杜 霞,周少潼,李春美

(華中農業(yè)大學食品科學技術學院,湖北武漢 430070)

桑葚和樹莓均屬于聚合型漿果,果實柔軟多汁,口感酸甜[1],營養(yǎng)豐富,富含礦物質及多酚類物質[2]。成熟桑葚的總花色苷含量可高達185 mg/100 g[3],而樹莓中的花色苷含量在400～1230 μg/g之間[4],是制備花色苷的良好原料。研究表明:花色苷可以有效降低冠狀動脈硬化、心臟病等發(fā)病風險[5]。此外,花色苷還具有抗氧化[6]、抗炎癥[7]、調節(jié)血脂、降血糖[8-9]等多種健康效應。隨著對花色苷研究的進一步深入,對高純度的花色苷制品需求也越來越大,然而目前市售的花色苷標準品種類單一[10],價格昂貴。因此,建立高效快速制備高純度花色苷的方法顯得尤為重要。

花色苷的分離純化多采用高速逆流色譜[11]、凝膠色譜[12-14]、半制備高效液相色譜[15]等方法,這些方法多存在耗時長、操作復雜、效率低、成本高、制備量小等問題,使在短時間內快速獲得大量高純度花色苷單體成為難題。中壓快速分離系統(tǒng)具有單次上樣量大、操作簡單、耗時短、效率高、經濟效率高等優(yōu)點[16-18],被廣泛應用于天然產物的分離和純化。目前通過中壓快速分離系統(tǒng)可從黑豆皮[19]和黑米[20]等材料中獲得較高純度的矢車菊素-3-葡萄糖苷,但其它結構的花色苷尚無報道。本文利用中壓快速分離系統(tǒng)建立了分離桑葚和樹莓中3種不同結構花色苷的方法,并用高效液相色譜和質譜對所得的3種花色苷的純度及結構進行了確認,旨在為花色苷資源的深入研究和開發(fā)提供支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅樹莓品種為小悟紅 購于湖北省孝昌小悟鄉(xiāng)凍藏于-20 ℃?zhèn)溆?桑葚 購買于寶桑園健康食品有限公司,凍藏于-20 ℃?zhèn)溆?矢車菊素3-葡萄糖苷 純度≥95%,上海源葉生物科技有限公司;AB-8大孔吸附樹脂 南開大學化工廠;甲醇、乙醇、甲酸、乙酸乙酯 均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司;濃鹽酸、硫酸 分析純,信陽市化學試劑廠;甲醇、甲酸 色譜級,美國Fisher公司。

ML204電子天平梅特勒-托利多儀器 (上海)有限公司;SKG榨汁機 廣東艾詩凱奇智能科技有限公司;Waters C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm) 美國沃特斯公司;高效液相色譜儀 日本島津公司;數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司;SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵、DLSB-5/20低溫冷卻液循環(huán)泵、旋轉蒸發(fā)儀 鄭州長城科工貿有限公司;LGJ-10真空冷凍干燥機 北京松源華興科技發(fā)展有限公司;1100 Series LC/MSD Trap液相色譜-質譜聯(lián)用儀 美國沃特斯公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 桑葚和樹莓花色苷的提取 分別稱取定量的桑葚和樹莓果肉打漿,以1∶2的料液比(v/v)加入95%工業(yè)甲醇(含0.1%的鹽酸),在40 ℃下超聲提取30 min,濾渣再次用同樣的料液比重復提取3次,合并提取液,利用旋轉蒸發(fā)儀在45 ℃真空濃縮除去甲醇至無醇味。將上述濃縮液經布氏漏斗抽濾后,pH調至1～2,上樣至裝填有AB-8大孔樹脂填料的層析柱,吸附60 min后,用體積分數(shù)為0.1%鹽酸去離子水溶液除去糖、蛋白質等雜質,待硫酸-苯酚法[21]檢測洗脫液無色,再用pH為2.5的60%乙醇(含0.1%鹽酸)洗脫花色苷,收集洗脫液,再次減壓濃縮至無醇味。將經過AB-8大孔樹脂除雜后的兩份濃縮液用等體積的乙酸乙酯萃取三次,去除黃酮類等物質,合并水相,真空濃縮后凍干得到桑葚和樹莓兩種花色苷粗提物凍藏于-20 ℃?zhèn)溆肹22]。

