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(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018; 2.內(nèi)蒙古自治區(qū)草食家畜飼料工程技術(shù)研究中心,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

植物多酚廣泛分布于植物的根、葉、皮、果實(shí)、果皮中,又稱鞣質(zhì)、單寧,是一類具有多羥基化合物的次生代謝產(chǎn)物[1]。多酚的結(jié)構(gòu)有著獨(dú)特的性質(zhì),能夠與蛋白質(zhì)、多糖等相結(jié)合,并且可與金屬離子形成絡(luò)合物[2]。多酚一般分為游離酚、結(jié)合酚和束縛型多酚,其中游離酚和結(jié)合酚屬于可溶性酚類物質(zhì),而束縛型多酚屬于不可溶型酚類物質(zhì)[3]。植物多酚具有清除自由基、抗過(guò)敏、抗誘變、降血脂等生理功能[4]。同時(shí),多酚還具有很強(qiáng)的抗氧化活性,很多研究表明多酚的抗氧化活性與其含量、結(jié)構(gòu)有著密切的關(guān)系[5-9]。

小麥麩皮是小麥加工成面粉的過(guò)程中產(chǎn)生的主要副產(chǎn)品[10],多糖和多酚是麥麩中最主要的生理活性物質(zhì),對(duì)機(jī)體的健康發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。由于人們?cè)缙趯?duì)于小麥麩皮的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和功能作用認(rèn)識(shí)不夠全面,直接將其用作飼料和一些產(chǎn)品原料[11],使得其價(jià)值得不到充分發(fā)揮,造成了這一資源的嚴(yán)重浪費(fèi)。

小麥麩皮多酚大多存在于細(xì)胞壁,且以酯鍵或醚鍵的形式與糖相結(jié)合[12]。目前已經(jīng)有越來(lái)越多關(guān)于從麩皮中提取多酚的研究,例如一些傳統(tǒng)的水提法,超聲波輔助法,微波輔助法、生物法等[13]。微生物發(fā)酵法提取多酚是目前的研究熱點(diǎn)。例如,胡博涵[3]通過(guò)微生物發(fā)酵的方法,將麥麩中的束縛型酚酸釋放,提高了麥麩的總酚含量和阿魏酸含量,并且提高了其抗氧化活性。周聰[14]通過(guò)微生物發(fā)酵得到紫麥麩皮總酚含量比未發(fā)酵提高了兩倍,并且提高了紫麥麩皮的抗氧化活性。由此可見,微生物發(fā)酵法處理麩皮,不僅可提高多酚含量和改變其組成,而且可增強(qiáng)其抗氧化活性,但相關(guān)研究主要集中在曲霉菌發(fā)酵麩皮提取多酚物質(zhì)。利用枯草芽孢桿菌和釀酒酵母菌混合發(fā)酵提取麩皮多酚的研究尚未見報(bào)道。本研究選用枯草芽孢桿菌和釀酒酵母菌固態(tài)發(fā)酵提取麩皮多酚,分析發(fā)酵條件對(duì)多酚含量的影響,并對(duì)其水溶性多酚的組成和抗氧化活性進(jìn)行研究,為麩皮的高附加值開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌種:釀酒酵母CGMCC2.119、枯草芽孢桿菌CGMCC1.892 內(nèi)蒙古自治區(qū)草食家畜飼料工程技術(shù)研究中心保存;麩皮、豆粕粉、玉米粉 均購(gòu)于市場(chǎng);尿素、乙醇、麥芽汁液體培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、沒食子酸、福林酚、無(wú)水碳酸鈉、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、FeSO4、H2O2、水楊酸、Na2HPO4、NaH2PO4、六氰合鐵酸鉀、三氯乙酸、FeCl3等 均為國(guó)產(chǎn)市售。

