(貴陽學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院,貴州貴陽 550005)

隨著生活水平的不斷提高,糖尿病的發(fā)病率日益增加[1],引起糖尿病及各種并發(fā)癥的原因主要是由于食源碳水化合物在α-淀粉酶和葡萄糖苷酶作用下較快的分解成葡萄糖和果糖,從而促進了血糖的快速增加[2-3]。其中,α-淀粉酶是調(diào)節(jié)血糖的關(guān)鍵之一,抑制該酶的活性能夠有效阻礙或延緩碳水化合物分解的還原糖類物質(zhì)在小腸被吸收和利用,從而避免餐后血糖的快速升高[4-6]。目前使用的抑制劑有人工合成和天然產(chǎn)物提取這兩類,天然產(chǎn)物中獲得的α-淀粉酶抑制劑主要在小腸中發(fā)揮著抑制作用,可減少合成類藥物對人體肝臟的損傷[4]。目前,已有報道α-淀粉酶抑制劑可從微生物源和植物源黃酮、多糖中獲得[5,7]。如鷹嘴豆、小麥、葛根及秋葵多糖、苦瓜和昆侖雪菊多糖對α-淀粉酶均具有一定的抑制作用[8-13]。也有報道果蔬汁經(jīng)過發(fā)酵后黃酮類物質(zhì)含量的增加,減緩了碳水化合物的分解速度從而達到控制血糖快速波動的作用[14-15]。番茄因含有番茄紅素、黃酮、多酚等營養(yǎng)物質(zhì),具有良好的抗氧化性、抗衰老及降血糖等作用[16-17]。但就目前的報道來看,番茄經(jīng)過自然發(fā)酵后對α-淀粉酶的抑制作用未見報道。

因發(fā)酵工藝相對天然產(chǎn)物活性物質(zhì)提取工藝,具有制備便捷、成本低等優(yōu)勢,故本研究以具有降血糖作用的番茄為原料,采用自然發(fā)酵方式,通過體外模型研究發(fā)酵液對α-淀粉酶的抑制作用,旨在為番茄及其發(fā)酵產(chǎn)品的開發(fā)拓寬利用領(lǐng)域,也為預(yù)防高血糖功能性食品的研發(fā)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

番茄 果實飽滿、色澤均勻、果蒂硬挺,購于沃爾瑪超市;可溶性淀粉 分析純,天津市永大化學(xué)試劑有限公司;氫氧化鈉 分析純,國藥集團;酒石酸鉀鈉 分析純,天津市登科化學(xué)試劑有限公司;結(jié)晶酚 分析純,天津市大茂化學(xué)試劑廠;3,5-二硝基水楊酸 分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司;無水硫酸鈉 分析純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;無水乙醇 分析純,天津市富宇精細化工有限公司;磷酸二氫鉀 分析純,天津市致遠化學(xué)試劑有限公司;阿卡波糖標準品 99.80%,Sigma;α-淀粉酶 45.5 U/mg,合肥博美生物科技有限責任公司。

SHB-III循環(huán)水真空泵 上海亞榮生化儀器廠;AUW120D電子分析天平 日本島津公司;TGL-16A高速臺式離心機 湖南平凡科技有限公司;AS3120A超聲波清洗器 上海浦鴻儀器廠;202-1AB型恒溫干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司;UV-2550紫外分光光度儀 日本島津公司;PURIST超純水系統(tǒng) 上海樂楓生物科技有限公司;SHA-B數(shù)顯水浴恒溫振蕩器 常州澳華恩斯儀器有限公司;LDZX-30KBS高壓滅菌鍋 上海申安有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 番茄發(fā)酵液的制備 沖洗番茄表面黏附的雜物后,再用無菌水沖洗番茄表面并于無菌室晾干;白砂糖用紫外燈處理,按新鮮番茄與白砂糖(w/w)3∶1比例加入到已滅菌的玻璃瓶中,密封并放在暗處,室溫發(fā)酵90 d,發(fā)酵初期定時排氣并搖勻物料,分別在第0、10、20、30、60和90 d取樣。將發(fā)酵樣品破碎后10000 r/min離心10 min,稀釋10倍后待測。

