(南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心, 糧油質(zhì)量控制與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇南京 210023)

花生是我國主要的油料作物和經(jīng)濟(jì)作物[1]。花生除少部分作為干果食用外,大部分作為油料用于制取花生油[2]?；ㄉ鷼ふ蓟ㄉ|(zhì)量的27%～33%,其中主要成分是半纖維素和粗纖維素,另有粗蛋白、粗脂肪、糖類和礦物質(zhì)等成分[3]。此外,還含有一些功能性成分,如黃酮類化合物、白藜蘆醇、胡蘿卜素、木糖、皂草苷等[4],具有抗炎、降血糖[5]、降血脂[6]和增強(qiáng)免疫功能等藥理作用[7]。目前花生殼作為燃料使用,造成資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。若能通過有效的提取方法,將其分級提取物中的功能性成分進(jìn)行開發(fā)利用,對于提高花生殼經(jīng)濟(jì)效益和保護(hù)環(huán)境具有重要意義[8]。

食品的腐敗主要由微生物引起,因此可以通過抑制微生物的活性，延緩或阻止其生長,從而對食品進(jìn)行防腐保鮮[9]。添加防腐劑是一種方便、有效的食品防腐方法。有關(guān)花生殼中有效成分的提取[10]和對食品中微生物抑制作用研究已取得一定進(jìn)展。Zhang等[11]應(yīng)用微波輔助酶法提取花生殼多酚,通過牛津杯法實(shí)驗(yàn)證明其具有明顯抗菌活性,可作為潛在抗氧化劑和防腐劑的來源。趙二勞等[12]綜述了近十年來對花生殼中黃酮類成分的提取工藝有溶劑提取、酶法提取、微波輔助、超聲波輔助,純化工藝有大孔樹脂純化、金屬絡(luò)合法、高速逆流色譜分離純化、分子印跡分離純化等。汪海峰等[13]對花生殼甲醇粗提取物成分分析,其中主要的黃酮類化合物木犀草素的含量達(dá)12.6%。陳春濤等[14]通過乙醇粗提、溶劑梯度萃取，配合抑菌活性跟蹤檢測,得到了抑菌活性較強(qiáng)、富含黃酮類的花生殼乙酸乙酯組分,并用酸堿沉淀、柱層析等法純化得到三種化合物。以往的研究在溶劑浸取時只采用一種溶劑粗提后再進(jìn)行后續(xù)的抑菌試驗(yàn),但有關(guān)花生殼分級提取物抑菌活性及穩(wěn)定性的研究鮮見報道。

本文采用不同極性溶劑對花生殼分級提取其中有效活性成分,研究提取物對食品中常見腐敗菌和致病菌抑制活性及穩(wěn)定性,為其開發(fā)成高效、低毒、穩(wěn)定的食品天然防腐劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花生殼 選取產(chǎn)自江蘇省南通市的優(yōu)質(zhì)花生,手工剝殼并去除發(fā)黑、有蟲洞的次品，將花生殼清洗瀝干后置于50 ℃烘箱中烘干4 h,粉碎過40目篩,密封袋保存;大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bascillussubtilis)、沙門氏菌(Salmonellaenteritidis) 江蘇省疾病預(yù)防控制中心微生物試劑廠;營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯(LB) 青島高科園海博生物技術(shù)有限公司;牛肉膏、蛋白胨 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;石油醚(沸點(diǎn):30～60 ℃)、三氯甲烷、乙酸乙酯、無水乙醇(99%)、乙酸、氫氧化鈉、氯化鈉、氯化銅、氯化亞鐵、氯化鎂、氯化鉀、氯化鋁、蔗糖(均為分析純) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;去離子水 實(shí)驗(yàn)室自制。

