李相國， 杜萬雪， 徐婭麗， 黃德斌， 胡澤華

(湖北民族大學醫(yī)學部， 湖北 恩施 445000)

馬桑(CoriariasinicaMaxim)的主要成分為馬桑內酯(coriria lactone)、馬桑亭(coriatin)和羥基馬桑毒素(tutin)，還含有槲皮素、山柰酚、谷甾醇及多種無機元素等。民間外用馬桑水提取物(CoriariasinicaMaxim’s extract，CSME)治療燒傷和經久不愈的創(chuàng)面等。本課題組研究證實，CSME能促進燒傷創(chuàng)面的修復，同時抑制其病理性瘢痕的過度增生[1]。為進一步探究其機制，本研究以CSME為干預藥物，探究其對大鼠燒傷創(chuàng)面轉化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)誘導整合素連接激酶(integrin-linked kinase，ILK)活性而增強細胞外基質(extracellular matrix，ECM)成分表達的調控效應，證實其機制與其多成分多靶點影響ILK和PI3K/AKT調控的信號通路有關?，F報告如下。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1馬桑水提取物的制備 參照文獻[1]，9月采集兩年生鮮原生紅馬桑植物枝條，經植物學鑒定后晾干粉碎備用。稱取馬桑干粉1 kg，浸泡30 min(1 000 mL蒸餾水)，每次煎煮90 min，共提取3次，將所得提取物合并、過濾，并用水浴鍋濃縮成CSME浸膏(100%，1 mL相當于10 g生藥)備用[1]。使用時，將其與醫(yī)用凡士林混合成外用燒傷軟膏(分別按1∶19、1∶9和1∶4的比例配成低、中和高劑量，相當于含生藥量5%、10%和20%)。

1.2儀器與試劑 YLS-5Q臺式超級控溫燙傷儀(天津科技發(fā)展有限公司)?？拐纤卅?(integrin-β1, ITG-β1)抗體(上海微蒙生物科技有限公司)；抗ILK單克隆抗體和抗鼠尾 I/III型膠原(collagen type I/III, Col I/III)抗體(Santa Cruz)；DAB顯色試劑盒、SP和SABC試劑盒(江蘇綠葉生物科技有限公司)；多聚甲醛、EDTA和TRIzol Reagent(上海哈靈生物科技有限公司);羊抗兔TGF-β1和兔抗人ILK單克隆抗體(Sigma)；抗α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)抗體(PolyPlus-Transfection);磺胺嘧啶銀(silver sulfadiazine，SS)乳膏(1%：25 g，國藥準字H20057720，昆明華潤圣火藥業(yè)有限公司)。相關引物由武漢巴菲爾生物技術有限公司合成，序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

F: forward; R: reverse; FN: fibronectin.

2 方法

2.1動物分組、模型建立及創(chuàng)面愈合率(healing rate，HR)計算 SPF級6周齡SD雌性大鼠180只(180～200 g)，購于三峽大學實驗動物中心(No.42010200000304)。所有動物處理嚴格按照國家衛(wèi)生實驗動物護理和使用指南，在學院實驗動物管理委員會監(jiān)督下進行。標準實驗室條件下自由飲食適應1周[溫度(24±3)℃，濕度(50±5)%]后，隨機選取30只作為正常對照(normal control，NC)組，其余150只作為實驗組，禁食12 h后，用水合氯醛麻醉(10%，3 mL/kg，i.p.)，以腰背部為中心，逐一進行剪毛(3 cm×3 cm)、脫毛(8% Na2S)、沖洗(溫水)、消毒(75%乙醇)、燙傷(探頭2.5 cm×2.5 cm，壓力500 g，時間20 s)，形成 II° 燙傷模型[1-2]，之后隨機將模型動物再分成陰性對照(凡士林，vaseline，VL)組、陽性對照(磺胺嘧啶銀，SS)組以及CSME低、中和高劑量(low-dose CSME、 middle-dose CSME和high-dose CSME, CSME-L、 CSME-M和CSME-H)組，每組30只[1]。術后創(chuàng)面分別涂擦凡士林、磺胺嘧啶銀和3種劑量的CSME燒傷軟膏，腹腔注射乳酸林格氏液5 mL抗休克3 d。每天換藥1次(各軟膏涂擦量為2.0 g)直至創(chuàng)面愈合[2]。在3 d、7 d、14 d和21 d記錄創(chuàng)面情況，透明膜描記法計算HR，數據用Image-Pro Plus結合Excel 2000處理，其計算公式為：HR(%)=(PA-NHA)/PA×100%[1][PA(primordial area)：原始創(chuàng)面面積;NHA(non-healing area)：未愈創(chuàng)面面積]。創(chuàng)面完全愈合的標準為：創(chuàng)面完全被上皮覆蓋，無殘余缺損，創(chuàng)面色均一而光滑[2]。

