牛佳卉,袁 靜,張慧芳,賈金玉,韓 雪,吳夢(mèng)穎,張 萌,趙 文

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,河北省農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)中心,河北保定 071001)

王漿酸即10-羥基-2-癸烯酸(10-hydroxydec-2-enoic acid,10-HAD),是蜂王漿中特有的一種具有獨(dú)特生理生物活性的物質(zhì),在鮮蜂王漿中含量為1.4%(2.0%左右,其占蜂王漿總脂肪酸比重的55%以上[1]。研究發(fā)現(xiàn)[2],王漿酸具有增強(qiáng)免疫力[3-4]、抗菌消炎[5-8]、抗腫瘤[9-10]、抗輻射[11-12]、抗抑郁[13]等功效。

由飲酒造成的急性酒精性肝臟損傷也是現(xiàn)代凸顯的社會(huì)主要病癥。長(zhǎng)期的酗酒或大量的飲酒會(huì)損傷人體的健康,可能會(huì)導(dǎo)致人體內(nèi)器官、系統(tǒng)衰竭,造成一系列的健康問題[14]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù)表明,2016年全球所有死亡人數(shù)中5.3%歸因于酒精,其中歐洲因酒精導(dǎo)致的死亡人數(shù)最多可達(dá)到10.8%[15]。酒精性肝損傷是由于酒精在機(jī)體內(nèi),通過引起氧化應(yīng)激導(dǎo)致氧化產(chǎn)物增加,誘使脂肪在肝臟聚集,發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和炎癥反應(yīng),導(dǎo)致肝細(xì)胞進(jìn)一步發(fā)生炎癥、壞死、纖維化和硬化[16]。目前酒精性肝損傷已成為僅次于病毒性肝炎的第二大類肝病,且酒精對(duì)肝臟的損傷缺乏特異性藥物[17],而現(xiàn)今市售保肝藥物[18],如糖皮質(zhì)類固醇、多烯磷脂酰膽堿、美他多辛等絕大多數(shù)的治療效果不明顯,而且往往具有副作用。因此,開發(fā)出安全有效的食品或保健品并通過營(yíng)養(yǎng)干預(yù)預(yù)防酒精性肝損傷具有重要意義。

王漿酸具有明顯的生理活性,前期已研究發(fā)現(xiàn)王漿酸具有一定的緩解急性酒精中毒的功效,因此本研究通過建立小鼠急性酒精性肝損傷模型,研究王漿酸對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠肝功能和血脂水平、肝臟抗氧化水平和機(jī)體酒精代謝情況的影響,并觀察其肝臟的組織病理學(xué)變化,來評(píng)價(jià)其護(hù)肝作用及初步探究其作用機(jī)制,為相關(guān)理論研究和王漿酸功能性食品的研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

王漿酸(純度≥99.9%) 石家莊維奧生物技術(shù)有限公司;水飛薊賓膠囊 天士力制藥集團(tuán)股份有限公司;雄性ICR小鼠 72只,體重18～22 g,由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心購(gòu)入,許可證號(hào):SCXK(冀)2014-12-003;無水乙醇、甲醛和HE染液 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;甘油三酯、總膽固醇(TC)、極低密度脂肪蛋白(VLDL-C)、低密度脂肪蛋白(LDL-C)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、乙醇脫氫酶(ADH)、乙醛脫氫酶(ALDH)、一氧化氮合酶(TNOS)、超氧化物岐化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、還原型谷胱甘肽(GSH)、單胺氧化酶(MAO)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)檢測(cè)試劑盒 南京建成生物技術(shù)有限公司。

