王兵亞,連秀儀2,楊琛擘3,郭旭冉4,申培紅5,*,劉文濤4,劉 樂

(1.鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,河南鄭州 450001; 2.河南富景生態(tài)旅游開發(fā)有限公司,河南鄭州 450001; 3.鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,河南鄭州 450001; 4.鄭州大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院,河南鄭州 450001; 5.鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院,河南鄭州 450008)

現(xiàn)階段國內(nèi)外對花青素的研究多集中于藍(lán)莓、紫薯、桑葚、黑枸杞等[16-19],對葡萄花青素的研究卻很少。同時,葡萄花青素的研究多集中于其常見生理活性成分的提取、純化、結(jié)構(gòu)分析及含量測定,尚未見對夏黑葡萄花青素抗衰老作用的研究。

因此本實驗以夏黑葡萄花青素提取物為研究材料,測定夏黑葡萄花青素清除DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥基自由基的能力和總還原能力來研究其抗氧化活性,同時采用D-半乳糖衰老動物模型[18],以此來研究夏黑葡萄花青素對小鼠血中抗氧化指標(biāo)及臟器的變化影響,綜合評價其體內(nèi)抗衰老活性,為開發(fā)以夏黑葡萄為原料的新型保健食品打下試驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

夏黑葡萄 采于河南富景生態(tài)旅游開發(fā)有限公司;夏黑葡萄花青素樣品 純度62.1%,鄭州大學(xué)材料學(xué)院;40只健康2月齡的ICR小鼠,雌鼠20只、雄鼠20只 購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,動物合格證號為SCXK(京)2016-0006。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境:溫度為20～22 ℃,相對濕度為50%～60%,自由飲水、進食；SOD和MDA測定試劑盒 南京建成生物工程研究所;蘇木素-伊紅染料 沈陽萬類生物有限公司;甲醇、三羥甲基氨基甲烷Tris溶液 北京博奧拓達科技有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 上海如吉生物公司;鄰苯三酚溶液、濃鹽酸溶液、磷酸鹽緩沖液、無水乙醇溶液、1%鐵氰化鉀溶液、FeSO4溶液、10%三氯乙酸溶液、鄰羥基苯甲酸溶液、0.1%三氯化鐵溶液、H2O2溶液(由實驗室提供配制) 天津科密歐化學(xué)試劑有限公司;D-半乳糖粉劑 上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司;VC標(biāo)品 上海麥克林生化科技有限公司,批號:201425,純度>99.0%;水 為超純水(屈臣氏蒸餾水)。

TG-16-WS型臺式高速離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司;UV-1100紫外可見分光光度計 上海光學(xué)儀器五廠有限公司;恒溫水浴槽 天津市泰斯特儀器有限公司;AZ2015型熱臺 安卓源科技有限公司;JJ124BC型電子天平 上海上平儀器有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;AB-8樹脂柱 南開合成科技有限公司;組織包埋機 美國Thermo公司;CUT4062石蠟切片機 德國SLEE公司;光學(xué)顯微鏡 日本Olympus公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 清除DPPH自由基能力的測定 用夏黑葡萄花青素提取物樣品分別配制成0.10、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00 mg/mL的溶液,取2 mL樣品溶液然后分別與2 mL 0.2 mmol/L的DPPH無水乙醇溶液混合,充分混合后靜置1 h,測定517 nm波長下的吸光度,記為Ax。同樣取上一個步驟配制的六個濃度梯度的樣品溶液各2 mL,分別與2 mL無水乙醇混合。混合均勻以后,測定517 nm波長下的吸光度值,記為Ad。準(zhǔn)確吸取2 mL蒸餾水與2 mLDPPH無水乙醇溶液混合均勻,測定517 nm波長下的吸光度值,記為A0。參比溶液均為1∶1混合的無水乙醇和蒸餾水。以VC為陽性對照[13],并根據(jù)式(1)計算DPPH自由基清除率。

DPPH自由基清除率(%)=[1-(Ax-Ad)/Ao]×100

式(1)