HVA-85型壓力蒸汽滅菌鍋、GXZ型智力光照培養(yǎng)箱 寧波東南儀器有限公司;SH2-82型旋轉(zhuǎn)氣浴恒溫振蕩器 金壇市岸頭中旺實(shí)驗(yàn)儀器廠;ZHJH-C1214C型超凈工作臺(tái)、HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 中國(guó)鄄城華魯電熱電器有限公司;TDL-5-A型臺(tái)式高速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;Epoch2型微孔板分光光度計(jì) 美國(guó)伯騰儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 微生物發(fā)酵條件對(duì)麥麩水溶性多酚含量的影響 發(fā)酵菌種為釀酒酵母:枯草芽孢桿菌2∶1;實(shí)驗(yàn)室成員前期研究發(fā)現(xiàn),玉米粉和豆粕可以提高發(fā)酵麩皮中多糖含量[15],通過(guò)分析多酚含量發(fā)現(xiàn)也有明顯提高,故本試驗(yàn)選擇發(fā)酵底物以麩皮為主(麩皮、玉米粉、豆粕粉各占80.46%、9.32%、10.22%),接種量為10%,將菌液與水以一定比例混合配制成濃度為108CFU/g的菌溶液,與發(fā)酵底物混合發(fā)酵。

1.2.1.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)麩皮多酚含量的影響 發(fā)酵時(shí)間設(shè)置為48、60、72、84、96 h,液料比(菌溶液∶發(fā)酵底物)為1∶1 (mL/g),發(fā)酵溫度37 ℃,發(fā)酵結(jié)束后產(chǎn)物于45 ℃烘干,備用。

1.2.1.2 發(fā)酵溫度對(duì)麩皮多酚含量的影響 發(fā)酵溫度設(shè)置為31、34、37、40 ℃,液料比為1∶1,發(fā)酵時(shí)間84 h,發(fā)酵結(jié)束后產(chǎn)物于45 ℃烘干,備用。

1.2.1.3 發(fā)酵液料比對(duì)麩皮多酚含量的影響 發(fā)酵液料比設(shè)置為1∶1.5、1∶1.2、1∶1、1∶0.8、1∶0.6,發(fā)酵時(shí)間為84 h,發(fā)酵溫度37 ℃,發(fā)酵結(jié)束后產(chǎn)物于45 ℃烘干,備用。

1.2.2 水溶性多酚的提取 將烘干的發(fā)酵麩皮和未發(fā)酵麩皮粉碎,以1∶16 (g/mL)的料水比,90 ℃恒溫水浴35 min,水提后的上清液放入烘箱70 ℃烘干,制得水提物。將水提物用60%乙醇以1∶55 (g/mL)的料液比進(jìn)行多酚提取,50 ℃水浴2 h,離心取上清,冷凍干燥,制備出游離型多酚提取物。殘?jiān)? mol/L的NaOH處理16 h,離心取上清,將pH調(diào)至中性,冷凍干燥,制備出結(jié)合型多酚提取物[16]。

1.2.3 多酚含量的測(cè)定 先配制1000 μg/mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液,然后用上述標(biāo)準(zhǔn)液制作濃度分別為:0、10、20、30、40、50 μg/mL的沒食子酸工作液。配制10%福林酚試劑與7.5%的Na2CO3。從不同濃度的沒食子酸工作液中取1 mL,加入5 mL 10%的福林酚試劑,搖勻反應(yīng)3～8 min,加入4 mL 7.5%的Na2CO3搖勻室溫反應(yīng)1 h,在765 nm處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。同樣方法測(cè)定樣品吸光值,計(jì)算多酚含量(mg/g)。

式中:c為用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的多酚濃度,mg/g;V為提取液體積,mL;D為稀釋倍數(shù);m為發(fā)酵麩皮干粉的質(zhì)量,g。