ZQTY-70S型低溫?fù)u床 上海知楚儀器有限公司;FW100型高速粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司;BSC-1300IIA2型生物安全柜 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;RE-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;SHZ-DIII型循環(huán)水真空泵 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;DHP型電熱恒溫培養(yǎng)箱 金壇市醫(yī)療儀器廠;101-34S型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海蘇進(jìn)儀器設(shè)備廠;LDZX-50FBS型立式高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;鍍鉻游標(biāo)卡尺(0～150 mm) 桂林量具廠;便攜式pH計(jì) 愛德克斯;SCIENTZ-30UV型光源反應(yīng)箱(紫外燈波長254 nm) 南京妙之儀電子科技有限公司;FA2004N型分析天平 常州市衡正電子儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 花生殼分級提取物的制備 取50 g花生殼粉,用300目濾布進(jìn)行包裹后,500 mL溶劑(依次采用極性由小到大的溶劑:石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、無水乙醇、去離子水分級提取)浸泡24 h后,直接進(jìn)行索氏抽提3 h,收集提取物,旋蒸濃縮,回收各溶劑,用無水乙醇定容至50 mL,得到1000 mg/mL濃度的提取物(由于提取物得率較小,提取物濃度為花生殼的質(zhì)量/溶劑的體積)。采用倍數(shù)稀釋法,配制500、250、125、62.5、31.25 mg/mL濃度的提取物,4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌種的活化及菌懸液的制備 將供試菌(金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、沙門氏菌)分別接種于LB肉湯,36 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期(16～18 h),使用前,按10倍稀釋法,稀釋成菌濃度為106～107CFU/mL的菌懸液(采用平板計(jì)數(shù)法測定)[15]。

1.2.3 抑菌活性的測定 采用濾紙片法[16]測定花生殼分級提取物的抑菌活性,將無菌的直徑為6 mm的濾紙片分別浸泡于濃度為500 mg/mL的石油醚提取物、三氯甲烷提取物、乙酸乙酯提取物、無水乙醇提取物以及水提取物和無水乙醇(對照)中3 h,取出瀝干。取0.1 mL 1.2.2中的菌懸液,用無菌涂布棒均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂平板上,將上述濾紙片三個為一組呈正三角形平鋪皿中,倒置于36 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用游標(biāo)卡尺采用十字交叉法測量抑菌圈直徑。抑菌圈直徑越大,表明抑菌效果越好。

1.2.4 最低抑菌濃度的測定 采用試管二倍稀釋法[15]測定花生殼分級提取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的最低抑菌濃度,在1～9號無菌試管各加營養(yǎng)肉湯2 mL,在1號試管中加入2 mL花生殼提取物原液(濃度1000 mg/mL),混勻,取出2 mL移入2號試管,依次操作,至10號管取2 mL,各管最終體積2 mL,使花生殼分級提取物依次稀釋成500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95、0.98 mg/mL,各試管中加入50 μL 1.2.2中菌懸液,同時做兩支只加營養(yǎng)肉湯和菌液的陽性對照組和只加提取物和營養(yǎng)肉湯的陰性對照。

表1 花生殼分級提取物對供試菌的抑菌圈直徑(mm)Table 1 The diameter of the inhibition zone of the fractionated extract from peanut hull against tested bacterias(mm)

表2 方差分析Table 2 Analysis of variance

置36 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。當(dāng)陽性對照組試管內(nèi)呈渾濁狀,而陰性對照組試管內(nèi)呈透明狀時,觀察1～10號試管的透明度情況:若實(shí)驗(yàn)組試管內(nèi)出現(xiàn)渾濁狀,則說明該稀釋倍數(shù)下的培養(yǎng)基內(nèi)有微生物生長;若試管內(nèi)為透明,則說明該稀釋倍數(shù)下沒有微生物生長,將肉眼觀察試管內(nèi)液體澄清的最低花生殼提取物濃度記為花生殼提取物最低抑菌濃度。

1.2.5 花生殼乙酸乙酯提取物抑菌穩(wěn)定性的測定 實(shí)驗(yàn)菌種:金黃色葡萄球菌和大腸桿菌?；ㄉ鷼ひ宜嵋阴ヌ崛∥餄舛?250 mg/mL。濾紙片實(shí)驗(yàn)[17-21]中以溶劑無水乙醇作為陰性對照,以0.10 mg/mL氨芐青霉素鈉為陽性對照。

