)。沙棗葉乙醇提取物高、中、低劑量組均可顯著升高中性粒細胞比率(P<0.05)，見表1。

表1 各組BALF中白細胞計數(shù)及各組炎癥細胞分類比例比較

2.2 小鼠肺組織中SOD、MDA和NO的含量變化：模型組與正常組比較，SOD含量降低(P<0.05)，MDA及NO含量升高(P<0.05)。沙棗葉乙醇提取物高、中劑量與模型組比較，SOD含量升高(P<0.05)，高、中、低劑量組均可降低MDA和NO含量(P<0.05)，見表2。

表2 各組小鼠肺組織中SOD、MDA和NO含量的比較

2.3 小鼠血清中IgE、IL-4及IFN-γ的含量變化：模型組與正常組比較，IgE、IL-4含量升高 (P<0.05)，IFN-γ含量降低 (P<0.05)，IL-4/IFN-γ值升高 (P<0.05)。沙棗葉乙醇提取物高、中劑量組及對照組與模型組比較，IgE、IL-4含量降低 (P<0.05)，高劑量組和對照組IFN-γ含量升高(P<0.05)，同時高、中劑量組和對照組血清中IL-4/IFN-γ值降低(P<0.05)，見表3。

2.4 肺組織病理學變化：①正常組:小鼠肺泡組織結(jié)構(gòu)完整，清晰，呈現(xiàn)正常肺組織形態(tài)。②模型組:小鼠肺泡組織結(jié)構(gòu)破壞，不完整，不清晰，氣道黏膜腺體分泌旺盛，氣道可見大量黏液，周圍組織水腫，黏膜下大量炎癥細胞浸潤。③對照組:小鼠肺泡組織結(jié)構(gòu)完整，管壁基本光滑，氣道可見少量黏液，黏膜下可見少量炎癥細胞浸潤，見圖1(目錄后)。④沙棗葉乙醇提取物高、中劑量實驗組:氣道結(jié)構(gòu)完整，管壁基本光滑，氣道可見少量黏液，黏膜下可見少量炎癥細胞浸潤，見圖2和圖3(目錄后)?？梢妼φ战M與沙棗葉乙醇提取物高、中劑量實驗組較模型組有明顯改善。⑤沙棗葉乙醇提取物低劑量實驗組:氣道結(jié)構(gòu)不完整，腔形稍不規(guī)則，管壁不光滑，黏膜腺體分泌較旺盛，氣道可見大量黏液，黏膜下多量炎細胞浸潤，見圖4(目錄后)。

表3 小鼠血清IgE、IL-4、IFN-γ含量的比較

3 討論

哮喘是多種細胞包括嗜酸粒細胞、肥大細胞、淋巴細胞、中性粒細胞、平滑肌細胞、氣道上皮細胞等，以及細胞組分參與的氣道慢性炎癥疾病[7]。已有研究表明活性氧與哮喘有關(guān)，體內(nèi)過度產(chǎn)生(ROS)可導致氧化抗氧化失衡，產(chǎn)生的自由基可引起氣道高反應導致氣道炎癥[8]。而哮喘炎癥機制中T細胞等炎癥細胞與炎癥介質(zhì)有相關(guān)性，分別發(fā)揮抑制調(diào)解作用或加重哮喘發(fā)作。大量證據(jù)表明，Th1/Th2免疫失衡是哮喘發(fā)病機制中的重要環(huán)節(jié)[9-10]，Th2細胞分泌的IL-4可與IL-5、IL-9等多種細胞因子促進嗜酸細胞粒細胞炎癥反應及漿細胞釋放免疫蛋白(IgE)，而IgE又可促進組胺、白三烯等多種炎癥遞質(zhì)的釋放，引起支氣管痙攣、黏膜水腫、黏液分泌增加等，從而導致哮喘[11]。Th1細胞分泌的IFN-γ可以抑制由 IL-4誘導的B淋巴細胞增值和分泌IgE、誘導單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、血管內(nèi)皮細胞等表面抗原的表達，促進 Thl 細胞分化，抑制 Th2 細胞反應[12]。本研究模型結(jié)果顯示，模型組小鼠肺組織SOD含量與正常對照組相比呈顯著性下降，MDA含量顯著增加。血清中IL-4、IgE含量升高，IFN-γ含量降低，IL-4/IFN-γ值升高。同時BALF中白細胞總數(shù)、嗜酸性粒細胞比率升高，病理結(jié)果可見模型組氣道黏膜腺體分泌旺盛，氣道內(nèi)可見大量黏液，炎癥細胞浸潤，說明哮喘模型小鼠機體內(nèi)氧化應激產(chǎn)生大量ROS，參與炎癥反應，同時Th1/Th2系統(tǒng)出現(xiàn)免疫失衡，哮喘小鼠模型制備成功。目前研究表明,沙棗葉中含有黃酮類化合物[13-14]，且葉子中的含量要高于花的含量[15]，體外實驗證實沙棗葉具有體外抗氧化性[16]，體內(nèi)實驗證實沙棗葉對小鼠肝脂質(zhì)過氧化具有保護作用和良好的抗脂質(zhì)過氧化作用[17]，OKMEN G等[16]報道沙棗葉甲醇提取物對小腸結(jié)腸炎耶爾森菌及鼠傷寒沙門氏菌TA100具有一定的抑制作用。前期對沙棗花研究發(fā)現(xiàn)其含有黃酮類化合物[17]，具有抗氧化作用[18-20]，可以通過調(diào)整體內(nèi)的氧化與抗氧化系統(tǒng)改善哮喘的氣道炎癥[21]，而Ge Y 等[22]觀察沙棗花水提取物能顯著延長豚鼠驚厥前時間(P<0.05)，延長咳嗽潛伏期(P<0.05)，降低氨水所致小鼠咳嗽頻率(P<0.05)，提高小鼠氣管酚紅輸出量(P<0.05)。

本實驗發(fā)現(xiàn)經(jīng)沙棗葉乙醇提取物高、中劑量組干預后,哮喘模型小鼠肺組織細胞炎性浸潤等病理有明顯減輕的改變，肺組織中SOD、NO、MDA水平基本恢復正常，與文獻報道體外及體內(nèi)抗氧化作用吻合，而高、中劑量組血清中IL-4、IgE、IFN-γ含量明顯改善，因此，沙棗葉乙醇提取物有維持哮喘模型小鼠氧自由基生成與清除的動態(tài)平衡，調(diào)節(jié)Th1和Th2的平衡而達到抗炎、平喘效果，這可能是改善哮喘模型小鼠氣道炎癥作用機制之一。