薛 山,2,肖 夏3,陳舒怡,劉伯虎,蘭國(guó)錦

(1.閩南師范大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,福建漳州 363000; 2.菌物產(chǎn)業(yè)福建省高校工程研究中心,福建漳州 363000; 3.四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院,四川自貢 643000)

葡萄是世界范圍內(nèi)種植及銷(xiāo)量最大的水果之一,其營(yíng)養(yǎng)豐富、生物活性高,其中約13%用于鮮食,80%用于釀酒,7%用于其它副產(chǎn)品加工[1]。以葡萄酒釀造為例,加工之后會(huì)產(chǎn)生大量的葡萄皮渣、葡萄籽、以及葡萄梗,可占據(jù)釀酒葡萄總量的20%[2]。其中,葡萄籽提取物(Grape seed extract,GSE)中含有豐富的多酚類(lèi)、礦質(zhì)元素、蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素等,具有潛在的開(kāi)發(fā)價(jià)值[3-4]。據(jù)報(bào)道,葡萄籽中的活性多酚現(xiàn)已應(yīng)用于食品、藥品和保健品[1]。與此同時(shí),葡萄籽多酚的提取利用還有利于實(shí)現(xiàn)廢棄物綜合利用,減少環(huán)境污染[5-6]。

目前,葡萄皮渣中多酚的提取雖已有多種方法,如酶法、超聲輔助法、溶劑萃取法等[7],但考慮到擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模的局限性仍多采用溶劑提取法[8]。同時(shí),諸多研究顯示,在有機(jī)試劑中,丙酮有著較高的葡萄籽多酚(grape seed polyphenols,GSP)提取率,且丙酮提得的GSP具有較優(yōu)的抗氧化活性[8-10]。經(jīng)成分鑒定,葡萄籽中含有沒(méi)食子酸、兒茶素、綠原酸、咖啡酸、表兒茶素等活性酚類(lèi)[11-13],具有抗氧化[14]、抗腫瘤[15]、抗炎癥[16]、保護(hù)心臟[17]、降血脂[18]等多種生理功效。

國(guó)內(nèi)外已有不少學(xué)者對(duì)GSP的提取工藝進(jìn)行了研究,但是多為僅僅基于酚類(lèi)物質(zhì)提取率的單因素及響應(yīng)面優(yōu)化[19-20],罕見(jiàn)Matlab的優(yōu)化研究。Matlab是國(guó)際上最優(yōu)秀的科技應(yīng)用軟件之一,具有強(qiáng)大的科學(xué)計(jì)算功能,并提供了專(zhuān)門(mén)的優(yōu)化工具箱,通過(guò)建立研究問(wèn)題的數(shù)學(xué)模型,編寫(xiě)程序代碼,有效計(jì)算出最優(yōu)解,已廣泛應(yīng)用于各研究領(lǐng)域[21],如化工油脂提取優(yōu)化[22],本文擬采用Box-Behnken雙響應(yīng)面優(yōu)化法結(jié)合Matlab分析法對(duì)GSP進(jìn)行提取工藝優(yōu)化,擬為葡萄籽的加工利用研究提供理論依據(jù)與創(chuàng)新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

釀酒新疆山葡萄籽(干品) 大閩食品(漳州)有限公司提供;甲醇、無(wú)水乙醇、丙酮、無(wú)水碳酸鈉、沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品 分析純,西隴科學(xué)股份有限公司;福林酚試劑 北京索寶生物科技有限公司。

AR124CN電子天平 奧豪斯儀器(上海)有限公司;DGG-9140B電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;FW100高速萬(wàn)能粉粹機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司;HH-2數(shù)顯電子恒溫水浴鍋 常州國(guó)華電器有限公司;TGL-20M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司;UV5100B紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 GSP的提取 將葡萄籽粉碎,過(guò)40目篩,用石油醚脫脂后,自然揮干溶劑,于4 ℃冷藏備用。準(zhǔn)確稱(chēng)取1.00 g樣品于100 mL離心管中,按照一定的料液比加入適量體積的溶劑,于冰浴1000 W的超聲波發(fā)生儀超聲一定時(shí)間,之后激烈攪拌提取一定時(shí)間。然后在2500×g下離心10 min,收集上清液,殘?jiān)貜?fù)提取一次,合并上清液并在45 ℃下旋轉(zhuǎn)濃縮到合適體積,用蒸餾水定容于25 mL待測(cè)[23]。