1.2.5.1 pH對花生殼乙酸乙酯提取物抑菌穩(wěn)定性的影響 分別用1 mol/L的乙酸和1 mol/L氫氧化鈉溶液將花生殼乙酸乙酯提取物的pH調(diào)為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0,以未調(diào)pH的提取物為對照,采用1.2.3方法測定抑菌活性。

1.2.5.2 溫度對花生殼乙酸乙酯提取物抑菌穩(wěn)定性的影響 將花生殼乙酸乙酯提取物分別在0(冰浴)、20、40、60、80、100 ℃的水浴中處理30 min,以未處理為對照,采用1.2.3方法測定抑菌活性。

1.2.5.3 金屬離子對花生殼乙酸乙酯提取物抑菌穩(wěn)定性的影響 將花生殼乙酸乙酯提取物分別與含0.5 g/mL K+、Cu2+、Mg2+、Fe2+、AL3+、Mn2+的鹽溶液(含0.5%的Tween-20)按1∶1混合,以未加金屬離子的提取物為對照,采用1.2.3方法測定抑菌活性。

1.2.5.4 短波紫外線對花生殼乙酸乙酯提取物抑菌穩(wěn)定性的影響 將花生殼乙酸乙酯提取物置于紫外燈下分別照射(波長254 nm,紫外燈距樣品25 cm)5、10、15、20、25 min,以未照射的提取物為對照,采用1.2.3方法測定抑菌活性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 花生殼分級提取物的抑菌活性

花生殼分級提取物(濃度500 mg/mL)對供試菌的抑菌圈直徑如表1所示,表明花生殼分級提取物對供試菌均有一定的抑制作用,其抑制作用的強(qiáng)弱與提取溶劑和試驗(yàn)菌種有關(guān)。不同提取物對同一種供試菌的抑菌能力進(jìn)行比較,提取物對于金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌的抑菌作用大小排列為:乙酸乙酯提取物>無水乙醇提取物>三氯甲烷提取物>石油醚提取物>水提取物,對于枯草芽孢桿菌為乙酸乙酯提取物>無水乙醇提取物>三氯甲烷提取物>水提取物>石油醚提取物;不同供試菌對同一種提取物的敏感程度進(jìn)行比較,對于乙酸乙酯提取物由強(qiáng)至弱排列為:金黃色葡萄球菌>枯草芽孢桿菌>大腸桿菌>沙門氏菌。方差分析如表2所示,表明不同溶劑提取物對抑菌圈大小的影響極顯著(P<0.01)。相同提取物下,供試菌的種類對抑菌圈大小差異極顯著(P<0.01),且菌種和提取溶劑交互作用與抑菌圈大小之間也具有顯著性差異(P<0.05)。主要原因是花生殼分級提取物中抑菌成分和菌種敏感性存在差異。通過抑菌活性的測定發(fā)現(xiàn),乙酸乙酯提取物抑菌作用最為明顯,其對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑大于枯草芽孢桿菌,對大腸桿菌的抑菌圈直徑大于沙門氏菌,初步判斷供試菌對提取物的敏感程度:金黃色葡萄球菌>枯草芽孢桿菌;大腸桿菌>沙門氏菌,因此,在穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中選擇金黃色葡葡球菌作為革蘭氏陽性菌的代表,大腸桿菌作為革蘭氏陰性菌的代表,一方面探究提取物在不同條件下的抑菌穩(wěn)定性,另一方面還可以探究提取物對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌影響的差別。

2.2 花生殼分級提取物最低抑菌濃度的測定

花生殼分級提取物最低抑菌濃度(MIC)的結(jié)果如表3和表4所示。

表3 花生殼分級提取物對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度(mg/mL)Table 3 The MIC of the fractionated extract from peanut hull against Staphylococcus aureus(mg/mL)

注:“-”表示無菌生長,“+”表示菌體生長少,“++”表示菌體生長較多,“+++”表示菌體生長很多;表4同。

表4 花生殼分級提取物對大腸桿菌的最低抑菌濃度(mg/mL)Table 4 The MIC of the fractionated extract from peanut hull against E.coli(mg/mL)

