張慧珊， 盧賀敏， 黃亞娟， 葉樂平, 2△

(1溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院, 育英兒童醫(yī)院兒童呼吸科， 浙江 溫州 325027； 2北京大學第一醫(yī)院兒科， 北京 100034)

全氟烷基化合物(perfluoroalkylated substances，PFASs)因其優(yōu)良的熱穩(wěn)定性、化學穩(wěn)定性、高表面活性及疏水疏油性能，被廣泛地應用于工業(yè)生產(chǎn)和日常生活，尤其是其代表性化合物全氟辛烷磺酸(perfluorooctane sulfonate，PFOS)更是被大量地應用在紡織品、紙、涂料和消防泡沫等產(chǎn)品中。美國健康和營養(yǎng)檢查調(diào)查(National Health and Nutrition Examination Surveys，NHANES)測量了美國普通人群血清中的PFOS濃度，結(jié)果顯示截至2013～2014年，美國普通人群血清PFOS濃度的中位數(shù)和95百分位數(shù)分別為5.2 μg/L和18.5 μg/L[1]。PFOS在人體內(nèi)的半衰期約為4.8年[2]，雖然其在血清中的含量逐年下降，但其蓄積的毒性作用依然不可小覷。PFOS有多方面的毒性效應，包括生殖毒性、神經(jīng)毒性、免疫毒性、心血管毒性與致癌性等。研究發(fā)現(xiàn)，大鼠孕期暴露于PFOS會影響胎鼠肺發(fā)育[3]，且其同源化合物全氟辛酸(perfluorooctanoic acid，PFOA)與支氣管哮喘密切相關[4]。最近一項研究提取了胎盤和母體血清樣本進行檢測，發(fā)現(xiàn)在妊娠前3個月胎兒肺組織中PFASs含量最高[5]。因此，PFASs在體內(nèi)積累對呼吸系統(tǒng)的毒性作用不可輕視。

含NLR家族Pyrin域蛋白3(NLR family Pyrin domain-containing protein 3，NLRP3)、含CARD凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC)和caspase-1組成的高分子量蛋白質(zhì)復合物NLRP3炎癥小體，能識別微生物的保守序列，進而啟動炎癥反應參與機體免疫應答，是自身免疫的重要組成部分。當機體受到內(nèi)源性或者外源性刺激時，NLRP3被激活并組裝成為炎癥小體，繼而活化的caspase-1促進白細胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)和IL-18的成熟并釋放，引起機體炎癥反應[6]。本研究通過檢測大鼠肺組織中NLRP3炎癥小體相關蛋白的表達情況以及支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中IL-1β和IL-18的含量，探討PFOS暴露誘導幼年期大鼠肺損傷的可能機制，為PFOS暴露所致的肺部疾病提供新的治療靶點。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

PFOS及格列本脲(glyburide, G)均購自Sigma；蘇木素-伊紅染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；IL-1β和IL-18 ELISA試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司；抗β-actin抗體和抗NLRP3抗體購自Abcam；抗caspase-1抗體和抗ASC抗體購自Santa Cruz；其余試劑均為市售分析純。

2 方法

2.1動物選擇及分組 28只SD大鼠購自上海斯萊克動物實驗有限公司，動物合格證號為SCXK(滬)2017-0005。適應性飼養(yǎng)5天后隨機分為4組，每組7只：對照(control，C)組、PFOS(P)組、格列本脲(G)組和格列本脲+PFOS(GP)組。各組均采用灌胃的方式給藥，對照組使用PBS代替，GP組格列本脲(50 mg·kg-1·d-1)灌胃1 h后再給予PFOS(5 mg·kg-1·d-1)暴露，連續(xù)處理7 d。本實驗中PFOS濃度及格列本脲濃度參考已發(fā)表文獻中的大鼠模型[3, 7]。本實驗通過本校動物倫理委員會批準。

2.2標本采集及保存 大鼠腹腔注射0.5%戊巴比妥鈉(8 mg/kg)麻醉，隨后仰臥位固定于鼠臺上，消毒后打開胸腔，結(jié)扎右主支氣管，經(jīng)氣管插管注入200 μL PBS灌洗左肺3次，回收BALF，重復3次。將灌洗液離心(4 ℃，3 000 r/min)10 min，取上清液-80 ℃保存。BALF收集完成后，用注射器從心尖取血，全血離心(4 ℃，3 000 r/min)10 min，取上清液-80 ℃保存。取右肺中葉PBS漂洗后，于4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋切片后進行HE染色和免疫組織化學染色。剩余肺組織于液氮速凍，-80 ℃保存。