Scientz-ⅡD超聲細(xì)胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司;1500-823型全波長(zhǎng)掃描酶標(biāo)儀 Thermo Scientific公司;SPX-250B型生化培養(yǎng)箱 北京鑫骉騰達(dá)儀器設(shè)備有限公司;3-18R型低溫高速離心機(jī) 湖南恒諾儀器有限公司;RM2235型組織病理切片機(jī) 德國(guó)Leica公司;4590型石蠟包埋機(jī) 日本SAKURA精密技術(shù)公司;CKX41型倒置熒光顯微鏡 日本Olympus公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型的建立及劑量設(shè)計(jì) 小鼠酒精性肝損傷模型建立:雄性ICR小鼠72只,適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后,按體重隨機(jī)分為陰性對(duì)照組、模型對(duì)照組、王漿酸低、中、高(33、66、99 mg/kg·bw)劑量組和水飛薊陽性對(duì)照組(35 mg/kg·bw),每組12只。陰性對(duì)照組和模型組用蒸餾水進(jìn)行等體積灌胃,連續(xù)灌胃30 d。試驗(yàn)結(jié)束時(shí),模型組、陽性對(duì)照組及王漿酸各劑量組用50%(v/v)乙醇造肝損傷模型,灌胃量14 mL/kg·bw,陰性對(duì)照組用蒸餾水代替,造模后禁食不禁水16 h。

1.2.2 動(dòng)物處理及樣本采集 末次給藥造模后,將各組動(dòng)物禁食16 h,然后稱重記錄體重。采用摘眼球取血法,采集小鼠血液樣本,分離血清,-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。然后頸椎脫臼法處死動(dòng)物,解剖取其肝臟并稱重記錄,取部分肝臟制成10%肝組織勻漿,3000 r/min離心5 min取上清待測(cè)。剩余肝臟放置10%的甲醛溶液中固定,進(jìn)行病理組織形態(tài)學(xué)檢查。

1.2.3 指標(biāo)測(cè)定

1.2.3.1 肝臟指數(shù) 采用1.2.2中造模禁食后小鼠的體重和解剖后肝臟的質(zhì)量進(jìn)行肝臟指數(shù)的計(jì)算。

肝臟指數(shù)(mg/g)=肝臟質(zhì)量/小鼠體重

1.2.3.2 血清生化指標(biāo)的測(cè)定 取血清,嚴(yán)格按照試劑盒說明書測(cè)定TG、TC、VLDL-C、LDL-C、AST、ALT、ADH和ALDH等生化指標(biāo)。

1.2.3.3 肝臟生化指標(biāo)的測(cè)定 稱取適量小鼠肝臟組織,按質(zhì)量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例加入9倍體積的生理鹽水,制成10%的肝勻漿,然后4000 r/min,離心10 min。取上清液嚴(yán)格按照試劑盒說明書測(cè)定SOD、MDA、GSH-Px、GSH、MAO、TNOS、iNOS、ADH和ALDH等生化指標(biāo)。

1.2.3.4 肝臟病理組織學(xué)檢查 將固定在10%甲醛中的肝臟,進(jìn)行石蠟包埋切片、常規(guī)的蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色[19]后,于光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織的病理學(xué)變化。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 王漿酸對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠體重及肝臟指數(shù)的影響

肝臟指數(shù)能夠直觀反映肝臟健康狀況,由表1可知,與陰性對(duì)照組比,模型組肝臟指數(shù)極顯著降低(P<0.01),說明模型組小鼠造模成功。與模型組比,雖然王漿酸低、中劑量組的肝臟指數(shù)無顯著性變化,但各劑量組和陽性對(duì)照組的肝臟指數(shù)均有所上升,肝臟均受到不同程度的緩解作用,且高劑量組和陽性對(duì)照組存在顯著性差異(P<0.05),說明王漿酸具有緩解酒精性肝損傷的作用。此結(jié)果與魏芬芬等[20]關(guān)于枸杞多糖對(duì)小鼠酒精性肝損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究結(jié)果表現(xiàn)一致,表明肝臟指數(shù)隨護(hù)肝作用的增強(qiáng)而增加。

表2 王漿酸對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠血清脂質(zhì)的影響Table 2 Effects of royal jelly acid on serum lipids in mice with acute alcoholic liver

表1 王漿酸對(duì)酒精急性肝損傷小鼠體重 和肝臟指數(shù)的影響Table 1 Effect of royal jelly acid on body weight and liver index of mice with alcoholic acute liver