1.2.2 清除羥基自由基能力的測定 將樣品溶液配成0.10、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00 mg/mL六個濃度梯度的溶液,分別取1 mL樣品溶液然后先后加入1.0 mL 9 mmol/L硫酸亞鐵溶液、1.0 mL 9 mmol/L鄰羥基苯甲酸溶液和1.0 mL 9 mmol/L的H2O2溶液,充分搖勻。在37 ℃的水浴槽中加熱30 min,靜置25 min后,在波長510 nm處測定其吸光度Ax。用蒸餾水代替樣品溶液作為待測溶液,測定波長為510 nm下的吸光度Ao。以蒸餾水代替上述硫酸亞鐵、鄰羥基苯甲酸和H2O2溶液,測定波長為510 nm下的吸光度值(以上所有參比溶液均為蒸餾水),記為Ad。按上述反應(yīng)條件處理,以同樣濃度的Vc為空白對照。根據(jù)式(2)計算清除率。

清除率(%)=(Ao-Ax+Ad)/Ao×100

式(2)

1.2.3 清除超氧陰離子自由基能力的測定 將樣品溶液配成0.10、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00 mg/mL六個濃度梯度的溶液。取2.25 mL,pH為8.2的25 ℃下預(yù)熱過的濃度為50 mmol/L三羥甲基氨基甲烷(Tris)-HCI緩沖溶液,放置在10 ml的試管中,再將2 mL的樣品溶液加入試管中,接著加入溫度為25 ℃的60 mmol/L聯(lián)苯三酚溶液0.05 mL,快速搖勻混合反應(yīng)4 min后加入0.02 mL濃度為10 mol/L的濃鹽酸溶液終止反應(yīng)。參比溶液為蒸餾水,測定波長325 nm下的吸光度值,記為Ax。按上述方法,以2 mL蒸餾水代替樣品溶液,測定波長325 nm下的吸光度值,記為Ad。最后用蒸餾水替換聯(lián)苯三酚溶液,測定波長325 nm下的吸光度值,記為Ao。對同樣濃度VC作同樣處理并作為陽性對照。根據(jù)式(3)計算清除率,根據(jù)公式計算清除率。

清除率(%)=[Ad-(Ax-Ao)]/Ad×100

式(3)

1.2.4 測定總還原能力的測定 總還原能力的測定參考石甜甜等[20]采用的鐵離子還原抗氧化劑能力法進行。將樣品溶液配成0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mg/mL六個濃度梯度的溶液。分別取1 mL樣品溶液加入試管中,然后依次加入2.5 mL磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L,pH=6.6)和2.5 mL的1%鐵氰化鉀溶液,充分搖勻混合后,在50 ℃的條件下反應(yīng)20 min。反應(yīng)完畢后迅速冷卻,然后加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液,充分混勻后,以4000 r/min的速度離心15 min。離心完畢后取2.5 mL上清液,加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液,充分搖勻,反應(yīng)10 min后,然后以蒸餾水為參比,測定在波長700 nm下的吸光度值A(chǔ),吸光度值越大,表示總還原能力越強,對同樣濃度的VC做同樣處理并作為陽性對照。

1.2.5 實驗分組及衰老模型處理 40只小鼠按照300 mg/(kg·d)的劑量皮下注射滅菌D-半乳糖,連續(xù)注射55 d,構(gòu)建小鼠衰老模型,通過行為學(xué)檢測顯示造模成功[21]。隨后將建模成功的40只衰老模型小鼠根據(jù)體質(zhì)量按隨機數(shù)字表法隨機分成4組,每組10只,用夏黑葡萄花青素提取物進行灌胃,劑量分別為低劑量組50 mg/(kg·d)、中劑量組75 mg/(kg·d)、高劑量組100 mg/(kg·d),剩余10只用同體積生理鹽水灌胃作為衰老模型對照組,連續(xù)灌胃30 d。各組小鼠同室分籠飼養(yǎng),自由進食(基礎(chǔ)飼料)和水。

1.2.6 標(biāo)本采集及指標(biāo)測定 各組小鼠末次灌胃后,禁食不禁水,24 h后眼眶取血,小鼠脫頸處死。血漿于4 ℃低溫3500 r/min離心10 min,分離血清,根據(jù)試劑盒說明測定SOD水平和MDA水平。取各組小鼠大腦組織和腎臟組織置于10%甲醛溶液中固定,酒精梯度脫水,石蠟包埋,進行4 μm切片,HE染色后,中性樹脂封片,在顯微鏡下觀察變化情況,并拍照獲取所需圖片。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 夏黑葡萄花青素抗氧化活性分析