1.2.2α-淀粉酶抑制作用研究

1.2.2.1 發(fā)酵液稀釋倍數(shù)對抑制α-淀粉酶的影響 參照上述α-淀粉酶抑制作用的測定方法1.2.3,取發(fā)酵30 d的樣液,分別稀釋5、7、9、11和13倍后與淀粉酶作用,再加入可溶性淀粉溶液反應(yīng)5 min,最后加入1 mL DNS溶液終止反應(yīng),沸水浴5 min,分析不同番茄發(fā)酵液濃度對α-淀粉酶的抑制效果。

1.2.2.2 反應(yīng)時間對抑制α-淀粉酶的影響 參照上述α-淀粉酶抑制作用的測定方法1.2.3,取發(fā)酵30 d的樣液與淀粉酶分別作用5、10、15、20和25 min后,然后與可溶性淀粉溶液反應(yīng)5 min,最后加入1 mL DNS溶液終止反應(yīng),沸水浴5 min,分析反應(yīng)時間對α-淀粉酶的抑制效果。

1.2.2.3 反應(yīng)溫度對抑制α-淀粉酶的影響 參照上述α-淀粉酶抑制作用的測定方法1.2.3,取發(fā)酵30 d的樣液與淀粉酶分別在25、29、33、37、41和45 ℃條件下作用5 min,然后與可溶性淀粉溶液反應(yīng)5 min,最后加入1 mL DNS溶液終止反應(yīng),沸水浴5 min,分析不同反應(yīng)溫度對α-淀粉酶的抑制效果。

1.2.2.4 pH對番茄發(fā)酵液抑制α-淀粉酶的影響 參照上述α-淀粉酶抑制作用的測定方法1.2.3,取發(fā)酵30 d的樣液與淀粉酶分別在pH為6.4、6.6、6.8、7.0、7.2的條件下作用,然后與可溶性淀粉溶液反應(yīng)5 min,最后加入1 mL DNS溶液終止反應(yīng),沸水浴5 min,分析不同pH對α-淀粉酶的抑制效果。

1.2.2.5 番茄發(fā)酵液對α-淀粉酶抑制類型的研究 分別在0.1、0.3、0.5、0.7 U/mL淀粉酶作用下,按1.2.3的方法分析添加或不添加發(fā)酵液兩種條件下的吸光度A,每種條件設(shè)三個平行,以酶濃度對反應(yīng)速率作圖,根據(jù)動力學(xué)圖的特征分析番茄發(fā)酵液對α-淀粉酶抑制類型屬于可逆或不可逆抑制類型[18-20]。

分別以0.3、0.5、0.7和0.9 mL 1%淀粉為底物,按1.2.3方法分析添加或不添加發(fā)酵液條件下的吸光度A,作Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖,確定番茄發(fā)酵液對α-淀粉酶抑制作用屬于競爭性抑制或非競爭性抑制[18-20]。

1.2.3 番茄自然發(fā)酵對α-淀粉酶的抑制作用 參照3,5-二硝基水楊酸比色法[5,21],取6 U/mLα-淀粉酶和1 mL發(fā)酵樣液混合搖勻,于37 ℃水浴預(yù)熱5 min 后,加入0.8 mL 1%淀粉溶液反應(yīng)5 min,最后加入1 mL DNS溶液終止反應(yīng),沸水浴5 min,取出冷卻后,用超純水定容至25 mL,以超純水作空白調(diào)零,在540 nm下測定吸光值。其中,以0.6 mLα-淀粉酶加入0.8 mL 1%淀粉溶液和1 mL DNS作為空白;0.8 mL 1%淀粉溶液和1 mL DNS作為空白對照管;1 mL發(fā)酵樣液加入0.8 mL 1%淀粉溶液和1 mL DNS為背景對照管。以5 mg/mL阿卡波糖溶液替代發(fā)酵液作為陽性對照,測定吸光值A(chǔ),并計算其抑制率,計算式如下:

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2010和SPSS 17.0進行分析,數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示,以P<0.05作為差異顯著性判斷標準。