2.2皮膚標本采集與處理 各組于第7、14和21天分別隨機選取10只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛麻醉(3 mL/kg)，切取背部創(chuàng)面全層皮膚分成兩部分(NC組切取相應部位皮膚)，一部分置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，另一部分?0%的甲醛溶液固定，備用于HE染色和免疫組織化學染色。

2.3HE染色與免疫組織化學染色分析 HE染色: 先以多聚甲醛固定2 h，梯度乙醇脫水，石蠟包埋切片(厚5 μm)行HE染色，并在鏡下觀察[3-4]。免疫組織化學染色：石蠟包埋切片，常規(guī)脫蠟水化，3% H2O2孵育10 min(25 ℃)，加入0.01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液(sodium citrate buffer，SCB)后，用微波(80 ℃，15 min)進行抗原修復，加入非免疫血清孵育20 min(25 ℃)，再加入兔抗鼠ILK單克隆抗體(1∶100)100 μL(陰性對照以SPB為 I 抗)；于冰箱保存24 h(4 ℃)后，按1∶100加入100 μL山羊抗兔IgG(生物素標記)水浴鍋37 ℃孵育10 min，加鏈霉抗生物素-過氧化物酶孵育10 min(37℃)，經過5～10 min的DAB顯色，再以蘇木素進行復染后，經脫水、透明、封片等一系列處理，完成SP法免疫組織化學染色。

2.4Western blot檢測相關蛋白表達 分別取各組全層創(chuàng)面皮膚組織(去痂)，于4 ℃ 生理鹽水漂洗3次，濾紙拭干，稱取500 mg于冰浴中剪碎，置入勻漿器，按每1 mg 組織加1 mL蛋白提取液勻漿200次(4 ℃)，轉入離心管低溫離心10 min(4 ℃，3 000 r/min)，取上清置于液氮中保存?zhèn)溆谩Ｒ訵estern blot法檢測相關蛋白表達。

2.5RT-qPCR檢測相關mRNA的表達 將標本勻漿，置入EP管(1.5 mL)，滴入TRIzol液1 mL吹打后再滴入0.2 mL氯仿振蕩15 s，25 ℃孵育3 min后離心(4 ℃，15 min，12 000 r/min)，取上清置入新EP管，滴入異丙醇(與上清等體積)，孵育10 min后離心，棄上清。以75% DEPC乙醇洗滌沉淀，離心5 min棄上清干燥(25 ℃)，以DEPC處理總RNA。RT-PCR總反應體積為20 μL，PCR儀中反應1 h(37 ℃)后RT反應3 min(95 ℃)。其體系構成為：DEPC 10.1 μL，dNTPs 0.5 μL(10 mmol/L)，MMLV 1 μL(2×108U/L)，RNA模板4 μL，下游引物0.4 μL，5×RT buffer 4 μL(pH 8.0，50 mmol/L KCl和Tris-HCl，10 mmol/L DTT，4 mmol/L MgCl2)。熒光定量PCR總反應體積為50 μL，熒光定量PCR儀中93 ℃反應3 min后，分別在溫度93 ℃、55 ℃、72 ℃條件下反應30 s、45 s和45 s， 進行40個循環(huán)。其體系構成為：cDNA 5 μL，Taq酶1 μL(3×106U/L)，dNTPs 1 μL(10 mmol/L)，ddH2O 31 μL，上游引物1 μL(10 pmol/L)，下游引物1 μL(10 pmol/L)，5×SYBR Green I buffer 10 μL(pH 8.0， 50 mmol/L KCl，10 mmol/L Tris-HCl，2 mmol/L MgCl2)。