1.2.2 GSP含量測(cè)定 采用福林酚比色法,參考梁強(qiáng)[24]和Chu等[25]方法。在10 mL試管中,加入0.2 mL的多酚樣品提取液,用0.8 mL的蒸餾水稀釋,隨后加入0.2 mL的福林酚試劑,混合均勻。放置6 min后,加入2 mL 7%的碳酸鈉溶液,最后用蒸餾水補(bǔ)足5 mL,并在室溫下反應(yīng)90 min,于波長(zhǎng)760 nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)。以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品,用蒸餾水稀釋不同濃度后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程:y=0.093x-0.002,R2=0.9995,y為吸光值,x為標(biāo)準(zhǔn)沒(méi)食子酸溶液濃度。GSP的提取量用沒(méi)食子酸當(dāng)量(gallic acid equivalent,GAE)μg GAE/mg DW表示。

1.2.3 羥自由基清除率測(cè)定 在10 mL比色試管中依次加入9 mmol/L FeSO4溶液1.0 mL、9 mmol/L的水楊酸溶液1.0 mL、待測(cè)液1.0 mL,8.8 mmol/L的H2O2溶液1.0 mL,搖勻,37 ℃水浴30 min,于510 nm處測(cè)其吸光度,平均值記為Ai。另用蒸餾水代替H2O2溶液重復(fù)上述試驗(yàn),測(cè)得參比吸光度Ab;另用蒸餾水代替樣品溶液重復(fù)上述試驗(yàn),測(cè)得空白吸光度A0[26]。羥自由基清除率按下試計(jì)算:

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn) 分別以不同提取介質(zhì)、溶劑濃度、料液比、提取時(shí)間為單因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn),探究各因素對(duì)GSP提取量和羥自由基清除率的影響。

1.2.4.1 不同提取介質(zhì)對(duì)GSP提取量和羥自由基清除率的影響 稱(chēng)取粉碎過(guò)40目篩的脫脂葡萄籽粉1.00 g,料液比1∶30 g/mL,提取時(shí)間90 min條件下探究不同提取介質(zhì)(水、80%甲醇、80%乙醇、80%丙酮)對(duì)GSP提取量和羥自由基清除率的影響。

1.2.4.2 不同濃度溶劑對(duì)GSP提取量和羥自由基清除率的影響 稱(chēng)取粉碎過(guò)40目篩的脫脂葡萄籽粉1.00 g,提取介質(zhì)為丙酮,料液比1∶30 g/mL,提取時(shí)間90 min條件下探究不同丙酮濃度(60%、70%、80%、90%、100%)對(duì)GSP提取量和羥自由基清除率的影響。

1.2.4.3 料液比對(duì)GSP提取量和羥自由基清除率的影響 稱(chēng)取粉碎過(guò)40目篩的脫脂葡萄籽粉1.00 g,提取介質(zhì)為80%丙酮,提取時(shí)間90 min條件下探究不同料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL)對(duì)GSP提取量和羥自由基清除率的影響。

1.2.4.4 提取時(shí)間對(duì)GSP提取量和羥自由基清除率的影響 稱(chēng)取粉碎過(guò)40目篩的脫脂葡萄籽粉1.00 g,提取介質(zhì)為80%丙酮,料液比1∶40 g/mL條件下探究不同提取時(shí)間(30、60、90、120、150 min)對(duì)GSP提取量和羥自由基清除率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,確定提取液為丙酮,根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)的自變量,以GSP提取量和羥自由基清除率為雙響應(yīng)值,進(jìn)行提取條件優(yōu)化。響應(yīng)面分析因素和水平表見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面分析因素和水平表Table 1 TheTable of factors and levels used in response surface analysis

1.2.6 最優(yōu)組合驗(yàn)證試驗(yàn) 依據(jù)Box-Behnken雙響應(yīng)面結(jié)果,得到最優(yōu)工藝條件,并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