1.2.4 多酚組成測(cè)定 取冷凍樣品0.5 g,加液氮研磨,用8 mL 60%乙醇轉(zhuǎn)移到50 mL錐形瓶,100 Hz超聲波提取30 min。冷凍離心機(jī)10000 r/min、4 ℃離心10 min,取上清液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中35 ℃低壓蒸出乙醇,殘?jiān)?0 mL超純水(Milli-Q超純水儀,18 MΩ·cm)轉(zhuǎn)移到50 mL錐形瓶中。用1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH至7.0,加入乙酸乙酯20 mL,振蕩10 min,然后轉(zhuǎn)移到分液漏斗中分離,水相用20 mL乙酸乙酯萃取1次,合并酯相為中性酚。再用6 mol/L鹽酸溶液調(diào)水相pH至2.0,用20 mL乙酸乙酯萃取2次,合并酯相為酸性酚。將中性酚和酸性酚合并后35 ℃下濃縮至干,殘?jiān)苡?0%甲醇中,在棕色容量瓶中定容至10 mL,用0.22 μm濾膜過(guò)濾,上樣檢測(cè)。

采用Diamonsil C18液相色譜柱(5 μm,4.6 mm×250 mm);柱溫30 ℃;流速設(shè)為1 mL/min;進(jìn)樣量為10 μL;流動(dòng)相為0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(A)與乙腈水溶液(82∶18,v/v);梯度洗脫程序?yàn)? min,7% B;25 min,18% B;30 min,22% B;31 min,50% B;40 min,50% B。采用VWD測(cè)器檢測(cè),檢測(cè)波長(zhǎng)為245 nm。

與標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間比較確定色譜峰所屬的化合物種類,通過(guò)峰面積計(jì)算各種化合物含量,結(jié)果以干基表示(mg/kg)。

1.2.5 水溶性多酚抗氧化活性測(cè)定

1.2.5.1 還原力測(cè)定 將1.2.2中制備的樣品溶于水配制成0、0.5、1、2、4 mg/mL的溶液待測(cè),將0.75 mL樣品與0.75 mL磷酸鹽緩沖液(200 mmol/L,pH=6.6)、0.75 mL 1%六氰合鐵酸鉀50 ℃反應(yīng)20 min,加0.75 mL三氯乙酸終止反應(yīng),取1.5 mL加1.5 mL水和400 μL 0.1%的FeCl3室溫反應(yīng)10 min,700 nm測(cè)定吸光度,吸光度越高,還原力越高。

1.2.5.2 DPPH自由基清除率測(cè)定 將1.2.2中制備的樣品溶于水配制成0、0.5、1、2、4 mg/mL的溶液待測(cè),參照Musa[17]的方法,2 mL不同濃度樣品加2 mL DPPH溶液混勻30 min后517 nm處測(cè)定其吸光度。

計(jì)算公式:

式中:A0表示樣品與DPPH反應(yīng)吸光度;A1表示樣品與95%乙醇反應(yīng)吸光度;A2表示DPPH與水反應(yīng)吸光度。

1.2.5.3 羥基自由基清除率測(cè)定 將1.2.2中制備的樣品溶于水配制成0、0.5、1、2、4 mg/mL的溶液待測(cè),參考Rajauria等[18]的測(cè)定方法,0.5 mL樣品與0.5 mL FeSO4(9 mmol/L)、H2O2(8.8 mmol/L)室溫反應(yīng)10 min,然后與0.5 mL水楊酸乙醇溶液(9.0 mmol/L)室溫反應(yīng)30 min,510 nm處測(cè)定吸光度。

計(jì)算公式:

式中:A0表示蒸餾水代替樣品吸光度;A1表示樣品吸光度;A2表示蒸餾水代替FeSO4溶液吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS 9.2統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行了單因素方差分析,采用Origin 94-64軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，方程為y=5.9249x+0.0554,R2=0.9996,在測(cè)定范圍內(nèi),線性關(guān)系良好,可用于多酚含量的測(cè)定。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of gallic acid