2.6成纖維細胞(fibroblasts, FB)膠原收縮率(shrinkage，SK)的測定 按文獻[4-5]，選擇NC組腰背部正常皮膚標本，去表皮，切成小塊組織(1 mm×1 mm×1 mm)，將其接種于培養(yǎng)瓶底部培養(yǎng)1 周，當大量成纖維細胞(鏡下為梭形)游離出并完全覆蓋瓶底時，用胰酶(0.5%)和EDTA(0.04%)消化傳代。取4～6代原代細胞接種(每孔2×104)24 h后，將其分為5組，分別于冰上加2 mL混懸液于35 mm的6孔培養(yǎng)板，恒溫箱孵育10 min(37 ℃)形成凝膠狀，再加DMEM培養(yǎng)液，以細針頭輕柔吹打使之懸浮后，培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h(5% CO2，37 ℃)后分成6組，分別加入含NS及上述濃度VL、SS和CSME的DMEM培養(yǎng)液，分別于24 h、48 h、72 h和96 h以多聚甲醛(4%)固定冰箱保存?zhèn)溆?-20 ℃)，在坐標紙上攝片，測定起始面積(initial area，IA)和最終面積(final area，FA)，以Image-Pro Plus軟件分析。計算公式為：SK(%)=(IA-FA)/IA×100%

3 統(tǒng)計學處理

數據處理使用SPSS 12.0軟件。全部數據以均數±標準差(mean±SD)表示，多組間均數比較，先分析方差齊性，再進行方差分析，各組均數間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 創(chuàng)面愈合情況

第1～3天，除了第3天時少數CSME組創(chuàng)面中央顏色明顯暗紅外，其它情況(包括HR值)的差異均無統(tǒng)計學顯著性(P>0.05)。第7天時，VL組創(chuàng)面滲出明顯，結痂為暗紅色，而SS和CSME各組的創(chuàng)面干燥，幾乎無滲出液，結痂為褐色，且CSME組中部分創(chuàng)緣呈現脫痂趨勢，各組之間HR值仍無明顯差異(P>0.05)。第14天時，所有動物創(chuàng)面均已干燥，創(chuàng)面面積明顯縮小，結痂為褐色或黑色，其中VL組的創(chuàng)面滲液明顯，無明顯脫痂趨勢，新生上皮活躍性差，新生被毛未見；SS組的創(chuàng)面滲液少許，創(chuàng)緣脫痂明顯，新生上皮活躍，新生被毛少見，HR值顯著高于VL組(P<0.05)；CSME各組創(chuàng)面滲液罕見，創(chuàng)緣脫痂明顯，新生上皮高度活躍，新生被毛多見，HR值顯著高于SS組(P<0.05)，且呈劑量依賴趨勢。至第21天時，VL組的創(chuàng)面大部分被新生上皮覆蓋，被毛生長多見，但創(chuàng)面中央黑色結痂仍未完全脫落[未愈合面積為(0.45±0.02)cm]；SS組與CSME各組創(chuàng)面的HR較VL組顯著升高(P<0.05)，其中，SS組的創(chuàng)面可見稀疏、細小而無光澤的新生被毛，而CSME各組創(chuàng)面的被毛密集，幾乎全部被被毛覆蓋，皮膚趨于正常，且呈劑量依賴性。見圖1。

Figure 1. The effects of CSME on wound healing of burn wounds in the rats with different treatments. A: the images of the healing of burn wounds in the rats; B: the quantitative analysis of the burn wounds in rats expressed as the changes of HR. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsVL group;△P<0.05vsSS group;#P<0.05vsCSME-L group;▲P<0.05vsCSME-M group.