石油醚提取物、三氯甲烷提取物、乙酸乙酯提取物、無水乙醇提取物、水提取物對金黃色葡萄球菌的MIC分別為250、125、31.25、62.5、250 mg/mL,對大腸桿菌的MIC分別為125、250、62.5、62.5、125 mg/mL。通過比較,乙酸乙酯提取物的抑菌活性最強(qiáng);石油醚提取物與水提取物對供試菌的MIC較大且抑菌活性較差;花生殼分級提取物對金黃色葡萄球菌抑制作用優(yōu)于大腸桿菌。因此可推測花生殼分級提取物對革蘭氏陽性菌的抑菌作用更為明顯。同時可得花生殼乙酸乙酯提取物對供試菌的抑菌效果最為明顯,因此選其用于進(jìn)行后續(xù)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。

2.3 花生殼乙酸乙酯提取物抑菌穩(wěn)定性

花生殼乙酸乙酯提取物抑菌穩(wěn)定性的測定,未處理的花生殼乙酸乙酯提取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑分別為:(11.43±0.04)、(10.61±0.12) mm。

2.3.1 pH對花生殼乙酸乙酯提取物抑菌活性的影響 pH對花生殼乙酸乙酯提取物抑菌作用的影響如圖1所示,隨著pH的增大,抑菌圈直徑呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢,pH為4～7時,與未處理組相比,其抑菌活性較穩(wěn)定,即花生殼乙酸乙酯提取物的抑菌活性在中性或者弱酸性環(huán)境中活性較強(qiáng),對于金黃色葡萄球菌,pH在4～6時逐漸增強(qiáng),當(dāng)pH為6時,金黃色葡萄球菌的抑菌直徑達(dá)到最大值為(10.65±0.39) mm,pH大于6,抑菌作用逐漸減小。對于大腸桿菌,pH在4～5時抑菌作用略有增加,當(dāng)pH為5時,大腸桿菌的抑菌圈達(dá)到最大值為(10.07±0.19) mm,pH大于5,抑菌作用減小。堿性環(huán)境中,抑菌作用顯著下降(P<0.05)。說明花生殼乙酸乙酯提取物中的有效抑菌成分易受到堿的破壞[22],生物系統(tǒng)中的pH和代謝產(chǎn)物也可使多酚類化合物的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,從而影響其特性[23]。Quan等[24]研究發(fā)現(xiàn),在堿性條件下綠茶兒茶酚酚類物質(zhì)會分解或變?yōu)橥之悩?gòu)體,導(dǎo)致其活性下降。另一方面,外界環(huán)境pH也會影響著微生物的生長,不同pH下微生物細(xì)胞膜電位、物質(zhì)電離程度及溶解度不同[25]。

圖1 pH對花生殼乙酸乙酯提取物抑菌活性的影響Fig.1 Effect of pH on the antibacterial activity of ethyl acetate extract from peanut hull

圖2 溫度對花生殼乙酸乙酯提取物抑菌活性的影響Fig.2 Effect of temperature on the antibacterial activity of ethyl acetate extract from peanut hull

2.3.2 溫度處理對花生殼乙酸乙酯提取物抑菌活性的影響 溫度處理對花生殼乙酸乙酯提取物抑菌活性的影響如圖2所示,20～80 ℃處理30 min,其抑菌作用與未處理組相比變化不明顯,具有良好的熱穩(wěn)定性。60 ℃處理后抑菌圈達(dá)到最大值,金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑分別為(10.22±0.18)、(9.28±0.58) mm。過高或過低溫度處理(0和100 ℃)會明顯降低花生殼乙酸乙酯提取物的抑菌活性。