1.2.7 Matlab優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì) 利用Matlab軟件,采用優(yōu)化計(jì)算方法以及算法語(yǔ)言的圖形處理功能,通過(guò)編制程序M(程序代碼),計(jì)算出溶劑濃度(A)、料液比(B)、提取時(shí)間(C)對(duì)GSP提取量(y1)和羥自由基清除率(y2)的四維及三維交互影響結(jié)果。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組處理重復(fù)3次,數(shù)據(jù)結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS Statistics 24.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行單因素顯著性分析,P<0.05表示結(jié)果顯著,標(biāo)示為不同字母。利用Design-Expert 8.0.6 Trial軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn),利用Matlab(MATrix LABoratory)軟件進(jìn)行交互試驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算及四維、三維繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 不同溶劑對(duì)GSP提取量和羥自由基清除率的影響 從圖1可知,在相同的提取條件下,80%的丙酮溶液的多酚提取量顯著高于其他溶劑(P<0.05),80%乙醇與80%甲醇的提取效果差異不顯著(P>0.05),而純水的多酚提取量最少。從自由基清除率來(lái)看,80%丙酮提取物的活性也顯著高于其他提取介質(zhì)組(P<0.05)。據(jù)報(bào)道,有機(jī)溶劑能夠較高效的提取黃酮醇類(lèi)、黃烷-3-醇類(lèi)、芪類(lèi)多酚等活性成分[10],其中,丙酮對(duì)葡萄籽原花青素的提取效果較甲醇和乙醇更優(yōu),且70%丙酮GSP提取物的抗氧化活性最高[8]。據(jù)劉進(jìn)杰等[27]報(bào)道,采用甲醇、乙醇、丙酮和酸性水4種溶劑分別提取葡萄皮多酚時(shí),丙酮提取物多酚得率最高、總還原力最強(qiáng)、對(duì)DPPH·的清除作用最好。以上結(jié)果與本文的研究結(jié)論有一致性。

圖1 不同提取介質(zhì)對(duì)多酚提取量和自由基清除率的影響Fig.1 Effect of different extraction medium on extraction amount and radical scavenging rate of polyphenols 注:不同小寫(xiě)字母表示多酚含量差異顯著(P<0.05), 不同大寫(xiě)字母表示自由基清除率 差異顯著(P<0.05);圖2～圖4同。

2.1.2 不同濃度溶劑對(duì)GSP提取量和羥自由基清除率的影響 從圖2看出,丙酮濃度對(duì)GSP有著較為明顯的影響。在60～100%濃度范圍內(nèi),80%丙酮的多酚提取量最高,抗氧化性也最強(qiáng)。推測(cè)其原因,這可能是因?yàn)?0%丙酮溶液的有機(jī)組分更好地提取了黃酮醇類(lèi)、黃烷-3-醇類(lèi)、芪類(lèi)多酚等活性成分,水相部分更優(yōu)地提取了苯甲酸類(lèi)和肉桂酸類(lèi)酚酸[10]。正是因?yàn)樘崛∥锍煞值暮考敖M成不同,造成了羥自由基清除效果的差異。這也解釋了圖2中80%與70%濃度丙酮抗氧化性差異不顯著(P>0.05),但是前者的多酚含量顯著高于后者(P<0.05)的原因。因此，丙酮濃度選擇為80%。

圖2 不同濃度溶劑對(duì)多酚提取量和自由基清除率的影響Fig.2 Effect of different concentrations of solvent on extraction amount and radical scavenging rate of polyphenols

2.1.3 料液比對(duì)GSP提取量和羥自由基清除率的影響 從圖3可以看出,料液比在1∶10～1∶40 g/mL范圍內(nèi),GSP的提取量顯著升高(P<0.05),在1∶50 g/mL時(shí)達(dá)到最高值,但是1∶40與1∶50 g/mL時(shí)的多酚提取量并無(wú)顯著性差異(P>0.05),從成本考慮,選用1∶40 g/mL料液比較為合適。從自由基清除率角度來(lái)看,其變化趨勢(shì)與提取量呈現(xiàn)一致性。推測(cè)其原因,一方面是因?yàn)榭偠喾拥暮慷嗌賹?duì)抗氧化性有顯著影響,另一方面是因?yàn)槿軇┯昧康脑黾幽軌虼偈箍寡趸钚詮?qiáng)的組分更多地溶出,尤其是在1∶10～1∶40 g/mL用量區(qū)間。因此，料液比選擇為1∶40 g/mL。

圖3 料液比對(duì)多酚提取量和自由基清除率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on extraction amount and radical scavenging rate of polyphenols

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)GSP提取量和羥自由基清除率的影響 從圖4看出,相同的提取條件下,隨著時(shí)間延長(zhǎng),GSP提取量與羥自由基清除率均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),在提取90 min時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)。提取時(shí)間較短,多酚溶出量有限,故自由基清除活性較低,但是當(dāng)提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng),多酚雖然提取較為完全,但是由于氧化等原因難免有所損耗,尤其是強(qiáng)抗氧化活性組分。因此，提取時(shí)間選擇為90 min。