圖1 CSME對大鼠燒傷創(chuàng)面愈合的影響

2 創(chuàng)面組織學觀察結果

整個實驗過程中，各組創(chuàng)面均未見明顯感染征象，所有動物均順利完成觀察。

第7天，VL組與SS組的創(chuàng)面壞死組織出現脫離趨勢，組織細胞大量變性壞死，細胞漿廣泛濃縮甚至消失，細胞核大量固縮；中央表皮細胞未見，無明顯組織生長；真皮層明顯充血水腫，纖維中炎癥細胞大量廣泛浸潤；膠原纖維腫脹明顯，原纖維結構基本消失，大多數出現融合。CSME各組創(chuàng)面壞死組織呈劑量依賴性出現明顯脫落、部分脫落和大部分脫離，且細胞變化、炎癥變化以及膠原纖維變化也呈劑量依賴性優(yōu)于SS組和VL組。

第14天，VL組的創(chuàng)緣壞死組織小范圍溶脫，創(chuàng)緣表皮細胞零散覆蓋，少量肉芽組織露出，可見上皮組織生長，多個皮島形成；輕度真皮層充血水腫，纖維中炎癥細胞浸潤少許；部分膠原纖維腫脹，少數出現融合，原纖維結構基本完整；組織細胞仍有部分變性壞死，部分細胞漿濃縮，少數細胞核固縮。SS組的創(chuàng)緣壞死組織部分溶脫，創(chuàng)緣表皮細胞成片覆蓋，部分肉芽組織露出，上皮組織生長旺盛，皮島形成多(與VL組相當)；真皮層充血水腫不明顯，少見纖維中炎癥細胞浸潤；少數膠原纖維腫脹和融合，原纖維結構基本完整；少許組織細胞變性壞死，少數細胞漿濃縮，少見細胞核固縮。CSME各組皮島呈劑量依賴性大量形成，甚至連接成片完全覆蓋，其它細胞變化、炎癥變化以及膠原纖維變化也呈劑量依賴性優(yōu)于SS組和VL組。

第21天，VL組多數創(chuàng)面趨于愈合，但創(chuàng)面中央組織結構完整度差，上皮細胞分化不滿意，仍有較多炎癥細胞浸潤。SS組多數創(chuàng)面完全愈合，中央區(qū)域單層上皮細胞覆蓋良好，可見不規(guī)則排列的膠原纖維，組織結構部分完整，可見少數新生皮脂腺和毛囊。CSME各組呈劑量依賴性創(chuàng)面多層上皮細胞覆蓋，新生膠原纖維分化度增強，排列整齊，基本具備正常皮膚組織結構，皮脂腺和毛囊增生高度活躍，呈劑量依賴性優(yōu)于SS組和VL組，見圖2。

Figure 2. The effects of CSME on pathological change of burn wounds in the rats (HE staining, ×200). The arrows refer to fiber swelling and cell changes in the figure.

圖2 CSME對大鼠燒傷創(chuàng)面病理變化的影響

3 CSME對創(chuàng)面組織中ILK和ITG-β1蛋白表達的影響

VL組與SS組的創(chuàng)面組織中ILK和ITG-β1蛋白表達水平的差異沒有統(tǒng)計學顯著性(P>0.05)，在第7、14和21天愈合過程中，隨時間的推移，創(chuàng)面組織中的ILK和ITG-β1表達均顯著強于正常皮膚(P<0.05)；CSME各組在第7天呈現劑量依賴性強于VL組和SS組(P<0.05)，第7天達最高峰，第14天與VL組和SS組相當，開始呈劑量依賴性下降(P>0.05)，而在第21天顯著弱于VL組和SS組(P<0.05)，與NC組相當，見圖3。免疫組化結果也顯示，第21天時，創(chuàng)面組織中的ILK在新生表皮細胞、毛囊周圍以及部分FB胞漿中陽性染色為黃色，NC組的染色不明顯，VL組與SS組相當，明顯強于CSME各組，CSME各組呈劑量依賴性減弱趨勢，見圖4。

Figure 3. The results of Western blot for determining the effects of CSME on the protein expression of ILK and ITG-β1in the burn wound tissues of the rats. Mean±SD.n=3.△P<0.05vsVL and SS group;#P<0.05vsCSME-L group;▲P<0.05vsCSME-M group;*P<0.05vsNC group.