1.2.2 桑葚和樹莓花色苷粗提物高效液相檢測分析

1.2.2.1 矢車菊素-3-葡萄糖苷標品的分析 方法參考李夢麗[22]并做少許改動,取定量矢車菊素-3-葡萄糖苷標品用甲醇溶液(含有體積分數(shù)為0.1%HCl)溶解,配制成一定濃度的矢車菊素-3-葡萄糖苷標準液,再經0.45 μm濾膜過濾到棕色液相小瓶用于液相分析。采用Waters C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流速1 mL/min,流動相A:5%甲酸水,流動相B:甲醇,梯度洗脫條件:0～10 min,5%～20% B;10～15 min,20%～20% B;15～30 min,20%～25% B;30～35 min,25%～25% B;35～40 min,25%～33% B;40～42 min,33%～5% B;42～47 min,5%～5% B;進樣量10 μL;PAD檢測器;檢測波長520 nm。矢車菊素-3-葡萄糖苷標準液0.5、1、2、4、8 μL,每個體積重復3次,計算出平均峰面積。以質量(μg)為橫坐標,峰面積為縱坐標得到標準曲線為y=2000000x-37973(R2=1)。

1.2.2.2 桑葚和樹莓花色苷含量檢測 將桑葚和樹莓花色苷粗提物分別取定量用甲醇溶液(含有體積分數(shù)為0.1% HCl)溶解,取1 mL溶解液用0.45 μm濾膜過濾轉移至棕色的液相小瓶內用于液相分析,液相條件同1.2.2.1,檢測波長為280和520 nm,得到峰面積代入1.2.2.1標準曲線中進行定量計算。

1.2.3 中壓快速分離系統(tǒng)分離桑葚及樹莓花色苷條件的優(yōu)化 分別取300 mg兩種花色苷粗提物用2 mL分析純甲醇超聲溶解,經0.45 μm濾膜過濾備用,A相為一定濃度的甲酸水，B相為有機相，梯度洗脫條件為:0～2 min,20% B;2～22 min,20%～30% B;22～32 min,30%～40% B,檢測波長280 nm,flash C18(80 g,20～35 μm,100 A)制備柱,兩支串聯(lián),切峰收集到每根試管中,每根試管收集體積為10 mL。

根據(jù)以往研究數(shù)據(jù)[23],分別考察了有機酸濃度、有機相種類以及流速的大小對中壓快速分離系統(tǒng)分離兩種花色苷粗提物的影響。

1.2.3.1 有機酸濃度 研究表明在酸性條件下花色苷較為穩(wěn)定,甲酸的加入可有效的減少拖尾的情況并能很好地改善分離效果[24],控制流速30 mL/min,B相甲醇,分別考察0.5%、2%和5%的不同甲酸濃度的水相體系。

1.2.3.2 有機相種類 控制流速30 mL/min,A相2%甲酸水,考察以甲醇和乙腈為有機相分別對中壓快速分離系統(tǒng)分離兩種花色苷粗提物的影響。

1.2.3.3 流速的選擇 控制A相2%甲酸水,B相甲醇,考察20、30、40 mL/min 3種流速對中壓快速分離系統(tǒng)分離兩種花色苷粗提物的影響[10]。

1.2.4 HPLC-MS對其結構的鑒定 色譜條件:同1.2.2.1。

質譜條件:采用正離子模式;電噴霧電離離子源;掃描粒子范圍:m/z 50～800;霧化器壓力:45 psi;干燥器氣流流速:12 L/min;干燥器溫度:350 ℃[22]。