注:與陰性對(duì)照組相比,*:差異顯著,P<0.05,**:差異極顯著,P<0.01;與模型對(duì)照組相比,#:差異顯著,P<0.05,##:差異極顯著,P<0.01;表2～表7同。

2.2 王漿酸對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠生化指標(biāo)的影響

由表2可知,與陰性對(duì)照組比,模型組小鼠血清中TC、TG、LDL-C、VLDL-C的含量均極顯著上升(P<0.01),表明攝入過量的酒精能夠引起脂代謝紊亂。與模型組比,除低劑量組VLDL-C的含量顯著性降低(P<0.05),其余各劑量組和陽性對(duì)照組血清脂質(zhì)指標(biāo)含量均極顯著降低(P<0.01),高劑量組的降脂效果同陽性對(duì)照組相近。TG、TC、VLDL-C、和LDL-C常作為肝功能的輔助參考指標(biāo)[21]。當(dāng)肝臟出現(xiàn)纖維化或者肝硬化時(shí),其血脂指標(biāo)一般表現(xiàn)為TG、TC、VLDL-C、LDL升高,HDL降低[22]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果同啜文婷等[23]研究結(jié)果相同,說明王漿酸具有調(diào)節(jié)小鼠血脂代謝,緩解脂質(zhì)代謝紊亂的作用。

表3可知,與陰性對(duì)照組比,模型組小鼠血清中AST和ALT活性極顯著升高(P<0.01)。與模型組比,王漿酸各劑量組和陽性對(duì)照組的AST和ALT活性極顯著降低(P<0.01),其活性隨王漿酸劑量的升高而降低,且高劑量組的護(hù)肝效果最佳與陽性對(duì)照組效果相近。AST和ALT是廣泛應(yīng)用于檢測(cè)肝損傷的指標(biāo)[24]。羅安玲[25-26]等報(bào)道,大量飲酒后,肝臟受到酒精及其代謝產(chǎn)物的毒性影響,細(xì)胞膜通透性改變,導(dǎo)致肝細(xì)胞胞漿內(nèi)AST和ALT進(jìn)入到血液中,造成血清中活性升高。這與本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M血清中AST和ALT活性顯著性升高的結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)王漿酸能夠降低AST、ALT的活性,這與張建軍[27]等的研究結(jié)果相同,說明王漿酸具有降低急性酒精性肝損傷小鼠血清中AST和ALT活性的作用。分析其降低酶活性的原因可能是因?yàn)橥鯘{酸具有保護(hù)細(xì)胞膜的功能,能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的通透性,使其通透性恢復(fù)到正常狀態(tài),維持細(xì)胞器基本結(jié)構(gòu)的生態(tài)穩(wěn)定,從而減少了肝臟細(xì)胞中AST和ALT這兩種酶流入血液,表現(xiàn)為血清中兩種酶的活性隨著王漿酸劑量的升高而降低。

表3 王漿酸對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠血清ALT 和AST活性的影響Table 3 Effects of royaljelly acid on serum ALT and AST activity in mice with acute alcoholic liver

2.3 王漿酸對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠機(jī)體酒精代謝的影響

由表4知,與陰性對(duì)照組比,模型組小鼠肝組織中ADH活性都顯著升高(P<0.05)，ALDH活性極顯著升高(P<0.01)。與模型組比,王漿酸各劑量組和陽性對(duì)照組的ADH活性都極顯著升高(P<0.01);對(duì)于ALDH活性,王漿酸低劑量組無顯著性變化,而中、高劑量組和陽性對(duì)照組都極顯著升高(P<0.01)。

表4 王漿酸對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠肝臟ADH 和ALDH活性的影響Table 4 Effect of royal jelly acid on the activity of ADH and ALDH in liver of mice with

表5 王漿酸對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠血清ADH 和ALDH活性的影響Table 5 Effect of royal jelly acid on serum ADH and ALDH activity in mice with acute alcoholic liver