圖3 Western blot 檢測CSME對大鼠燒傷創(chuàng)面組織中ILK和 ITG-β1蛋白表達的影響

Figure 4. The images of histoimmunochemical staining for observing the effects of CSME on the protein expression of ILK in the burn wound tissues of the rats at 21st day (light yellow， ×200).

圖4 免疫組織化學染色分析CSME對創(chuàng)面組織中ILK表達的影響

4 CSME對創(chuàng)面組織中相關分子 mRNA表達的影響

RT-qPCR結果顯示，VL組與SS組創(chuàng)面組織中ILK、ITG-β1、FN和TGF-β1mRNA的表達隨時間的推移而持續(xù)增加，2組之間的差異無統(tǒng)計學顯著性(P>0.05)；第7天，CSME各組創(chuàng)面組織中ILK、ITG-β1、FN和TGF-β1的mRNA表達呈劑量依賴性明顯高于VL組和SS組，而第21天卻低于VL組和SS組(P<0.05),見圖5。

5 CSME對成纖維細胞膠原SK的影響

NC組未發(fā)現FB膠原凝膠收縮。隨時間的推移，VL組和SS組的收縮率逐漸升高，其中在24 h、48 h和72 h，SS組與CSME-L組相當(P>0.05)，均顯著高于VL組(P<0.05)；在24 h和48 h，CSME-M組SK顯著高于SS組和CSME-L組，而低于CSME-H組(P<0.05)；在96 h，CSME各組呈劑量依賴性低于VL組和SS組(P<0.05)，表明CSME早期促進創(chuàng)面收縮，后期抑制創(chuàng)面收縮，其機制與調控FB膠原凝膠收縮有關，見表2。

Figure 5. The effects of CSME on the mRNA expression of ILK, ITG-β1, FN and TGF-β1in the burn wound tissues of the rats at 21st day. Mean±SD.n=10.△P<0.05vsVL and SS group;#P<0.05vsCSME-L group;▲P<0.05vsCSME-M group;*P<0.05vsNC group.

圖5 CSME對創(chuàng)面組織中ILK、ITG-β1、FN和TGF-β1mRNA表達的影響

表2 CSME對大鼠皮膚組織成纖維細胞膠原SK的影響

*P<0.05vsNC group;△P<0.05vsVL group;#P<0.05vsSS group and CSME-L group;▲P<0.05vsCSME-M group.

6 CSME對創(chuàng)面組織中α-SMA蛋白表達的影響

正常皮膚各組間α-SMA蛋白表達差異無統(tǒng)計學顯著性(P>0.05)；隨時間的推移，VL組和SS組α-SMA蛋白表達逐漸增強，第7天以后，SS組顯著低于VL組(P<0.05)；第7天，CSME-M組和CSME-H組呈劑量依賴性強于VL組和SS組，而第14天和21天呈劑量依賴性弱于VL組和SS組(P<0.05),表明CSME早期促進創(chuàng)面α-SMA蛋白表達，后期抑制其表達，見圖6。

7 CSME對Col I和Col III蛋白與mRNA表達的影響

對于Col I蛋白與mRNA表達來說，各個時點VL組和SS組的差異無統(tǒng)計學顯著性(P>0.05)，并隨時間的推移而持續(xù)升高；第14天，CSME各組呈劑量依賴性高于VL組和SS組，而21 d則低于VL組和SS組(P<0.05)。對于Col III蛋白與mRNA表達來說，其結果恰與上述相反。這表明CSME早期呈劑量依賴性促進創(chuàng)面Col I蛋白與mRNA表達，抑制Col III 蛋白與mRNA表達，后期則相反，見圖7。

Figure 6. The results of Western blot for determining the effects of CSME on the protein expression of α-SMA in the burn wound tissues of the rats at 21st day. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsNC group;△P<0.05vsVL group;#P<0.05vsCSME-L group;▲P<0.05vsCSME-M.