2.3ELISA法檢測BALF中IL-1β和IL-18的含量以及肺組織中髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)的含量 將收集的大鼠BALF和肺組織勻漿，嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作，最后在450 nm處檢測IL-1β、IL-18和MPO的吸光度(A)值。

2.4Western blot法檢測肺組織中炎癥小體相關蛋白表達量 在肺組織中加入600 μL組織裂解液，超聲勻漿后用常規(guī)方法提取總蛋白。BCA法檢測總蛋白濃度，配制蛋白體系，100 ℃加熱10 min，-20 ℃保存。取20 μL蛋白樣品經(jīng)10% SDS-PAGE分離，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，脫脂牛奶封閉，TBST洗滌后，I 抗(抗NLRP3抗體1∶300；抗caspase-1抗體1∶1 000；抗ASC抗體1∶250；抗β-actin抗體1∶1 000)4 ℃孵育過夜。TBST清洗，II 抗(1∶2 000)室溫孵育2 h，TBST再次清洗，將含有蛋白的PVDF膜滴上現(xiàn)配的ECL發(fā)光液進行曝光，保存圖像并分析數(shù)據(jù)。

2.5免疫組織化學染色檢測NLRP3蛋白的表達 將肺組織切片經(jīng)二甲苯、梯度乙醇脫蠟處理，隨后PBS清洗，3%雙氧水室溫孵育10 min，再次PBS清洗，置于檸檬酸鹽溶液(pH 6.0)中進行高溫熱修復抗原。10%山羊血清室溫封閉30 min，封閉非特異性抗原，滴加NLRP3抗體(1∶200)4 ℃孵育過夜。PBS洗滌后 II 抗室溫孵育20 min，再次PBS清洗。滴加現(xiàn)配的DAB顯色液顯色約1 min，自來水下沖洗終止顯色，蘇木素復染30 s。依次經(jīng)乙醇、二甲苯脫水，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

3 統(tǒng)計學處理

采用GraphPad Prism 5.0及SPSS 18.0軟件進行處理。各組計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示，各組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，方差齊性者兩兩比較采用SNK-q檢驗，方差不齊者采用Dunnett’s T3檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 大鼠行為學表現(xiàn)及體重變化

給予PFOS及格列本脲灌胃后，各組大鼠行為學表現(xiàn)與對照組相比差異無統(tǒng)計學顯著性。G組大鼠體重變化較其它3組均稍有增高，但差異無統(tǒng)計學顯著性，見表1。

2 PFOS在大鼠體內(nèi)積聚

高效液相色譜法檢測結(jié)果顯示，P組與GP組的大鼠血清PFOS濃度顯著高于C組(P<0.01)，見表1。

表1 PFOS灌胃前后大鼠體重的變化情況和血清中PFOS的濃度的改變

Table 1. Changes of body weight before and after perfusion of PFOS and serum concentration of PFOS (mg/L) in each group (Mean±SEM.n=7)

GroupWeight on day 21 (g)Weight on day 28 (g)Change of weight (g)Serum PFOS (mg/L) C 30.21±1.3470.29±1.6140.08±1.180.03±0.01 P32.60±1.4972.24±2.8439.64±1.4444.60±1.61** G33.92±1.7974.89±2.5640.97±1.22 0.06±0.01 GP32.09±1.9772.43±2.4840.34±0.6340.11±1.94**

**P<0.01vsC group.

3 PFOS暴露導致大鼠肺部炎癥

HE染色結(jié)果顯示，P組氣道管腔狹窄，管腔內(nèi)可見乳頭樣增生,見圖1中P組黃色箭頭指示部位，提示有哮喘樣改變；氣管和血管周圍炎癥浸潤明顯，管壁平滑肌增生；肺泡間隔明顯增厚,見圖1中P組黑色箭頭指示部位，炎癥細胞明顯增多，以巨噬細胞和單核細胞為主；部分肺泡中可見黏液滲出，見圖1中P組紅色箭頭指示部位。C和G組氣管結(jié)構完整，血管和氣管周圍未見明顯炎癥浸潤，肺泡結(jié)構正常，肺泡間隔未見增厚和明顯炎癥細胞浸潤，肺泡中未見滲出。GP組氣管和血管周圍炎癥浸潤較P組明顯減少，但管腔內(nèi)仍有乳頭樣增生，與C組相比，GP組肺泡間隔部分輕度增厚，但程度較P組減輕，見圖1。

肺組織勻漿檢測MPO結(jié)果顯示，P組MPO較其余3組均顯著升高(P<0.05)，其中較G組升高最為顯著(P<0.01)，而C組、G組及GP組間MPO含量的差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖2。