2.1.1 夏黑葡萄花青素清除DPPH自由基的能力 如圖1所示,夏黑葡萄花青素和VC對于DPPH自由基的清除能力隨著濃度的增大而增強。在兩者濃度都較低時,它們對于DPPH自由基的清除能力相差不大,但是在濃度到0.25 mg/mL時,夏黑葡萄花青素的清除能力達到了接近90%的水平,而此時VC的清除能力還處于較低狀態(tài);當(dāng)濃度到達0.5 mg/mL,兩組數(shù)據(jù)變化趨于平緩,最終兩者對DPPH自由基的清除率相差不大。由此看出在濃度區(qū)間上夏黑葡萄花青素對DPPH自由基的清除作用顯著強于VC(P<0.05)。

圖1 夏黑葡萄花青素與VC對DPPH自由基的清除作用Fig.1 DPPH radical scavenging ability of summer black grape anthocyanin and VC

2.1.2 夏黑葡萄花青素清除羥基自由基的能力 根據(jù)圖2顯示,二者對羥基自由基的清除能力隨著濃度的增大而增大,且VC溶液對羥基自由基的清除能力一直顯著高于夏黑葡萄花青素(P<0.05)。在濃度較低時,夏黑葡萄花青素和VC的清除能力相差不大,但是在濃度較高時,VC的清除能力明顯強于夏黑葡萄花青素,且在濃度較高時花青素的清除能力隨濃度提高速度變慢,并且最終未能夠達到60%,而VC的清除能力高達80%。

圖2 夏黑葡萄花青素與VC對羥基自由基清除作用Fig.2 Hydroxyl radical scavenging ability of summer black grape anthocyanin and VC

2.1.3 夏黑葡萄花青素清除超氧陰離子自由基的能力 由圖3可知,在實驗濃度范圍內(nèi)夏黑葡萄花青素量增加,超氧陰離子自由基的清除率升高。當(dāng)夏黑葡萄花青素濃度較低時,其清除超氧陰離子自由基的能力較低,在0.5～1.0 mg/mL的濃度區(qū)間清除自由基的能力隨濃度增大提高的最快,在之后提高速度變慢,在濃度區(qū)間范圍內(nèi),其對超氧陰離子自由基的清除率小于對照組VC,而且差異顯著(P<0.05),然而當(dāng)夏黑葡萄花青素濃度較高時其清除能力也能達到80%。因此,夏黑葡萄花青素具有較好的清除超氧陰離子自由基的能力,但是其能力弱于VC。

圖3 夏黑葡萄花青素與VC對超氧陰離子自由基清除作用Fig.3 Superoxide anion radical scavenging ability of summer black grape anthocyanin and VC

2.1.4 夏黑葡萄花青素總還原能力 從圖4可知,兩者的總還原力隨著濃度的增大而一直處于上升趨勢,且在0.05～0.30 mg/mL濃度范圍內(nèi)VC的總還原能力遠(yuǎn)大于夏黑葡萄花青素,差異顯著(P<0.05),同時夏黑葡萄花青素的總還原能力增強的速度明顯小于對照組VC。

對于以上抗氧化實驗的結(jié)果,究其原因可能是對于不同的自由基,夏黑葡萄花青素對其清除機理不同,并且隨著濃度的變化其清除效果也有明顯變化,所以清除能力也有很大差別?？偟膩碚f,夏黑葡萄花青素有較好的體外抗氧化活性。

圖4 夏黑葡萄花青素與VC的總還原能力Fig.4 Total reducing power of summer black grape anthocyanin and VC

2.2 夏黑葡萄花青素對衰老模型小鼠血清中MDA和SOD含量的影響

由表1可知,與模型對照組相比,其小鼠血清中的SOD水平顯著低于中、高劑量組(P<0.05);中、高劑量組小鼠血清中的SOD水平顯著高于低劑量組(P<0.05),MDA含量各劑量模型組都顯著低于模型對照組(P<0.05),同時,低、中、高劑量模型組小鼠血清SOD活性依次升高和血清MDA水平依次降低。夏黑葡萄花青素能夠提高衰老小鼠血清中SOD活性和減輕衰老小鼠體內(nèi)有害氧化物的積累,減少了細(xì)胞損傷,且劑量越大時可能作用更加明顯,說明高劑量的夏黑葡萄花青素對衰老小鼠保護作用良好。在以往研究中發(fā)現(xiàn):將“紫甘薯花青素、藍(lán)莓花青素[5,8]作用于衰老小鼠,結(jié)果都顯示小鼠血清及器官中 SOD活性顯著提高,MDA 含量下降,與本實驗有著類似的結(jié)果。

