,*,2,*

(1.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院,天津市食品生物技術(shù)重點實驗室,天津 300134; 2.天津天獅學(xué)院食品工程學(xué)院,天津 301700)

白蘇(Perillafrutescens),唇形科(Lamiaceae)紫蘇屬(Perilla)植物,是紫蘇的近似種[1]。白蘇與紫蘇的最大區(qū)別是其葉片背面呈現(xiàn)白色,且全株密被白色長柔毛[2]。作為常見的藥食同源植物,國內(nèi)外的研究更多致力于紫蘇,而忽略了同樣資源豐富的白蘇。白蘇具有抑菌、抗氧化、抗衰老等作用,但前人對其研究主要集中于白蘇莖葉中所富含的揮發(fā)油的成分[3-6]及其抑菌[7-9]、抗氧化活性[10]等,對于白蘇黃酮類物質(zhì)的報道甚少,主要是基于黃酮的提取條件及其優(yōu)化[11-14]。Lee等[15]發(fā)現(xiàn)韓國白蘇中含有芹菜素和芹菜素-7-氧-葡萄糖苷等黃酮類成分,并且白蘇葉黃酮的抗氧化性能明顯高于紫蘇葉黃酮[16]。目前,白蘇葉黃酮有待進一步的研究和開發(fā)。

中式培根是受消費者喜愛的一種腌臘肉制品,產(chǎn)品具有風(fēng)味獨特、營養(yǎng)豐富、保質(zhì)期長等傳統(tǒng)腌臘肉制品的優(yōu)點[17]。然而,該產(chǎn)品生產(chǎn)周期長,欠缺系統(tǒng)規(guī)范的加工理論,導(dǎo)致質(zhì)量不穩(wěn)定。脂質(zhì)氧化對腌臘肉制品風(fēng)味特征的形成具有重要貢獻,它是臘肉在鹽腌、干燥和貯藏中風(fēng)味形成的重要途徑[18]。但是過度的脂質(zhì)氧化會致使產(chǎn)品顏色、風(fēng)味和質(zhì)地變差,造成營養(yǎng)價值的損失,添加BHT等抗氧化劑是解決腌臘肉制品脂質(zhì)過氧化的最常用的方法,但消費者對合成抗氧化劑抱有一定的抵觸情緒,用天然抗氧化劑來替代合成的抗氧化劑或許是解決此問題最妥善的辦法。黃酮類物質(zhì)是常見的天然抗氧化劑,而資源豐富的白蘇葉資源又富含黃酮類成分,有望作為成本較低、綠色環(huán)保的天然抗氧化劑添加于腌臘肉制品。

前期實驗對乙醇微波輔助提取白蘇葉黃酮的條件進行了優(yōu)化,并利用大孔樹脂對黃酮進行了純化[19]?；诖?本文對白蘇葉醇提物成分進行鑒定,探索其作為天然抗氧化劑在中式培根加工中的應(yīng)用,旨在解決影響中式培根質(zhì)量的脂質(zhì)過度氧化問題,為白蘇的開發(fā)利用及白蘇黃酮作為天然抗氧化劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白蘇葉 河北省安國市祁澳中藥飲片有限公司,粉碎至約20目;五花肉 天津華潤萬家超市;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)(分析純)、甲醇(色譜純) 美國Sigma公司;甲酸(色譜純) 美國Tedia公司;原兒茶醛、咖啡酸、迷迭香酸(純度均>98%)天津一方科技公司;檸檬酸(純度>99%) 天津市化學(xué)試劑一廠;丹參素(純度>98%) 成都西亞化工股份有限公司;原兒茶酸、野黃芩苷(純度均>98%) 上海晶份有限公司純生化科技;AB-8大孔樹脂 南開大學(xué)化學(xué)工廠。

Agilent 6520 LC-Q-TOF液相色譜-四級桿-飛行時間質(zhì)譜(LC-Q-TOF-MS)及Agilent G6410A LC-MSD QQQ液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS) 美國Agilent公司;BP211D十萬分之一天平 德國Satorius公司;Lambda 25紫外可見分光光度計 美國Perkin-Elmer儀器有限公司;DH4000BⅡ電熱恒溫培養(yǎng)箱 天津市泰斯特儀器有限公司;FD-2冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司;Grace Reveleris TM全息快速純化色譜系統(tǒng) 美國Alltech公司;SSI 1500型高效液相色譜 美國Alltech公司;H2050R-1醫(yī)用離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 7種標(biāo)準(zhǔn)品包括檸檬酸、丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛、咖啡酸、野黃芩苷和迷迭香酸,使用甲醇溶解后混合,其中各標(biāo)準(zhǔn)品終濃度均為0.005 mg/mL,使用時逐級稀釋至所需的濃度。