4 PFOS暴露升高大鼠BALF中IL-1β和IL-18含量

ELISA結(jié)果顯示，與C組相比，P組的BALF中IL-1β和IL-18含量升高(P<0.05)；加用格列本脲后，GP組IL-1β和IL-18含量均較P組顯著降低(P<0.05)；C組、G組及GP組間IL-1β和IL-18含量差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖3。

5 PFOS暴露通過激活NLRP3炎癥小體誘導大鼠肺損傷

Western blot結(jié)果顯示，P組的NLRP3、caspase-1和ASC蛋白表達水平較C組均顯著升高(P<0.01)，而GP組各蛋白表達較P組有所降低(P<0.05)；C組、G組及GP組間NLRP3炎癥小體相關蛋白表達水平的差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖4。

Figure 1. Pathological changes of lung tissues in rats of each group (HE staining). Yellow arrow represents the papillary hyperplasia. Black arrow represents the thichened alveolar septum. Red arrow indicates mucus exudation in the alveoli.

圖1 各組大鼠肺組織病理改變

Figure 2. The content of MPO in the lung tissues of rats in each group. Mean±SEM.n=7.*P<0.05,**P<0.01vsP group.

圖2 各組大鼠肺組織中MPO的含量

6 PFOS暴露后肺組織中NLRP3蛋白的表達

免疫組化結(jié)果顯示，NLRP3蛋白主要表達于巨噬細胞和中性粒細胞，肺泡上皮細胞和血管內(nèi)皮細胞中也有表達。P組的NLRP3蛋白表達明顯高于其余3組(P<0.01)，C組、G組及GP組間NLRP3蛋白水平的差異均無統(tǒng)計學顯著性，見圖5。

討 論

PFOS通過與血漿蛋白結(jié)合在肝、腎和肺組織中積累，從而對生物造成毒性作用，現(xiàn)已被列入《斯德哥爾摩公約》附件B(生產(chǎn)和使用受限的化合物)中[8]。有研究人員對上海地區(qū)霧霾期間的霧狀氣溶膠進行檢測，發(fā)現(xiàn)所有的PFASs顆粒尺寸分布均有雙峰，分別在細粒尺寸范圍(0.4～2.1 μm)和粗粒尺寸范圍(>2.1 μm)達到峰值。隨后，研究人員進一步對PFOS進行了人體風險評估，發(fā)現(xiàn)細粒組分的風險約為粗粒組分的2倍，而肺泡區(qū)約30.3%～82.0%的顆粒物沉積與直徑小于2.1 μm的顆粒物有關，表明細顆粒是肺泡區(qū)肺功能衰竭的重要原因[9]。一項前瞻性隊列研究發(fā)現(xiàn)，出生后前10年呼吸道感染率增加與出生前暴露于PFASs有關，提示PFASs具有免疫抑制作用[10]。Qin等[11]通過一項橫斷面病例對照研究發(fā)現(xiàn)，PFASs在體內(nèi)蓄積與哮喘兒童肺功能下降有關。本研究中各組大鼠血清PFOS濃度比較的結(jié)果顯示，未直接接觸大劑量PFOS的大鼠(C組和G組大鼠)也有少量PFOS蓄積，可能通過空氣接觸積聚；而直接接觸PFOS的大鼠(P組和GP組大鼠)血清中PFOS濃度顯著高于C組與G組。由于PFOS有較長的半衰期，接觸越多，時間越久，其在體內(nèi)的積聚越多。肺組織HE染色結(jié)果顯示，PFOS暴露后氣道周圍及肺間質(zhì)炎癥浸潤明顯、肺泡間黏液滲出增加，該結(jié)果提示PFOS暴露引起大鼠肺組織炎癥損傷。由此可見，PFOS對呼吸系統(tǒng)的危害不可小覷，但其引起肺損傷的具體機制目前尚未明確。

Figure 3. The contents of IL-1β and IL-18 in the bronchoalveolar lavage fluid (BALF) of rats in each group. Mean±SEM.n=7.*P<0.05,**P<0.01vsP group.

圖3 各組大鼠支氣管肺泡灌洗液中IL-1β和IL-18的含量

Figure 4. The protein expression of NLRP3, caspase-1 and ASC in the lung tissues of rats in each group. Mean±SEM.n=7.*P<0.05,**P<0.01vsP group.