由表5可知,與陰性對(duì)照組比,模型組小鼠血清中ADH和ALDH酶活力均極顯著升高(P<0.01)。與模型組比,王漿酸低、中劑量組血清中ADH和ALDH酶活無顯著性變化,但高劑量組ADH酶活顯著升高(P<0.05),ALDH的酶活極顯著升高(P<0.01);陽性對(duì)照組ADH和ALDH的酶活均極顯著升高(P<0.01)。綜合分析,王漿酸對(duì)于解酒作用的功效,高劑量組效果最佳。

乙醇脫氫酶氧化體系是肝臟分解代謝外來酒精的主要方式,其中起到關(guān)鍵作用的是ADH和ALDH[28]。ADH作為一種短鏈醇代謝酶,能將機(jī)體攝入的乙醇進(jìn)行第一階段的催化分解生成乙醛。而ALDH的主要作用是把乙醛催化為乙酸,再經(jīng)過TCA循環(huán)最終生成CO2和H2O,消除酒精對(duì)肝臟的損傷[29]。

表6 王漿酸對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠肝臟抗氧化能力的影響Table 6 Effect of royal jelly acid on antioxidant capacity of liver in mice with acute alcoholic liver

表7 王漿酸對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠肝臟MAO、TNOS、iNOS活性的影響Table 7 Effect of royal jelly acid on the activity of MAO,TNOS and iNOS in liver of mice with acute alcoholic liver

本實(shí)驗(yàn)從血清和肝臟組織兩個(gè)角度對(duì)ADH和ALDH進(jìn)行檢測(cè)分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠一次性大量攝入酒精后,機(jī)體產(chǎn)生自然應(yīng)激反應(yīng)代謝分解酒精以緩解對(duì)肝臟的損傷,模型組和劑量組肝臟內(nèi)的ADH和ALDH活力會(huì)明顯升高,并與劑量成正相關(guān)。本結(jié)果與白美美[30]對(duì)連翹葉茶保肝作用研究中表現(xiàn)出來的結(jié)論一致,分析原因可能是由于王漿酸具有輔助性刺激肝細(xì)胞進(jìn)行乙醇代謝的催化作用。

2.4 王漿酸對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠肝組織抗氧化能力的影響

由表6可知,與陰性對(duì)照組比,模型組的SOD、GSH-Px活力和GSH的含量極顯著降低(P<0.01),而MDA含量極顯著增加(P<0.01),說明模型組的肝臟抗氧化能力減弱。與模型組比,王漿酸各劑量組和陽性對(duì)照組的GSH-Px、SOD活力和GSH含量極顯著增加(P<0.01),而MDA含量極顯著降低(P<0.01)。

SOD和GSH-Px是機(jī)體主要的抗氧化酶,MDA是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物,能反映機(jī)體的脂質(zhì)過氧化程度,間接反映細(xì)胞損傷的程度[31-32]。當(dāng)攝入過量的酒精時(shí),會(huì)造成肝細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化,生成過量的氧自由基造成氧化應(yīng)激,最終促進(jìn)脂質(zhì)氧化過程[33]。從結(jié)果可看出王漿酸能夠增加GSH-Px、SOD活力和GSH含量,減少M(fèi)DA的含量,因此王漿酸有一定的抗氧化能力,能夠緩解肝細(xì)胞脂質(zhì)過氧化進(jìn)程,起到對(duì)肝臟的保護(hù)作用。

由表7可知,與陰性對(duì)照組比,模型組小鼠MAO活力極顯著升高(P<0.01),TNOS和iNOS活力極顯著降低(P<0.01)。與模型組比,王漿酸各劑量組和陽性對(duì)照組的MAO活力極顯著降低(P<0.01),而除低劑量組的TNOS活力無顯著性變化,其余各組TNOS和iNOS活力極顯著增加(P<0.01)。說明王漿酸具有良好的護(hù)肝效果,且與劑量成正相關(guān)。