1.2.2 白蘇葉醇提物的純化 按照作者之前的研究[19],以63%的乙醇為溶劑,利用微波輔助提取法(提取條件為:乙醇濃度63%、液料比41∶1 mL∶g、微波溫度72 ℃、提取時間7 min以及微波功率500 W)提取白蘇葉黃酮,并利用AB-8大孔樹脂進行純化(白蘇葉純度為53.10%)。冷凍干燥得到白蘇葉醇提物粉末備用。使用甲醇配制4 mg/mL的白蘇葉醇提物樣品液,經(jīng)制備色譜分離純化初步得到2個組分,以下簡稱組分1和組分2(制備色譜具體分離純化條件見文獻[19]),測試樣品經(jīng)甲醇溶解后用0.22 μm微孔濾膜過濾。

1.2.3 白蘇葉醇提物成分的定性定量分析 色譜條件:ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),柱溫30 ℃,進樣量5 μL。流動相A、B均為含有0.1%甲酸的甲醇溶液和水溶液,流速0.3 mL/min,進行梯度洗脫:0～30 min,40%～75% A,30～35 min,70%～75% A。質(zhì)譜條件:Q-TOF為電噴霧Dual-ESI離子源,負(fù)離子模式,離子源溫度350 ℃,干燥氣流速為10 L/min,數(shù)據(jù)采集范圍m/z=100～1000,毛細(xì)管電壓3500 V,碰撞電壓175 V,Skimmer電壓35 V;MS/MS為電噴霧ESI負(fù)離子源溫度350 ℃,噴霧電壓4000 V,霧化氣及碰撞氣均為高純氮氣(純度>99.99%),流速10 L/min,霧化氣壓力和碰撞氣壓力分別為35 Psi和0.15 MPa。

定量分析采用HPLC-MS/MS的多重反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)對白蘇葉成分的特征碎片離子進行檢測,其中,具有標(biāo)準(zhǔn)品的7種物質(zhì)采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進行定量;對無法購得標(biāo)準(zhǔn)品的其余6種物質(zhì),峰4、6、7、10和11則使用與其結(jié)構(gòu)相近的黃酮類化合物野黃芩苷作為對比物進行對比定量法定量,即計算這些物質(zhì)的含量是基于野黃芩苷的當(dāng)量,峰8為迷迭香酸二聚體,則使用迷迭香酸進行對比定量。

1.2.4 白蘇葉醇提物成分對中式培根脂質(zhì)氧化的影響 參照文獻[20]的方法,于超凈工作臺內(nèi)將五花肉切割成相同的大小(每塊約150 g),并隨機分成四組,所用刀具和菜板均使用75%乙醇進行表面殺菌。每塊肉表面均勻涂抹食鹽進行腌制(用鹽量為2.0%),三個實驗組肉表面分別涂抹三個濃度0.01%、0.02%、0.05%(溶劑為63%乙醇和乙酸乙酯,1∶1)的純化后的白蘇葉醇提物,作為溶劑對照組的肉表面涂63%乙醇和乙酸乙酯(1∶1,少量乙酸乙酯的使用為了使黃酮更易涂抹和滯留于肉的表面)。之后經(jīng)過3 d的腌制期和18 d的發(fā)酵期。腌制溫度4 ℃,相對濕度85%;發(fā)酵初期25 ℃保持5 d,隨后發(fā)酵成熟期溫度以1.5 ℃/d的速率勻速升至40 ℃,相對濕度從85%以0.5%/d的速率勻速降至79.5%后保持不變。分別于腌制結(jié)束(3 d)、發(fā)酵中期(8 d)、成熟中期(13 d)、成熟結(jié)束(18 d)取四組樣品的表面脂質(zhì)部分,放入絞肉機中絞碎混勻,測定其脂質(zhì)氧化指標(biāo)(取樣工藝點具體指標(biāo)見表1)。丙二醛(MDA)和過氧化值(POV)均根據(jù)國標(biāo)法進行測定[21-22]。其中丙二醛的標(biāo)準(zhǔn)曲線為A532 nm=1.665C-0.0156(R2=0.9906)。