圖4 各組大鼠肺組織中NLRP3、caspase-1和ASC的蛋白表達量

近年來發(fā)現(xiàn)NLRP3炎癥小體參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展。NLRP3主要表達于巨噬細胞和中性粒細胞等多種免疫細胞，各類晶體物質(zhì)、病原體相關分子模式和損傷相關分子模式、細菌及病毒等均能通過不同途徑激活NLRP3炎癥小體，引發(fā)機體免疫應答。眾所周知，肺暴露于吸入顆粒物會引起炎癥和纖維化反應，并可能發(fā)展為慢性纖維化，而上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化在此過程中起重要作用。Tian等[12]發(fā)現(xiàn)NLRP3炎癥小體可在肺泡上皮細胞中被激活，并通過轉(zhuǎn)化生長因子β1調(diào)節(jié)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，進而導致肺纖維化，提示NLRP3炎癥小體與肺纖維化密切相關。Spengler等[13]以新生仔豬為模型研究新生兒呼吸窘迫綜合征，發(fā)現(xiàn)患病仔豬肺組織中NLRP3炎癥小體和IL-1β的表達均顯著升高，該研究也證實NLRP3參與呼吸機引起的急性肺損傷過程。多項研究發(fā)現(xiàn)，支氣管肺發(fā)育不良[14]和肺炎支原體肺炎[15]等肺部疾病的發(fā)生也與NLRP3炎癥小體有密切關系，可見NLRP3炎癥小體在阻滯肺發(fā)育和誘導肺損傷過程中發(fā)揮極其重要的作用。本研究結(jié)果顯示，PFOS暴露后大鼠BALF中IL-1β和IL-18含量升高，提示炎癥因子參與PFOS引起的大鼠肺損傷過程。MPO主要存在于中性粒細胞[16]和單核細胞中。ELISA結(jié)果顯示，P組MPO含量顯著高于其余3組，提示PFOS暴露會引起大鼠肺組織發(fā)生炎癥反應，導致中性粒細胞和單核細胞數(shù)量增多，而格列本脲能減輕該炎癥反應。Western blot結(jié)果顯示，PFOS暴露后大鼠肺組織內(nèi)NLRP3、caspase-1和ASC蛋白的表達量較正常大鼠均顯著升高，免疫組化NLRP3蛋白染色也證實了這一結(jié)果。這提示NLRP3炎癥小體參與了PFOS致大鼠肺損傷過程。

Figure 5. Immunohistochemical staining of NLRP3 in the lung tissues of rats in each group. Mean±SEM.n=7.**P<0.01vsP group.

圖5 各組大鼠肺組織中NLRP3免疫組化染色

最新研究發(fā)現(xiàn)，格列本脲不僅能治療糖尿病，還對NLRP3炎癥小體有特異性抑制作用。研究人員發(fā)現(xiàn)，IL-10-/-小鼠和克羅恩病患者的結(jié)腸黏膜中，NLRP3炎癥小體的表達上調(diào)，且隨著疾病惡化，NLRP3的活化程度逐漸升高。而格列本脲能顯著抑制IL-10-/-小鼠NLRP3炎癥小體的激活，不但能緩解持續(xù)性結(jié)腸炎，而且能預防和延遲疾病的發(fā)生發(fā)展[17]。Hou等[7]發(fā)現(xiàn)，體外循環(huán)通過激活NLRP3炎癥小體使高遷移率族蛋白B1(high mobility group box 1，HMGB1)的表達增高，從而誘導肺損傷。經(jīng)體外循環(huán)處理的大鼠使用格列本脲預處理后，肺動脈平滑肌細胞中ASC、caspase-1和IL-1β的表達、肺泡巨噬細胞肺出血的發(fā)生率以及血清和BALF中HMGB1的含量均顯著降低。由此可見，格列本脲確實能阻斷NLRP3炎癥小體的激活，抑制其致炎作用。本研究結(jié)果顯示，PFOS暴露前使用格列本脲預處理的大鼠與沒有預處理的大鼠相比，前者肺組織中NLRP3炎癥小體相關蛋白的表達及BALF中IL-1β和IL-18的含量均顯著降低，肺組織的病變情況也明顯減輕，而單獨使用格列本脲的大鼠與正常組大鼠的肺組織變化無明顯差別。這進一步證明了NLRP3炎癥小體在PFOS致大鼠肺損傷過程中發(fā)揮了重要作用。

綜上所述，本研究初步證實了幼年期大鼠暴露于PFOS后，通過激活NLRP3炎癥小體引發(fā)一系列炎癥反應，從而釋放炎癥因子(IL-1β和IL-18)，導致肺損傷。而格列本脲作為NLRP3的特異性抑制劑，在一定程度上能減輕PFOS引起的毒性作用。PFOS污染不容忽視，尤其是其蓄積作用帶來的不良反應(如生殖毒性、胚胎毒性、肝腎毒性和神經(jīng)毒性)更應引起人們廣泛關注。因此，PFOS致病的具體機制以及針對相關疾病的防治手段仍需繼續(xù)探索。