圖6 Western blot 檢測CSME對創(chuàng)面組織中α-SMA蛋白表達的影響

討 論

創(chuàng)面修復是表皮再生與真皮重構的過程,首先在殘留基底層、汗腺與毛囊等處，表皮干細胞(epidermal stem cell，ESC)增生、分化成表皮細胞(epidermal cell，EC)而完成表皮再生;隨后FB大量增生并分泌膠原形成ECM而完成真皮重構。ITG是一類介導細胞黏附、ECM和創(chuàng)面細胞信號傳遞而調控細胞遷移、分化、增生及凋亡的細胞表面分子，可通過FB調節(jié)膠原網架收縮介導創(chuàng)面收縮而促進創(chuàng)面愈合[6]。若深Ⅱ°燒傷創(chuàng)面未殘有真皮、毛囊、汗腺和皮脂腺等附件，創(chuàng)面不能增殖成上皮島，則創(chuàng)面修復慢，瘢痕多，甚至攣縮為畸形[7]。

ITG-β1的高表達能促進ESC增生，并保持ESC的特性，ITG-β1低表達時ESC分化成角質形成細胞(keratinocytes，IKC)的速度加快[8]。有報道顯示，創(chuàng)面愈合中ILK與ITG-β1高度表達[9]，說明ILK是調控ITG-β1信號通路的關鍵激酶，與燒傷創(chuàng)面的早期愈合和后期瘢痕形成有關聯(lián)。ILK還可被細胞生長因子(growth factor，GF)受體胞內信號通路的胞內結構激活，一方面，激活PKB/Akt通路而抑制細胞凋亡和加快細胞增生；另一方面，抑制GSK-3β磷酸化，使β-catenin降解減少而進入細胞核激活轉錄因子Tcf/Lef，促進ECM轉錄而加快組織器官的纖維化[10-11]。研究證實，TGF-β1信號通路與ITG-β1存在互通現象，調控著創(chuàng)面愈合后期癱痕的形成[12-13],這種互通可能是ITG-β1信號通路的關鍵激酶ILK通過其N-端重復序列與PINCH的LIM結構域結合來實現的[8, 13]。本研究顯示，第7和14天，CSME各組相關mRNA表達呈劑量依賴性高表達，而第21天呈劑量依賴性低表達。表明創(chuàng)面愈合早期與ILK、ITG-β1和TGF-β1高表達相關，這些高表達介導相關細胞黏附、ECM和創(chuàng)面細胞信號傳遞，促進ESC增生和皮膚組織纖維化，加快創(chuàng)面愈合；而在后期修復中，ILK、ITG-β1和TGF-β1呈現低表達，有利于ESC分化成IKC，限制瘢痕的過度增生，提示CSME促進大鼠燒傷創(chuàng)面早期愈合和抑制創(chuàng)面后期瘢痕過度增生的機制與干預ILK調控的ITG-β1和互通的TGF-β1信號通路相關。

適度的創(chuàng)面收縮能有效減少創(chuàng)面面積，縮短愈合時間；而過度的創(chuàng)面收縮會導致瘢痕攣縮和牽拉，影響皮膚外觀和器官功能?！跋嗫颉崩碚撜J為，創(chuàng)緣細胞向中央遷移，通過ECM帶動創(chuàng)面縮??；“牽拉”理論認為，創(chuàng)面中間細胞收縮牽拉ECM而收縮[9,13]，兩假說的共同點是FB與ECM的相互作用。研究發(fā)現，創(chuàng)面肉芽組織中存在可特異性表達α-SMA的肌成纖維細胞(myofibroblast，mFB)，具有平滑肌和FB雙重特征，是創(chuàng)面收縮的主要動力[7，13]。作為ITG-β1信號通路的關鍵激酶ILK，其催化結構域C-端作用于并調節(jié)細胞骨架蛋白α/β-parvin的組裝與收縮[2-3]。同時，還通過啟動信號通路PI3K/AKT激活ILK而調節(jié)細胞的增殖、分化、遷移與收縮[8,11]。創(chuàng)面修復的早期，ILK隨PI3K/AKT的啟動而活化。本研究證實，第7天后，VL組和SS組的α-SMA蛋白表達呈時間依賴性增強，第7天，CSME呈劑量依賴性強于VL組和SS組，而第14和21天呈劑量依賴性弱于VL組和SS組(P<0.05),與組織學觀察的肉芽組織成熟度強于VL組和SS組一致。表明CSME早期促進創(chuàng)面α-SMA蛋白表達，加速創(chuàng)面愈合，后期抑制其表達，防止創(chuàng)面過度收縮，減輕瘢痕形成和攣縮畸形，提示CSME是通過調控ILK活性而影響含成纖維細胞的膠原網架(fibroblast-populated collagen lattice, FPCL)收縮的，表明CSME中存在抑制PI3K/AKT通路的某種小分子物質，在創(chuàng)面修復后期特異性抑制此通路而干預ILK互通信號的傳導。