表1 取樣工藝點平均溫濕度Table 1 Average daily temperature and humidity of sampling days

表2 白蘇葉中主要成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 2 Standard curves of the main components in Perilla frutescens leaves

注:“-”:表示無相應(yīng)的結(jié)果；表3同。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用Agilent MassHunter工作站軟件-定量分析程序(B.07版本)進行白蘇葉醇提物成分的定量數(shù)據(jù)分析,使用SPSS(16.0版本)進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。所有測定平行進行3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 白蘇葉醇提物成分的定性定量分析

2.1.1 白蘇葉醇提物成分的定性分析 利用LC-Q-TOF-MS和LC-MS/MS從白蘇葉醇提物中鑒定了13種成分,總離子流圖見圖1。

混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液在相同條件下也進行質(zhì)譜分析,7個標(biāo)準(zhǔn)品與相應(yīng)的樣品成分具有一致的保留時間、母離子以及二級質(zhì)譜碎片離子,從而確定了白蘇葉成分中的7種物質(zhì),分別是檸檬酸(峰1)、丹參素(峰2)、原兒茶酸(峰3)、原兒茶醛(峰5)、咖啡酸(峰9)、野黃芩苷(峰12)和迷迭香酸(峰13)。白蘇葉主要成分分析的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線和定性定量分析結(jié)果分別見表2和表3。對于圖1中無標(biāo)準(zhǔn)品的成分,則通過二級質(zhì)譜圖譜解析并結(jié)合相關(guān)文獻進行鑒定。

圖1 白蘇葉醇提物組分1(A)、組分2(B) 和標(biāo)準(zhǔn)品溶液(C)的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms of fraction 1(A) and fraction 2(B)of the ethanol extract from Perilla frutescens leaves and standards(C)

其中峰4的分子離子峰[M-H]-為593.2,該化合物的分子式為C27H30O15,它的二級質(zhì)譜具有m/z 472.8、383.0和353.0,由此判斷出該化合物中含有兩個六碳糖[23]。根據(jù)文獻[24],推斷該化合物為芹菜素-6,8-二-C-葡萄糖苷。

表3 白蘇葉中主要成分的定量分析結(jié)果Table 3 Quantitation analysis results of the main components in Perilla frutescens leaves

峰6和峰7的分子離子峰[M-H]-均為m/z 637.2,由精確質(zhì)量推測其分子式為C27H26O18。二者的二級質(zhì)譜圖中有m/z 350.6、284.9以及350.8、284.8的碎片峰,推斷二者應(yīng)為同分異構(gòu)體。根據(jù)文獻[25-26]推斷此二種化合物為野黃芩素-7-氧-二葡萄糖醛酸苷和木犀草素-7-氧-二葡萄糖醛酸苷。

峰8的一級質(zhì)譜顯示分子離子峰[M-H]-為m/z 719.4,化學(xué)式為C36H32O16。其二級質(zhì)譜顯示m/z 359.4、178.7和160.7的碎片離子,這些碎片離子表明此化合物與迷迭香酸(m/z 359.1)有相似的結(jié)構(gòu)特征,故推斷其為迷迭香酸二聚體。

峰10的一級質(zhì)譜顯示分子離子峰[M-H]-m/z 621.2,分子式為C27H26O17。它的二級質(zhì)譜具有m/z 351.0、268.8和192.9的碎片離子。根據(jù)文獻[27]推斷該化合物為芹菜素-7-氧-二葡萄糖醛酸苷。

峰11的分子離子峰[M-H]-為447.2,通過對比其和木犀草苷的二級質(zhì)譜信息,樣品中m/z 447.2的質(zhì)譜峰與m/z 447的木犀草苷具有相同的母離子與碎片離子,但峰11的保留時間為19.228 min,相同條件下木犀草苷的保留時間為20.811 min,故推斷此化合物為木犀草苷的同分異構(gòu)體野黃芩素-7-氧-葡萄糖苷。