圖2 不同發(fā)酵時(shí)間水溶性麩皮多酚含量的變化Fig.2 Changes of polyphenol content in water-soluble bran under different fermentation time 注:小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05),含有相同字母 表示差異不顯著(P>0.05)；圖3～圖4，圖7～圖9同。

2.2 不同發(fā)酵條件對(duì)水溶性多酚含量的影響

2.2.1 不同發(fā)酵時(shí)間水溶性麩皮多酚含量的變化 圖2表示不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)多酚含量的影響,由圖可以看出,在發(fā)酵48～84 h,多酚含量隨發(fā)酵時(shí)間的增加而提高,可能由于發(fā)酵時(shí)間過(guò)短,微生物生長(zhǎng)不足,發(fā)酵不完全,隨著時(shí)間的增長(zhǎng)微生物充分生長(zhǎng)繁殖,在84 h多酚含量達(dá)到最大值,84 h之后多酚含量開始下降,可能是隨著發(fā)酵時(shí)間的增加,微生物生長(zhǎng)進(jìn)入了衰亡期,提取多酚的能力減弱[19],不再有酚類物質(zhì)提出,反而隨著時(shí)間的增加,部分酚酸被降解[21],導(dǎo)致多酚含量下降。因此選用最佳發(fā)酵時(shí)間為84 h。

2.2.2 不同發(fā)酵溫度水溶性麩皮多酚含量的變化 微生物生長(zhǎng)繁殖都有其適宜的溫度,隨著溫度的改變,其生長(zhǎng)速率也會(huì)發(fā)生改變[20]。由圖3可以看出,隨著發(fā)酵溫度的升高,在31～37 ℃隨著發(fā)酵溫度的升高，多酚含量逐漸上升,在37 ℃多酚含量最高,可能溫度過(guò)低,微生物生長(zhǎng)緩慢[20],使得酚類物質(zhì)提取不充分。37～40 ℃隨著發(fā)酵溫度的升高,多酚含量逐漸下降?？赡苡捎跍囟冗^(guò)高,導(dǎo)致微生物生理代謝受到影響,酚類物質(zhì)得率降低。因此,得到最佳發(fā)酵溫度為37 ℃。

圖3 不同發(fā)酵溫度水溶性麩皮多酚含量的變化Fig.3 Changes of polyphenol content in water-soluble bran under different fermentation temperature

2.2.3 不同液料比水溶性麩皮多酚含量的變化 由圖4可知,隨著液料比的增加,在1∶1.5～1∶1之間,多酚含量逐漸上升,可能由于水分過(guò)低使得微生物的生長(zhǎng)得不到足夠的水分,使其生長(zhǎng)受限,影響發(fā)酵效果,因此多酚含量較低。液料比在1∶1～1∶0.6時(shí),多酚的含量下降,可能由于水分過(guò)高使得小麥麩皮結(jié)塊,降低麩皮透氣性[21],導(dǎo)致發(fā)酵效果不佳,多酚含量降低。因此最終選用液料比為1∶1作為發(fā)酵條件。

圖6 樣品HPLC色譜圖Fig.6 HPLC diagram of the sample 注:A:發(fā)酵結(jié)合酚;B:發(fā)酵游離酚;C:未發(fā)酵結(jié)合酚;D:未發(fā)酵游離酚。

圖4 不同液料比水溶性麩皮多酚含量的變化Fig.4 Changes of polyphenol content in water-soluble bran under different ratio of feed to liquid

根據(jù)單因素結(jié)果發(fā)酵麥麩,得到發(fā)酵后多酚含量為(13.41±0.10) mg/g,而未發(fā)酵麩皮多酚含量為(3.40±0.02) mg/g,表明發(fā)酵可以增加麩皮多酚的釋放。小麥麩皮中酚酸類物質(zhì)大多以結(jié)合態(tài)的形式存在于細(xì)胞壁[22],微生物發(fā)酵使得細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)松散,從而使酚類物質(zhì)得以釋放,多酚含量增加。隨著多酚含量的增加,麩皮多酚的組成成分有何變化尚需進(jìn)一步分析。FC法常用于測(cè)定多酚含量,但由于FC試劑容易被一些糖、蛋白質(zhì)、環(huán)狀有機(jī)物等還原,導(dǎo)致多酚含量明顯被高估[23]。因此為了準(zhǔn)確測(cè)定多酚組成中單體酚的濃度,本試驗(yàn)采用了高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定。