Figure 7. Effects of CSME on the protein and mRNA exprission of Col I and Col III in the burn wound tissues of the rats at 21st day. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsNC group;△P<0.05vsVL and SS group;#P<0.05vsCSME-L group;▲P<0.05vsCSME-M group.

圖7 CSME對創(chuàng)面組織中Col I和Col III蛋白與mRNA表達的影響

真皮的主要成分是ECM，其抗牽拉和維持彈性的細胞支架是Col I和Col III,粗大的Col I為創(chuàng)面瘢痕組織的物質基礎，細小的Col Ⅲ位于真皮深層[6, 9]。在無瘢痕愈合組織中Col I很少，而Col Ⅲ含量很高[9. 11]，說明其含量比與瘢痕程度相關。ECM通過ITG-β1通路調節(jié)細胞增殖、分化、遷移、凋亡及細胞骨架蛋白的組裝。創(chuàng)面愈合的早期需要大量ECM的沉積，若后期ECM的過多沉積可致癱痕過度增生。ECM可通過FN激動ITG-β1受體而激活其信號通路，提高細胞對GF的反應性，并增強GF的表達，TGF-β1等反過來又加快ECM的表達[2]。GSK-3β可被ILK抑制而阻止β-catenin的降解，使之進入細胞核增多，激活Tcf/Lef而調控FN合成，促進Col I和Col III的表達，提示Col I蛋白與mRNA表達隨時間的推移而持續(xù)升高；第14天，CSME各組呈劑量依賴性高于VL組和SS組，而21 d則低于VL組和SS組(P<0.05)，而Col III蛋白與mRNA表達結果恰與上述相反，說明CSME早期呈劑量依賴性促進創(chuàng)面Col I 蛋白與mRNA表達，抑制Col III 蛋白與mRNA表達，后期則相反，表明CSME在增強創(chuàng)面愈合早期Col I表達而促進創(chuàng)面愈合，后期促進Col III表達而抑制瘢痕形成中具有重要作用。提示CSME在促進燒傷創(chuàng)面愈合的同時，通過ColⅠ與Col III表達比的調控而減輕瘢痕過度增生。

總之，大鼠燒傷創(chuàng)面愈合率和組織學觀察均顯示，CSME能促進燒傷創(chuàng)面愈合的同時，抑制創(chuàng)面瘢痕的過度增生。由于燒傷創(chuàng)面的早期愈合和后期瘢痕的過度增生與ITG-β1信號通路密切相關，提示CSME促進大鼠燒傷創(chuàng)面早期愈合和抑制創(chuàng)面后期瘢痕過度增生的機制與干預ILK調控的ITG-β1與TGF-β1信號通路、影響PI3K/AKT調節(jié)的ILK互通信號傳導及ColⅠ與Col III表達比的調控相關,我們認為，其機制可能與其多成分多靶點效應分別影響ILK調控的ITG-β1和TGF-β1信號通路、PI3K/AKT調控的ILK信號通路及ColⅠ與Col III表達比相關。由于創(chuàng)面早期愈合和后期瘢痕過度增生的機制很復雜，且目前的相關學說與理論較多，沒有基本一致的定論。因此，要研究CSME早期促進燒傷創(chuàng)面愈合和后期抑制創(chuàng)面瘢痕過度增生的機制，我們認為進一步探究創(chuàng)面早期愈合和后期瘢痕過度增生的機制將是未來的重要研究方向。