2.1.2 白蘇葉成分的定量分析 具有標(biāo)準(zhǔn)品的7種物質(zhì)采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進行定量,標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量結(jié)果詳見表2、表3;對無標(biāo)準(zhǔn)品的其余6種物質(zhì),峰4、6、7、10和11則使用野黃芩苷作為對比物進行對比定量法定量,峰8為迷迭香酸二聚體則使用迷迭香酸進行對比定量,定量結(jié)果亦見表3。結(jié)果可知,組分1和2的主成分分別為檸檬酸和迷迭香酸,由峰面積計算可得且各占其組分含量的28%和41%,此外,經(jīng)計算組分1和2含黃酮類物質(zhì)約為39%和53%。在一定的濃度范圍內(nèi),7種標(biāo)準(zhǔn)品的線性良好,決定系數(shù)介于0.987～0.999,檢出限介于0.37～6.3 ng/mL,回收率介于97.1%～109.5%,證明此法具有較高的靈敏度、精密度以及準(zhǔn)確性。本實驗結(jié)果(表3所示含量最高的為迷迭香酸和野黃芩苷)與前人對紫蘇葉黃酮的研究進行對比發(fā)現(xiàn),白蘇葉與紫蘇葉含量較多成分均為迷迭香酸、野黃芩苷,但其余成分有所差別,如胡軍華等[28]和胡惠軍等[29]分別得出不同產(chǎn)地紫蘇葉咖啡酸、野黃芩苷以及迷迭香酸的含量分別介于0.1081～0.4999、0.2727～4.3820和0.4315～9.5850 mg/g,這主要是由于產(chǎn)地、提取方法、定量分析方法等不同造成的。代沙等[30]的實驗亦表明,紫蘇以迷迭香酸和咖啡酸為主要酚酸類成分,槲皮素和芹菜素為主要黃酮類成分。

2.2 白蘇葉醇提物成分對中式培根在加工制作過程中脂質(zhì)氧化的影響

2.2.1 白蘇葉醇提物成分對中式培根加工過程中丙二醛(MDA)的影響 MDA作為衡量脂質(zhì)氧化二級產(chǎn)物、油脂酸敗的指標(biāo)[31],含量越高說明脂質(zhì)氧化程度越高。在中式培根加工過程中總體隨時間延長呈現(xiàn)上升趨勢(見圖2),由此可見脂質(zhì)氧化是伴隨整個加工過程。隨著天數(shù)的推移以及溫度與濕度的變化,中式培根的脂質(zhì)氧化程度逐漸加深。而涂抹0.05%白蘇葉醇提物的中式培根樣品的丙二醛含量全程均顯著低于對照組,且低于其他兩組中、低濃度的抗氧化處理組(P<0.05)。對照組丙二醛含量明顯高于經(jīng)過白蘇葉醇提物涂抹處理的實驗組,而丙二醛含量高低反映的是腌臘肉制品脂肪氧化酸敗程度[32],可見白蘇葉醇提物的添加對肉類脂質(zhì)氧化有一定的抑制作用,并且不同濃度的白蘇葉醇提物的抗氧化能力表現(xiàn)出不同,白蘇葉醇提物濃度越大,對脂質(zhì)氧化的抑制作用越明顯。使用0.05%的白蘇葉醇提物酮處理中式培根時,可以有效抑制中式培根的脂質(zhì)氧化。

圖2 白蘇葉醇提物對中式培根加工過程中 丙二醛(MDA)含量的影響Fig.2 Effects of the ethanol extract from Perilla frutescens leaves on the malondialdehyde(MDA)content in Chinese bacon during the production process 注:不同小寫字母代表相同時間不同濃度白蘇葉醇提物的 添加對MDA含量的影響差異顯著(P<0.05),圖3同。

圖3 白蘇葉醇提物對中式培根加工過程中 過氧化值(POV)的影響Fig.3 Effects of the ethanol extract from Perilla frutescens leaves on the peroxide value(POV)in Chinese bacon during the production process