有研究表明,MAO參與膠原代謝,使膠原和彈性硬蛋白結(jié)合,形成膠原纖維導(dǎo)致肝臟纖維化,是評(píng)價(jià)肝臟損傷的重要指標(biāo)[34-35]。NO具有舒張血管、抑制血管平滑肌的增殖和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)等功能,但其又能生成具有毒性的過氧化亞硝酸鹽,導(dǎo)致組織損傷[36-37]。常用NOS指標(biāo)來反映NO,而NOS在機(jī)體內(nèi)分為nNOS、eNOS和iNOS,當(dāng)組織受到損傷時(shí)iNOS會(huì)產(chǎn)生應(yīng)激效果,使其活力升高,iNOS活性升高會(huì)引起NO的合成增加[38]。從結(jié)果可看出王漿酸能夠降低MAO的活性,提高TNOS和iNOS的活性來達(dá)到護(hù)肝的效果。其護(hù)肝途徑可能是通過iNOS活力的升高,帶動(dòng)NO含量的提高,NO可以舒張血管,加快血液循環(huán),加速酒精代謝產(chǎn)物CO2和H2O的排除,輔助起到護(hù)肝的效果。

2.5 王漿酸對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠肝臟病理組織形態(tài)的影響

由圖1可知,陰性對(duì)照組小鼠肝臟結(jié)構(gòu)清晰,肝小葉排列整齊,肝細(xì)胞以中央靜脈為軸心呈大致輻射狀排列。模型組的肝細(xì)胞索紊亂,肝細(xì)胞腫脹呈氣球樣變,胞質(zhì)疏松,胞質(zhì)內(nèi)能夠觀察到脂肪空泡和水樣變性且大小不等、數(shù)量不一,多個(gè)壞死在小葉內(nèi)發(fā)生呈現(xiàn)點(diǎn)狀或灶型,炎細(xì)胞侵入到匯管區(qū)中數(shù)目眾多。王漿酸低劑量組肝臟組織情況與模型組情況近似。王漿酸中、高劑量組肝組織情況均有明顯緩解,肝細(xì)胞胞質(zhì)較為緊密,脂肪空泡和水樣變性數(shù)量明顯減少,小葉內(nèi)壞死程度明顯降低,匯管區(qū)有少量炎細(xì)胞侵潤(rùn)。陽性對(duì)照組肝組織有明顯的治愈效果,肝臟組織結(jié)構(gòu)清晰,肝小葉排列基本整齊,肝細(xì)胞呈正常多邊形,胞質(zhì)內(nèi)脂肪空泡和水樣性變數(shù)量較少。

圖1 王漿酸對(duì)急性酒精性肝損傷 小鼠肝臟組織的病理學(xué)影響(HE,400×)Fig.1 Pathological effect of royal jelly acid on liver tissue in mice with acute alcoholic liver injury(HE,400×)

3 結(jié)論

王漿酸對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠的肝臟具有保護(hù)作用,王漿酸能夠升高肝臟指數(shù),同時(shí)降低血清中TC、TG、VLDL-C和LDL的含量,降低血清中AST、ALT活性來達(dá)到其護(hù)肝作用,并且王漿酸中、高劑量組能夠有效減少肝臟組織中脂肪空泡和水樣變性情況的發(fā)生,維持肝細(xì)胞正常生態(tài)生理結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。通過王漿酸能夠促進(jìn)ADH、ALDH的分泌,提高SOD、GSH-Px、TNOS、iNOS活性和GSH的含量,降低MDA的含量和MAO的活性,初步探究其護(hù)肝機(jī)制可能是通過對(duì)肝臟細(xì)胞因子進(jìn)行輔助調(diào)節(jié),加速酒精代謝分析,減少脂質(zhì)過度積累,從而降低一次性大量酒精攝入對(duì)肝臟造成的損傷程度,并且若長(zhǎng)期服用王漿酸還可有效地增強(qiáng)肝臟抗氧化能力。但王漿酸的作用時(shí)間和護(hù)肝效果是否存在相關(guān)性,還有王漿酸的調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的具體通路,還需要進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。以上結(jié)果說明王漿酸具有護(hù)肝功能,為其功能性食品的進(jìn)一步開發(fā)利用,提供了一定的理論依據(jù)。