2 結(jié)果與討論

2.1 番茄自然發(fā)酵對α-淀粉酶抑制作用的影響

由圖1可知,番茄自然發(fā)酵液具有抑制α-淀粉酶活性的作用。番茄發(fā)酵10 d時,發(fā)酵液對α-淀粉酶的抑制率迅速上升(P<0.05),20 d時其抑制率達到最大,但10～30 d內(nèi)其抑制率變化差異不顯著(P>0.05);且均高于紫菜和山藥多糖[22],但低于5 mg/mL阿卡波糖陽性對照組(P<0.05)及桑葚渣提取物[23];說明番茄經(jīng)過發(fā)酵后對α-淀粉酶的抑制作用增強。這可能在番茄發(fā)酵前30 d過程中,發(fā)酵液中的多酚、黃酮類活性物質(zhì)顯著增加,而這些物質(zhì)具有較高的降糖活性[24];隨著發(fā)酵時間逐漸延長,60 d時番茄發(fā)酵液對α-淀粉酶的抑制率顯著下降(P<0.05),而與90 d時的抑制率差異不顯著(P>0.05),但均高于未發(fā)酵的番茄(P<0.05),這可能是由于發(fā)酵時間增加,體系pH逐漸下降不利于微生物的生長或代謝產(chǎn)物的積累,抑制了降糖活性,導(dǎo)致α-淀粉酶抑制率降低;因此,就α-淀粉酶抑制作用效果,番茄自然發(fā)酵10～30 d較好。

圖1 番茄自然發(fā)酵對α-淀粉酶的抑制作用Fig.1 Inhibition effect of tomato fermented on alpha-amylase

2.2 α-淀粉酶抑制作用研究

2.2.1 發(fā)酵液稀釋倍數(shù)對抑制α-淀粉酶的影響 圖2所示α-淀粉酶的抑制率在番茄發(fā)酵液稀釋倍數(shù)的范圍內(nèi),隨著濃度的降低其抑制率呈下降趨勢(P<0.05),說明抑制率與稀釋倍數(shù)具有線性關(guān)系,這可能是隨著番茄發(fā)酵液稀釋倍數(shù)的增大,其中多酚、番茄紅素等活性物質(zhì)的濃度下降從而使α-淀粉酶抑制率逐漸降低;這與槲皮素、山藥多糖及紫菜多糖等物質(zhì)對α-淀粉酶抑制率與抑制劑存在劑量依賴關(guān)系這一結(jié)果相近[18,22]。

圖2 發(fā)酵液稀釋倍數(shù)對抑制率的影響Fig.2 Effect of dilute concentration on inhibition rate

2.2.2 反應(yīng)時間對抑制α-淀粉酶的影響 不同反應(yīng)時間對發(fā)酵液抑制α-淀粉酶的影響如圖3所示,隨著作用時間的增加,其抑制率呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢。反應(yīng)10 min時抑制率達到最高,此時番茄發(fā)酵液能有效阻礙淀粉酶與淀粉的結(jié)合;番茄發(fā)酵液對α-淀粉酶作用10 min后,其抑制活性隨時間增加而下降(P>0.05),可能由于發(fā)酵液和酶的結(jié)合已趨于飽和[25],芳姜黃酮及其衍生物在不同反應(yīng)時間下對α-淀粉酶活性抑制率也隨時間的增加呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢,最佳反應(yīng)時間為15 min[3]。而魏振奇等[26]得到的齊墩果酸對α-淀粉酶作用的最佳反應(yīng)時間為25 min,且隨時間的增加,抑制率逐漸上升,這與本實驗得出結(jié)果不同,推測造成不同的原因可能是二者間存在不同的抑制劑,其抑制劑的作用方式有所不同,具體原因還有待進一步研究。本試驗表明番茄發(fā)酵液與α-淀粉酶的結(jié)合作用較快,在反應(yīng)時間10 min 時對α-淀粉酶的抑制率達到了最大。

圖3 反應(yīng)時間對抑制率的影響Fig.3 Effect of reaction time on inhibition rate

2.2.3 反應(yīng)溫度對抑制α-淀粉酶的影響 如圖4所示,當反應(yīng)溫度在25～45 ℃范圍時,番茄發(fā)酵液對α-淀粉酶的抑制率隨溫度的增加呈先增加后減小的趨勢(P>0.05);番茄發(fā)酵液對α-淀粉酶的抑制作用在33 ℃時達到最大;隨著反應(yīng)溫度的持續(xù)升高,對α-淀粉酶抑制率逐漸降低,這可能是由于溫度的增加對酶的結(jié)構(gòu)造成了一定的影響,從而限制了發(fā)酵液中的抑制劑組分與淀粉酶的結(jié)合[25];遲永楠等[27]研究發(fā)現(xiàn)反應(yīng)溫度低于60 ℃時對白蕓豆抑制α-淀粉酶的活性沒有太大影響;陳睿等[28]報道灰栒子提取物在0～90 ℃范圍內(nèi)對α-淀粉酶抑制作用無明顯影響;總之,本試驗在25～41 ℃的范圍內(nèi)番茄自然發(fā)酵液對α-淀粉酶活性抑制率的變化較小(P>0.05),由此推測番茄發(fā)酵液中抑制劑在試驗溫度范圍內(nèi)具有較好的熱耐受性,其穩(wěn)定性較好。