2.2.2 白蘇葉醇提物成分對中式培根加工過程中過氧化值(POV)的影響 中式培根的POV在加工過程中總體呈上升趨勢(見圖3)。POV值是用來衡量脂肪初級氧化產(chǎn)物—氫過氧化物(HPOD或稱為ROOH)尤其是過氧化氫的重要參數(shù),是反映脂肪初級氧化程度的重要指標(biāo)[33]。中式培根的腌制過程中POV值明顯上升,這可能與腌制過程溫度逐漸升高有關(guān),溫度的升高可以加速脂質(zhì)氧化。閆文杰等[34]研究顯示,金華火腿腌制時過氧化值不斷上升,與本研究結(jié)果一致。但是,在王超[20]的研究中,經(jīng)迷迭香等抗氧化物質(zhì)處理的腌臘肉中的POV值在加工過程中有升有降,發(fā)酵中期有下降現(xiàn)象,但總體呈現(xiàn)上升趨勢。本研究中沒有明顯的POV值下降的現(xiàn)象,原因可能是由于發(fā)酵初期溫度較高,脂質(zhì)氧化速度較快,測樣取點時間間隔錯過了POV值明顯下降的點。對照組中腌制以及發(fā)酵初期過氧化值上升劇烈,脂質(zhì)初級氧化迅速,而涂抹白蘇葉醇提物的各處理組POV值雖有所上升,但相對于對照組趨勢明顯偏緩,這說明了白蘇葉醇提物的涂抹有效抑制了脂質(zhì)表層的初級氧化。其中涂抹0.05%白蘇葉醇提物中式培根的POV值整體上升趨勢均偏緩,且在腌制結(jié)束時,各組POV值順序為:對照組>0.01%白蘇葉醇提物處理組≥0.02%白蘇葉醇提物處理組>0.05%白蘇葉醇提物處理組(P<0.05)。經(jīng)過白蘇葉醇提物處理的POV值明顯低于對照組,且隨白蘇葉醇提物的添加量的增加而降低,說明經(jīng)過白蘇葉醇提物處理的中式培根樣品的脂質(zhì)氧化程度被有效抑制,并且與白蘇葉醇提物的濃度呈現(xiàn)正相關(guān)。本實驗采用的是白蘇葉醇提物進行中式培根的脂質(zhì)氧化抑制實驗,且由組分鑒定結(jié)果組分1和組分2的主成分分別為檸檬酸和迷迭香酸,且組分1的黃酮類物質(zhì)含量低于組分2(表3),檸檬酸供氫能力較弱,是常見的金屬螯合劑,而迷迭香酸以及黃酮類物質(zhì)均具有多個酚羥基結(jié)構(gòu),故推斷組分2比組分1具有更好的抗氧化活性,將來可分別使用組分1和2結(jié)合黃酮標(biāo)準(zhǔn)品分別進行抑制培根氧化實驗,進一步探討黃酮具體組分的可能作用機制。本實驗中對白蘇葉醇提物的添加組與未添加組進行了比較,添加組的POV值和丙二醛值均在國家標(biāo)準(zhǔn)的控制之內(nèi)。事實上,若實驗中采用常見的食用抗氧化劑如VC和BHT等作為陽性對照,結(jié)果則更具有說服力。

3 結(jié)論

本實驗首次從白蘇葉醇提物中鑒定出13種物質(zhì)為迷迭香酸、野黃芩苷、檸檬酸、芹菜素-6,8-二-C-葡萄糖苷、丹參素、木犀草素-7-氧-二葡萄糖醛酸苷、野黃芩素-7-氧-葡萄糖苷、迷迭香酸二聚體、野黃芩素-7-氧-二葡萄糖醛酸苷、芹菜素-7-氧-二葡萄糖醛酸苷、咖啡酸、原兒茶酸和原兒茶醛。并將白蘇葉醇提物應(yīng)用于中式培根加工中,經(jīng)過白蘇葉醇提物處理的中式培根試樣在發(fā)酵成熟結(jié)束時,丙二醛和過氧化值均顯著低于對照組(P<0.05),說明了白蘇葉醇提物處理有效地抑制了中式培根的脂質(zhì)氧化程度,抗氧化程度明顯,并且在質(zhì)量濃度范圍為0～0.05%時,白蘇葉醇提物的添加量越多,抑制效果越好。資源豐富的白蘇葉天然、安全,作為天然防腐劑具有明顯優(yōu)勢。本研究通過對白蘇葉醇提物成分進行分析鑒定并進一步將其應(yīng)用于抑制中式培根加工過程中的脂質(zhì)氧化,為白蘇葉資源的進一步開發(fā)利用奠定了理論基礎(chǔ)。