農業(yè)作為我國第一產業(yè)，主要是指利用植物的生長發(fā)育規(guī)律，通過人工培育來獲得產品的產業(yè)，在我國國民經濟建設中占據(jù)重要位置。農村經濟合作組織，又可以稱之為“農業(yè)合作社”，主要是指以家庭經營為主的農業(yè)小生產者聯(lián)合組成的組織形式，力求維護和改善各自的生產及生活條件，具有服務性、盈利性、民主性以及雙層次性等諸多特點，在農業(yè)發(fā)展中起到重要作用。基于此，本文就農業(yè)可持續(xù)發(fā)展對農村經濟合作組織的要求進行闡述，并提出推進農業(yè)可持續(xù)發(fā)展的有效對策。

1.2.5 樣品的純度檢測 純度的計算公式為:

純度(%)=峰面積帶入標曲算出的質量濃度(mg/mL)/進樣前目標化合物的質量濃度(mg/mL)×100

經中壓快速分離系統(tǒng)純化得到的桑葚的1峰和2峰及樹莓的1峰和2峰四份凍干樣品分別取定量用甲醇溶液(含有體積分數(shù)為0.1% HCl)溶解,取1 mL溶解液用0.45 μm濾膜過濾轉移至棕色的液相小瓶內用于液相分析,得到峰面積代入1.2.2.1標準曲線中進行定量分析。液相條件同1.2.2.1。

圖1 桑葚及樹莓花色苷粗提物高效液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatograms of crude extracts of mulberry and raspberry anthocyanins 注:A、C:桑葚花色苷粗提物;B、D:樹莓花色苷粗提物。

2 結果與分析

2.1 桑葚和樹莓粗提物的花色苷含量檢測

高效液相檢測桑葚和樹莓花色苷粗提物結果如圖1所示,在520 nm檢測波長下,圖1C和圖1D兩種花色苷粗提物分別有兩個主要的峰,在280 nm檢測波長下,圖1B樹莓花色苷粗提物在兩種花色苷主峰前有較多雜質峰,以矢車菊素-3-葡萄糖苷為標準品,計算桑葚中矢車菊素-3-葡萄糖苷和矢車菊素-3-蕓香糖苷的含量分別為22%、6%,樹莓中矢車菊素-3-槐糖苷和矢車菊素-3-葡萄糖苷的含量為3.9%、4.1%。

2.2 中壓快速分離系統(tǒng)最佳條件的確定

2.2.1 有機酸濃度的確定 如圖2所示,當甲酸濃度為0.5%時,桑葚和樹莓中壓色譜峰拖尾明顯,且分離效果也差于2%和5%的甲酸水相體系。洗脫液中甲酸濃度為2%和5%時中壓分離圖譜均不存在峰型拖尾現(xiàn)象,且分離效果相近,考慮到經濟環(huán)保問題,最終確定2%的甲酸水為A相。

2.2.3 流速大小的選擇 由圖4可知,當流速為20 mL/min時,樣品中目標組分在中壓柱上保留性較強,洗脫峰寬且響應值偏低,每次進樣只能得到少量的花色苷單體;而以40 mL/min洗脫時,目標峰易于洗脫,峰型集中且較尖銳,但經液相檢測目標物與雜質未能有效分離,且流速越大,柱壓越高,影響柱子壽命。當流速調整為30 mL/min時,三種花色苷單體與雜質的分離度能達到要求,且柱壓在正常范圍內。因此確定最佳流速為30 mL/min。

圖2 不同甲酸濃度時桑葚和樹莓花色苷粗體物中壓快速分離系統(tǒng)色譜圖Fig.2 Chromatogram of rapid separation of mulberry and raspberry anthocyanin in different formic acid concentrations

圖3 不同有機相種類時桑葚和樹莓花色苷粗體物中壓快速分離系統(tǒng)色譜圖Fig.3 Chromatogram of rapid separation of mulberry and raspberry anthocyanin in different organic phase species