2.3.3 金屬離子種類對花生殼乙酸乙酯提取物抑菌活性的影響 金屬離子對花生殼乙酸乙酯提取物抑菌活性的影響如圖3所示,與對照組相比,花生殼乙酸乙酯提取物中加入Cu2+、Fe2+、Al3+后,金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑分別增長到(21.94±1.12)、(20.195±1.82)、(17.33±1.75);(20.015±0.58)、(21.43±0.98)、(16.08±1.06) mm,其抑菌活性明顯增強(qiáng);加入Mg2+、K+、Mn2+后,其抑菌活性明顯減低。原因一是Cu2+、Fe2+金屬離子本身對菌體的生長存在抑制作用,金屬離子能夠使蛋白質(zhì)(如酶)變性,破壞正常的生理活動,導(dǎo)致生命有機(jī)體中毒甚至死亡[26];二是金屬離子與抑菌成份發(fā)生螯合作用,從而提高其抑菌效力[27]。葉倩等[28]認(rèn)為鐵、鋅等金屬離子及其螯合物對鮑曼不動桿菌的抗菌活性具有一定的增強(qiáng)作用。鐵、鋅等金屬離子通過與一系列酶的協(xié)同作用,調(diào)控外排泵或影響生物膜形成及其黏附性等來抑制細(xì)菌生長。

2.3.4 紫外線照射對花生殼乙酸乙酯提取物抑菌活性的影響 紫外線照射對花生殼乙酸乙酯提取物抑菌活性的影響如圖4所示,由圖4可知,5～10 min紫外線處理與未處理組相比,其抑菌活性比較穩(wěn)定,但隨著處理時間的增加,抑菌活性呈下降趨勢,處理15 min后,金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑明顯減小至(9.04±0.16)、(8.87±0.44) mm。謝慧等[29]研究表明隨紫外輻射時間延長,輻射距離縮短,紅棗色素中總多酚、花色苷和總黃酮含量明顯降低。由此可推測花生殼乙酸乙酯提取物中的活性抑菌成分經(jīng)紫外線處理后受到一定的破壞,從而影響了抑菌作用。

圖4 紫外線對花生殼乙酸乙酯提取物抑菌活性的影響Fig.4 Effect of UV on the antibacterial activity of ethyl acetate extract from peanut hull

3 結(jié)論

通過采用不同極性的有機(jī)溶劑分級提取,表明花生殼分級提取物對供試菌均有一定的抑制作用,其抑制作用的強(qiáng)弱與提取溶劑和試驗(yàn)菌種有關(guān),提取物對于金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌的抑菌作用大小從大到小排列為:乙酸乙酯提取物>無水乙醇提取物>三氯甲烷提取物>石油醚提取物>水提取物,對于枯草芽孢桿菌為乙酸乙酯提取物>無水乙醇提取物>三氯甲烷提取物>水提取物>石油醚提取物;不同供試菌對同一種提取物的敏感程度不同,對于乙酸乙酯提取物由強(qiáng)至弱排列為:金黃色葡萄球菌>枯草芽孢桿菌>大腸桿菌>沙門氏菌。通過比較抑菌圈直徑和MIC值可知,花生殼乙酸乙酯提取物抑菌作用最為明顯。

抑菌穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明,隨著pH的增大,抑菌圈的直徑呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢,在中性或者弱酸性環(huán)境中活性較強(qiáng),在堿性環(huán)境中抑菌作用明顯降低。因此,在食品生產(chǎn)中,在pH較低的食品中能更好地發(fā)揮其抑菌作用?；ㄉ鷼ひ宜嵋阴ヌ崛∥镌?0～80 ℃處理30 min,具有良好的熱穩(wěn)定性;過高或過低溫度處理(0和100 ℃)會明顯降低其抑菌活性,因此可應(yīng)用于常溫食品的防腐抑菌。5～10 min紫外線處理,花生殼乙酸乙酯提取物的抑菌活性較穩(wěn)定,但隨著處理時間的延長其抑菌作用呈下降趨勢。因此,在食品防腐過程中,在一定時間內(nèi)可結(jié)合紫外共同殺菌處理。不同種類的金屬離子對花生殼乙酸乙酯提取物抑菌作用具有差異性,Cu2+、Fe2+、Al3+可增強(qiáng)其抑菌作用,Mg2+、K+、Mn2+可降低其抑菌作用。

花生殼提取物具有較高的抑菌活性,且在食品常規(guī)加工條件下,抑菌活性具有穩(wěn)定性。因此,花生殼提取物用于食品天然防腐劑的開發(fā)具有良好的前景。但由于提取物中成分復(fù)雜,對于究竟是其中的哪些成分起到了抑菌作用及其抑菌機(jī)理還需要進(jìn)一步的探討與研究。