2.3 發(fā)酵與未發(fā)酵麩皮水溶性多酚的主要組成分析

圖5為標(biāo)品的HPLC色譜圖,圖6為樣品的HPLC色譜圖。

圖5 標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖譜Fig.5 HPLC spectrum of standard

由表1可看出,發(fā)酵麩皮中游離酚的主要組成成分有阿魏酸和香豆酸,且阿魏酸含量高于香豆酸。發(fā)酵麩皮中結(jié)合酚阿魏酸含量達(dá)到1160.6 mg/kg。未發(fā)酵麩皮中游離酚包括少量阿魏酸,香豆酸含量為14.78 mg/kg,結(jié)合酚含有941.49 mg/kg阿魏酸。與未發(fā)酵麩皮相比,發(fā)酵后的阿魏酸含量都明顯升高,而游離香豆酸含量降低,可能是發(fā)酵過(guò)程中一些香豆酸被降解成揮發(fā)性的酚類物質(zhì)[24],從而導(dǎo)致發(fā)酵后香豆酸含量下降。因此,微生物發(fā)酵可以提高游離型和結(jié)合型阿魏酸含量,改變水溶性多酚的組成比例。Yin等[25]的報(bào)道采用泡盛曲霉、米曲霉和黑曲霉發(fā)酵小麥麩皮,發(fā)酵麩皮中阿魏酸含量分別達(dá)到(416.6±2.2)、(117.4±0.5)、(92.0±0.2) μg/g,較未發(fā)酵麩皮阿魏酸含量(27.5±0.5 μg/g)分別提高了1414.9%、326.9%、234.5%。同時(shí),該研究發(fā)現(xiàn)采用高效液相色譜法測(cè)得的多酚含量遠(yuǎn)低于FC法,如FC法測(cè)得黑曲霉發(fā)酵麩皮中多酚含量為10707.5 μg/g,而高效液相色譜法測(cè)得多酚含量為676.4 μg/g,其結(jié)果與本試驗(yàn)相似。

表1 發(fā)酵與未發(fā)酵麩皮水溶性多酚的主要組成成分Table 1 The main components of water-soluble polyphenols in fermented and unfermented bran

2.4 抗氧化活性研究

2.4.1 發(fā)酵前后水溶性多酚的還原力變化 還原力表示了抗氧化物質(zhì)的供電子能力,還原性越強(qiáng),則說(shuō)明樣品抗氧化能力越強(qiáng)[20],圖7顯示了不同濃度下發(fā)酵與未發(fā)酵麩皮中水溶性多酚的還原力,并以BHA作為陽(yáng)性對(duì)照,由圖7可以看出,發(fā)酵與未發(fā)酵麩皮中水溶性多酚的還原力隨著樣品濃度的升高而逐漸增強(qiáng),且無(wú)論是游離型多酚還是結(jié)合型多酚,發(fā)酵麩皮水溶性多酚的還原力均高于未發(fā)酵,且二者均低于對(duì)照組。杜小燕等[26]研究表明,發(fā)酵能夠?qū)Ⅺ滬熤械氖`型酚類物質(zhì)釋放出來(lái),從而引起抗氧化活性的變化。本試驗(yàn)結(jié)果表明發(fā)酵后的總酚含量提高,并且發(fā)酵使得束縛型的阿魏酸釋放,因此還原力也有所提高。