圖4 提取時(shí)間對(duì)多酚提取量和自由基清除率的影響Fig.4 Effect of time on extraction amount and radical scavenging rate of polyphenols

2.2 雙響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 雙響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,應(yīng)用Box-Behnken進(jìn)行了三因素三水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)。GSP提取量和自由基清除率的雙響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2,回歸模型和方差分析結(jié)果分別見(jiàn)表3和表4。

表3 基于多酚提取量的方差分析結(jié)果Table 3 The variance analysis result based on the extraction amount of polyphenols

注:*P<0. 05,影響顯著;**P<0. 01,影響極顯著;表4同。

表2 雙響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface optimization experiment

使用Design 8.0. 6對(duì)雙響應(yīng)面分析得出y1和y2的回歸方程分別為:

y1(GSP提取量)=72.47+1.19A+4.11B+0.68C-2.98AB-0.29AC+0.69BC-3.46A2-1.41B2-6.38C2

式(1)

y2(GSP自由基清除率)=69.48+0.74A+2.43B+0.37C-2.18AB+0.12AC+0.045BC-2.87A2-1.19B2-4.23C2

式(2)

從表3和表4可以看出,以上兩個(gè)模型均顯著(P<0.05),且失擬項(xiàng)不顯著(P>0.05),說(shuō)明模型擬合性均較好[28]。GSP提取量的回歸方程決定系數(shù)為R2=0.9173,說(shuō)明響應(yīng)值的變化有91.73%來(lái)源于所選三個(gè)變量。同理,多酚自由基清除率的回歸方程決定系數(shù)為R2=0.8423,說(shuō)明響應(yīng)值的變化有84.23%來(lái)源于所選三個(gè)變量。通過(guò)F值可以得出,各因素對(duì)多酚提取量和自由基清除率的影響顯著性大小均為:料液比>溶劑濃度>提取時(shí)間。變異系數(shù)C.V.(%)是衡量每個(gè)測(cè)量平均值偏離真實(shí)情況的參數(shù),其值越小,表明重復(fù)性越好,兩個(gè)模型的變異系數(shù)分別為3.53%和3.51%,均在可接受范圍內(nèi),說(shuō)明該模型的重復(fù)性良好[29]。

2.2.2 雙響應(yīng)面圖結(jié)果 響應(yīng)面圖是響應(yīng)值在各試驗(yàn)因素交互作用下得到的結(jié)果構(gòu)成的一個(gè)三維空間曲面。由圖5a可以看出,響應(yīng)曲面的坡度較抖,說(shuō)明溶劑濃度與料液比的交互作用對(duì)GSP提取量影響顯著;溶劑濃度在75～85%范圍內(nèi),提取時(shí)間在75～105 min范圍內(nèi),多酚提取量先增高后降低(圖5b);料液比在1∶35～1∶45 g/mL范圍內(nèi),提取時(shí)間75～105 min范圍內(nèi),隨著料液比的增加,多酚提取量顯著升高(圖5c)。圖5與圖6的變化規(guī)律非常類(lèi)似,與表3和表4的分析結(jié)果一致。

表4 基于多酚自由基清除率的方差分析結(jié)果Table 4 The variance analysis result based on the radical scavenging rate of polyphenols

圖5 各因素交互作用對(duì)多酚提取量影響的等高線圖和響應(yīng)面圖Fig.5 Contour plot and response surface plot of the influence of the interaction of various factors on the extraction amount of polyphenol

圖6 各因素交互作用對(duì)多酚自由基清除率影響的等高線圖和響應(yīng)面圖Fig.6 Contour plots and response surface plots of the effects of the interaction of various factors on the polyphenol radical scavenging rate

圖7 基于y1優(yōu)化的四維交互曲面Fig.7 The 4-D interactive surface based on the optimizing of y1

圖8 基于y2優(yōu)化的四維交互曲面Fig.8 The 4-D interactive surface based on the optimizing of y2

圖9 各因素交互作用對(duì)多酚提取量及自由基清除率影響的等高線圖和響應(yīng)面圖Fig.9 Contour plots and response surface plots of the effects of the interaction of various factors on the extraction amount and radical scavenging rate of polyphenol

2.2.3 雙響應(yīng)面最佳工藝預(yù)測(cè)及驗(yàn)證試驗(yàn) 通過(guò)Design Expert 8.0.6數(shù)據(jù)分析軟件優(yōu)化,得到最佳提取工藝參數(shù)的理論值為丙酮濃度78.7%,料液比1∶45 g/mL,提取時(shí)間91.2 min,此時(shí)多酚提取量的理論值為75.48 μg GAE/mg DW,自由基清除率理論值為70.90%。經(jīng)驗(yàn)證,多酚提取量實(shí)際值為(75.39±0.10) μg GAE/mg DW,自由基清除率為70.82%±0.11%,與理論值差異不顯著(P>0.05),方法可行。