圖4 反應(yīng)溫度對抑制率的影響Fig.4 Effect of temperature on inhibition rate

2.2.4 pH對番茄發(fā)酵液抑制α-淀粉酶的影響 由圖5所示,番茄發(fā)酵液對α-淀粉酶的抑制作用條件偏中性,在pH6.4～6.8范圍內(nèi),其抑制率隨著pH的增加逐漸升高;在pH6.8 時番茄發(fā)酵液對α-淀粉酶的抑制作用達到最大(P<0.05);當pH大于7.0后,隨著pH升高其抑制率顯著下降(P<0.05),可能由于堿性條件使淀粉酶的活性中心和發(fā)酵液抑制劑結(jié)構(gòu)發(fā)生解離或改變[25],從而阻礙了抑制劑對α-淀粉酶的抑制作用。本實驗結(jié)果與乙醇浸提的水翁花對α-淀粉酶活性抑制[29]的結(jié)果相似。

圖5 pH對抑制率的影響Fig.5 Effect of pH on inhibition rate

圖6 發(fā)酵液對α-淀粉酶的抑制動力學(xué)曲線Fig.6 Inhibition kinetics curves of fermentation broth on α-amylase

2.2.5 番茄發(fā)酵液對α-淀粉酶的抑制類型 如圖6所示,在酶濃度與反應(yīng)速率相互關(guān)系中,發(fā)酵液抑制劑組的直線斜率低于無抑制劑組的直線斜率,且兩條直線均通過了原點,故可推斷番茄發(fā)酵液對α-淀粉酶的抑制類型屬于可逆抑制。

按照動力學(xué)方法區(qū)分番茄發(fā)酵液對α-淀粉酶的可逆性抑制作用,在米氏方程的雙倒數(shù)圖(圖7)中看出,發(fā)酵液組相比無抑制劑組的反應(yīng)速度減小,添加或不添加番茄發(fā)酵液的兩條直線回歸方程的延長線均相交于橫坐標軸,表明番茄發(fā)酵液的加入并沒有改變酶對底物的親和力,發(fā)酵液與底物可同時與酶的不同部位結(jié)合,并在底物存在下發(fā)酵液才能發(fā)揮其抑制作用[21,30],故發(fā)酵液對α-淀粉酶活性的抑制作用屬于非競爭性抑制。這與甜葉菊毛狀根綠原酸類化合物[5]及黑果腺肋花楸多酚[6]對α-淀粉酶活性的抑制作用相似,不同于高粱原花青素[21]和山藥多糖[25]對α-淀粉酶活性的抑制作用,它們則屬于競爭性抑制。再根據(jù)圖中兩直線與橫坐標軸交點和直線回歸方程推算,兩直線相交的橫坐標即番茄發(fā)酵液對α-淀粉酶催化活性抑制常數(shù)為4.01 mg/mL。

圖7 抑制作用的雙倒數(shù)圖Fig.7 Double reciprocal plot of inhibition effect

3 結(jié)論

番茄經(jīng)過自然發(fā)酵后能夠顯著提高對α-淀粉酶的抑制作用,尤其在發(fā)酵10～30 d時其抑制能力較強;其次,發(fā)酵液抑制α-淀粉酶的最優(yōu)作用條件為:抑制劑與淀粉酶在33 ℃、pH6.8下作用10 min,這表明番茄發(fā)酵液對α-淀粉酶的抑制作用溫和且親和力較強;并且番茄發(fā)酵液對α-淀粉酶的抑制屬于非競爭可逆型,其抑制常數(shù)為4.01 mg/mL。這表明番茄發(fā)酵液可作為保健產(chǎn)品開發(fā)的原料,同時為α-淀粉酶抑制劑的開發(fā)和利用提供了新途徑,但發(fā)酵液中組分較復(fù)雜,對α-淀粉酶起抑制作用的具體物質(zhì)結(jié)構(gòu)和作用機理還有待于進一步解析。