圖7 水溶性多酚提取物還原力Fig.7 Reducing power of water soluble polyphenol extract

2.4.2 發(fā)酵前后水溶性多酚提取物清除DPPH自由基的能力 圖8顯示了不同濃度下發(fā)酵與未發(fā)酵麩皮中水溶性多酚的DPPH自由基清除率,同時(shí)以BHA作為陽(yáng)性對(duì)照,由圖8可知,隨著樣品濃度的升高,對(duì)DPPH自由基的清除率逐漸升高,兩者呈正相關(guān)[14],根據(jù)線性方程計(jì)算得到發(fā)酵麩皮游離酚、結(jié)合酚、未發(fā)酵麩皮游離酚、結(jié)合酚以及BHA的IC50分別為:(0.849±0.132)、(2.737±0.075)、(1.958±0.086)、(3.706±0.072)、(0.208±0.22) mg/mL,IC50值越小，其抗氧化能力越強(qiáng)[27],由此可知,發(fā)酵麩皮水溶性多酚對(duì)DPPH自由基的清除率明顯高于未發(fā)酵麩皮水溶性多酚,二者都低于對(duì)照組?？赡苡捎诎l(fā)酵增加了麩皮多酚的釋放,從而提高其對(duì)DPPH自由基的清除能力。并且有研究表明小麥麩皮的抗氧化能力與發(fā)酵釋放的以阿魏酸為主的多酚類物質(zhì)的增加有密切相關(guān)性[28],這與本研究的結(jié)果相一致。

圖8 水溶性多酚提取物清除DPPH自由基的能力Fig.8 The ability of water-soluble polyphenol extracts to scavenge DPPH free radicals

2.4.3 發(fā)酵前后水溶性多酚提取物清除羥基自由基能力 由圖9可知,發(fā)酵麩皮與未發(fā)酵麩皮中水溶性多酚以及對(duì)照組BHA對(duì)羥基自由基的清除率與其濃度都成線性關(guān)系,發(fā)酵麩皮游離酚、結(jié)合酚的IC50分別為(3.815±0.073)、(5.104±0.077) mg/mL,未發(fā)酵麩皮游離酚、結(jié)合酚的IC50分別是(2.572±0.073)、(3.495±0.074) mg/mL,BHA的IC50為(4.968±0.083) mg/mL,由此可見,未發(fā)酵樣品中水溶性多酚對(duì)羥基自由基的清除能力明顯高于發(fā)酵樣品,且二者都高于對(duì)照組,有研究表明,酚類物質(zhì)的抗氧化活性與總酚的含量和酚類化合物的組成存在密切的關(guān)系[29],因此,本試驗(yàn)所得結(jié)果可能是由于發(fā)酵與未發(fā)酵麩皮中多酚的組成不同導(dǎo)致其對(duì)羥基自由基發(fā)揮的作用不同。

圖9 水溶性多酚提取物清除羥基自由基的能力Fig.9 The ability of water-soluble polyphenol extracts to scavenge hydroxyl radicals

3 結(jié)論

枯草芽孢桿菌和釀酒酵母菌混合固態(tài)發(fā)酵可以提高麩皮多酚含量,在料液比為1∶1、發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵時(shí)間84 h條件下,水溶性麩皮多酚含量為(13.41±0.10) mg/g,較發(fā)酵前提高了294.41%(未發(fā)酵麥麩水溶性多酚含量為(3.40±0.02) mg/g)。由此可見,微生物發(fā)酵可以明顯提高水溶性麩皮多酚含量。

微生物發(fā)酵改變了水溶性多酚的組成比例,提高了游離型和結(jié)合型阿魏酸含量,且水溶性麩皮多酚主要以結(jié)合型阿魏酸形式存在。發(fā)酵后,麩皮多酚的還原力和DPPH自由基清除率均得到提高,而羥基自由基的清除率卻出現(xiàn)了下降,這可能與其組成有關(guān),相關(guān)研究有待進(jìn)一步探討。