圖4 不同流速時桑葚和樹莓花色苷粗體物中壓快速分離系統(tǒng)色譜圖Fig.4 Chromatogram of rapid separation of mulberry and raspberry anthocyanin in different flow rates at different flow rates

綜上所述,中壓快速分離系統(tǒng)分離兩種花色苷的最佳條件為:A相2%甲酸水,B相甲醇,流速30 mL/min。

2.2.4 最佳洗脫條件的驗證 在上述確定的最佳洗脫條件下獲得的桑葚和樹莓的中壓快速分離系統(tǒng)的色譜圖分別如圖5中A、B所示,A圖是桑葚花色苷粗提物中壓圖譜,由圖5A可知,桑葚花色苷粗提物中在280 nm下組分單一,所以對應的中壓圖譜雜質峰較少,僅有兩個主要的色譜峰,B圖為樹莓花色苷粗提物的中壓分離圖譜,由圖5B可知,在280 nm下,樹莓花色苷粗提物組分較復雜,對應在中壓分離圖譜上主要有4個峰,前兩個峰的洗脫液經液相檢測在520 nm并無吸收峰,因此上述接出的洗脫液為非花色苷物質可舍棄。分別收集上圖所示的4個流出峰,4個峰所對應的洗脫時間分別為A118～21 min,A223～25 min;B121～25 min,B226～30 min,將所收集的4個峰洗脫液進行減壓濃縮、凍干后進行下一步的純度及結構鑒定。

圖5 最優(yōu)條件時桑葚和樹莓花色苷粗提物中壓快速分離系統(tǒng)色譜圖Fig.5 Chromatogram of rapid separation system for crude extracts of mulberry and raspberry anthocyanins under optimal conditions

2.3 所得級分的HPLC分析及質譜結果鑒定

采用高效液相色譜分析中壓快速分離系統(tǒng)所獲得級分的色譜圖如圖6所示。圖A為桑葚中壓快速分離系統(tǒng)峰1的液相色譜圖。在520 nm檢測波長下,譜圖中僅可見保留時間為22.5 min的色譜峰,無其它雜峰。經質譜分析,由圖7A可知,桑葚中壓快速分離系統(tǒng)峰1的分子離子峰為m/z 449,碎片離子峰為m/z為287,由分子離子峰m/z 449丟失一分子己糖所致,結合參考文獻[25]可確定桑葚中壓快速分離系統(tǒng)峰1的花色苷為矢車菊素-3-葡萄糖苷;經中壓快速分離系統(tǒng)純化后,以矢車菊素-3-葡萄糖苷為標準品,桑葚中的矢車菊素-3-葡萄糖苷含量由粗提物中的22%提升至95%,相比于桑葚級分峰1,所得桑葚級分峰2譜圖中有少許雜峰,由圖7B可知,桑葚級分峰2的分子離子峰為m/z 595,碎片離子峰m/z 287,由分子離子峰m/z 595丟失一分子鼠李糖所致,結合參考文獻[25]可確定桑葚中壓快速分離系統(tǒng)峰2的花色苷為矢車菊素-3-蕓香糖苷;以矢車菊素-3-葡萄糖苷,桑葚中的矢車菊素-3-蕓香糖苷含量由粗提物中的6%提升至41%。比較而言,樹莓花色苷提取物經中壓快速分離系統(tǒng)分離后所得兩個級分色譜圖均呈現(xiàn)單一、尖銳的峰,說明分離純化效果較好,經質譜分析,由圖7C可知,樹莓中壓快速分離系統(tǒng)峰1的分子離子峰為m/z 611,碎片離子峰為m/z 287,由分子離子峰m/z 611丟失一分子槐糖所致,結合參考文獻[25]可確定圖7C中的花色苷為矢車菊素-3-槐糖苷;由圖7D可知,樹莓中壓快速分離系統(tǒng)峰2的分子離子峰為m/z 449,碎片離子峰為m/z 287,結合參考文獻[25]可確定圖7D中的花色苷為矢車菊素-3-葡萄糖苷,以矢車菊素-3-葡萄糖苷為標準品,樹莓中的矢車菊素-3-槐糖苷含量由粗提物的3.7%增加到60%,矢車菊素-3-葡萄糖苷含量由粗提物的4.1%提升至75%。有文獻表明,花色素B環(huán)的3碳位被雙糖苷取代相較于被單糖苷取代的吸光度會大幅度下降,且在相同溶劑體系內,矢車菊素-3-單糖苷的吸光度可比矢車菊素-3-雙糖苷的吸光度高3.8倍[26]。由此可知,桑葚和樹莓花色苷粗提物經中壓快速分離系統(tǒng)純化后,矢車菊素-3-蕓香糖苷和矢車菊素-3-槐糖苷的純度理應較41%和60%更高。