2.3 Matlab試驗(yàn)結(jié)果及數(shù)據(jù)分析

通過(guò)編程,得到溶劑濃度(%)、料液比(g/mL)、提取時(shí)間(min)對(duì)GSP含量和羥自由基清除率的四維效果圖(圖7、圖8)。當(dāng)GSP提取量(y1)取得理論最大值(75.49 μg GAE/mg DW)時(shí),通過(guò)矩陣計(jì)算得到丙酮濃度78.67%,料液比1∶45 g/mL,提取時(shí)間為91.53 min;同理,當(dāng)GSP羥自由基清除率(y2)取得理論最大值(70.91%)時(shí),丙酮濃度78.67%,料液比1∶45 g/mL,提取時(shí)間為90.92 min。

為了更好地描述分析數(shù)據(jù)間的交互影響,分別繪制當(dāng)提取時(shí)間短(75 min)、中(90 min)、長(zhǎng)(105 min)時(shí),料液比與溶劑濃度對(duì)y1、y2交互影響的三維旋轉(zhuǎn)曲面與等高線投影圖(圖9)。

當(dāng)提取時(shí)間(C)取下限值(C=75 min)時(shí),固定料液比(B),隨著溶劑濃度(A)的升高,y1(實(shí)線)先增大后減小;固定A值,隨著B(niǎo)的升高,y1持續(xù)降低。y2(虛線)趨勢(shì)與y1基本一致。此時(shí),y1取值范圍為52.65～67.58 μg GAE/mg DW,y2取值范圍為55.64%～66.29%。當(dāng)料液比為1∶40～1∶45 mL/g,溶劑濃度在75%～83%時(shí),y1和y2可同時(shí)取得最大值。

當(dāng)提取時(shí)間(C)取中間值(C=90 min)時(shí),y1和y2的變化趨勢(shì)與C=75 min時(shí)一致。此時(shí),y1取值范圍為59.32～75.40 μg GAE/mg DW,y2取值范圍為60.08%～70.90%。當(dāng)料液比為1∶42～1∶45 mL/g,溶劑濃度約76%～82%時(shí),y1和y2可同時(shí)取得最大值。

當(dāng)提取時(shí)間(C)取上限值(C=105 min)時(shí),y1和y2的變化趨勢(shì)與C=75 ℃和90 ℃時(shí)一致。此時(shí),y1取值范圍為53.22～70.48 μg GAE/mg dw,y2取值范圍為56.05%～67.06%。當(dāng)料液比接近1∶45 mL/g,溶劑濃度約77%～80%時(shí),y1和y2可同時(shí)取得最大值。

綜上所述,當(dāng)提取時(shí)間取中間值(C=90 min)時(shí),y1和y2均能夠取得理論較大值;當(dāng)丙酮濃度在75%～85%區(qū)間,料液比越趨近1∶45 mL/g,y1和y2的值越趨近最大值;與響應(yīng)面分析結(jié)論一致。

3 結(jié)論

本研究采用Box-Behnken雙響應(yīng)面優(yōu)化法結(jié)合Matlab分析法對(duì)GSP進(jìn)行提取工藝優(yōu)化及羥自由基清除率測(cè)定,得到最優(yōu)參數(shù)為:丙酮濃度78.7%,料液比1∶45 g/mL,提取時(shí)間91.2 min,此時(shí),多酚提取量實(shí)際值(y1)為(75.39±0.10) μg GAE/mg DW,自由基清除率(y2)為70.82%±0.11%,均與理論值差異不顯著(P>0.05)。此外,經(jīng)Matlab分析,當(dāng)提取時(shí)間取中間值(C=90 min)時(shí),丙酮濃度處于76%～82%區(qū)間,料液比越趨近1∶45 mL/g,y1和y2的值越趨近理論最大值;與最終結(jié)論一致。雙響應(yīng)面與Matlab相結(jié)合的優(yōu)化方法,不僅能夠準(zhǔn)確得到最佳提取方案,也能夠更直觀的找出合理的工藝參數(shù)區(qū)間,為葡萄籽工業(yè)化加工利用研究提供理論基礎(chǔ)與創(chuàng)新依據(jù)。