表1 各組小鼠血清中SOD活性和MDA含量Table 1 Activity of SOD and MDA content in serum of

注:*表示與模型對照組相比差異顯著(P<0.05),不同劑量組間不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 夏黑葡萄花青素對衰老模型小鼠大腦組織的影響

衰老模型對照組小鼠大腦組織可見神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量減少,大腦皮層區(qū)部分神經(jīng)元數(shù)量少,排列紊亂,形態(tài)不規(guī)則,邊界不清(圖5A);低劑量組小鼠大腦組織可見水腫(圖5B),細(xì)胞間隙增大,細(xì)胞核固縮,細(xì)胞形態(tài)開始變規(guī)則;中劑量組可見參與機體高級神經(jīng)活動和空間定位的海馬區(qū)變薄(圖5C),結(jié)構(gòu)異常;高劑量組小鼠大腦組織鏡下結(jié)構(gòu)形態(tài)正常,神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)規(guī)則,數(shù)量豐富,細(xì)胞間隙小,細(xì)胞數(shù)目較多,排列整齊,海馬區(qū)正常(圖5D)。

圖5 各組小鼠大腦組織切片(HE,400×)Fig.5 Histopathology of brain tissues in mice of each group(HE,400×) 注：A:對照組;B:低劑量組;C:中劑量組; D:高劑量組;E:正常小鼠。

圖6 各組小鼠腎臟組織切片(HE,400×)Fig.6 Histopathology of kidney tissues in mice of each group(HE,400×) 注:A:對照組;B:低劑量組;C:中劑量組; D:高劑量組;E:正常小鼠。

2.4 夏黑葡萄花青素對衰老模型小鼠腎臟組織的影響

如圖6所示,衰老模型對照組小鼠腎臟組織鏡下可見皮質(zhì)層腎小球數(shù)量減少,少量腎小球萎縮(圖6A),腎小血管硬化(圖6B),腎小球系膜和外基質(zhì)出現(xiàn)增生現(xiàn)象,腎集合管淀粉樣變(圖6C);高劑量組小鼠腎臟組織鏡下可見結(jié)構(gòu)形態(tài)正常,腎小球數(shù)量豐富,形態(tài)飽滿(圖6D),腎小球結(jié)構(gòu)完整并無損害情況。

3 結(jié)論

隨著經(jīng)濟發(fā)展和生活水平的提高,人們的健康意識也日益增強,人們對預(yù)期壽命提出了更高的要求,高效抗衰老已成為全民關(guān)注的熱門問題。同時隨著對花青素越來越深入的研究,其抗氧化活性和延緩衰老作用開始被醫(yī)學(xué)界所重視,花青素具有強大的抗氧化和清除自由基的功能,而目前對于夏黑葡萄花青素的抗氧化活性和抗衰老作用方面尚無系統(tǒng)研究。

本研究通過 D-半乳糖建立小鼠衰老模型來檢測夏黑葡萄花青素的衰老預(yù)防作用。研究發(fā)現(xiàn),夏黑葡萄花青素具有較強抗氧化活性,特別在濃度較大時其對于DPPH自由基的清除率能達到98%,這與文獻報道的夏黑葡萄花青素具有一定的抗氧化作用相一致[2,22-24]。體內(nèi)實驗顯示,夏黑葡萄花青素對D-半乳糖致衰老小鼠SOD活力具有提升作用,并且同時還降低MDA水平,可能與其清除氧自由基及其損傷細(xì)胞成分產(chǎn)生的有害產(chǎn)物、預(yù)防了老齡動物神經(jīng)、內(nèi)分泌等調(diào)節(jié)系統(tǒng)功能減退和微量元素的缺失,從而遏制了機體衰老導(dǎo)致的SOD合成減少等因素密切相關(guān)[5],從病理切片看,夏黑葡萄花青素具有抗氧化能力,這與之前文獻報道花青素具有抗衰老的作用結(jié)果一致[18-19,24-25]。

綜上所述,夏黑葡萄花青素能抑制并減緩衰老小鼠的機體衰老,具有增強小鼠體內(nèi)抗氧化,延緩衰老的作用。這為其進一步開發(fā)利用夏黑葡萄中的花青素提供了可靠的科學(xué)依據(jù)。然而,本研究僅對夏黑葡萄花青素的延緩衰老作用做了初步的探討,對夏黑葡萄花青素中起抗衰老作用的單體化合物的研究與其抗衰老的機理尚待研究。