圖6 不同級分的HPLC分析圖譜Fig.6 HPLC chromatograms of the fractions obtained from the medium pressure rapid separation system

圖7 經中壓快速分離系統(tǒng)純化后的桑葚及樹莓的1峰和2峰質譜圖Fig.7 Mass spectrometry of 1 and 2 peaks of mulberry and raspberry purified by medium pressure rapid separation system 注:A:桑葚1峰;B:桑葚2峰;C:樹莓1峰;D:樹莓2峰。

2.4 與已有其他方法的對比分析

綜上所述,將現(xiàn)有文獻中花色苷的常用制備技術在上樣量、制備時間、一次進樣所獲得單個花色苷量以及純度等參數(shù)與本研究對比,結果見表1。高速逆流色譜每次可進樣200 mg,單次洗脫就可得到15.0 mg純度為95.5%的花色苷單體,但其耗時久,且需要多種揮發(fā)性有機溶劑,如乙醚、石油醚等;半制備高效液相色譜是目前分離純化花色苷粗提物最常用的方法,雖然能在30.0 min的洗脫時間內能得到純度為98.0%的花色苷單體,但每次進樣量只有2.00 mg,單次處理量低且對流動相要求為色譜純;葡聚糖凝膠柱層析雖然簡單易操作,但上樣量小,洗脫時間長,效率低,所獲得的花色苷純品量少且樣品純度低。

表1 本研究方法與已有方法對花色苷純化效果的比較Table 1 Comparison of the current method and previous methods of purification of anthocyanins

相比較于以上幾種分離純化方法,中壓快速分離系統(tǒng)具有上樣量大、耗時短、經濟、易操作等優(yōu)點,其不僅分離效率高,在32.0 min的洗脫程序內,進樣量可達300 mg,一次性可獲得30.0 mg純度為95.0%的矢車菊素-3-葡萄糖苷,可實現(xiàn)矢車菊素-3-葡萄糖苷標品的大批量制備。

3 結論

本文以桑葚和樹莓為原料大量制備不同結構的花色苷,確定了中壓快速分離系統(tǒng)分離兩種花色苷粗提物的條件為流動相A為2%甲酸水溶液,流動相B為甲醇,最大進樣量300 mg,流速為30 mL/min,梯度洗脫條件為:0～2 min,20% B;2～22 min,20%～30% B;22～32 min,30%～40% B。桑葚花色苷粗提物經中壓快速分離系統(tǒng)純化后的兩種花色苷分別是矢車菊素-3-葡萄糖苷和矢車菊素-3-蕓香糖苷,其中矢車菊素-3-葡萄糖苷由粗提物中的22%提升至純度為95%,矢車菊素-3-蕓香糖苷由粗提物中的6%提升至41%;樹莓純化后的兩種花色苷為矢車菊素-3-槐糖苷和矢車菊素-3-葡萄糖苷,分別由粗提物中的3.7%和4.1%提升至純度分別為60%和75%。其中桑葚中的矢車菊素-3-葡萄糖苷的純度達到了標準品要求,中壓快速分離系統(tǒng)具有上樣量大、分離速度快、分離效果好等優(yōu)點,有望實現(xiàn)不同結構花色苷單體的快速分離與制備。