李旭艷， 翟文君， 馬明君， 陳振寶， 孫玉林， 趙 娟， 李永芹

(1嶺南師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 廣東 湛江 524000； 2東北林業(yè)大學(xué)生命學(xué)院， 黑龍江 哈爾濱 150040)

隨著人們生活方式的改變和生活環(huán)境的變化，糖尿病和胰腺炎等胰腺相關(guān)疾病的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，嚴(yán)重危害人類健康和生活質(zhì)量。糖尿病患者表現(xiàn)為胰島β細(xì)胞受損或胰島素抵抗，胰腺炎患者的胰腺腺泡細(xì)胞凋亡或壞死。補(bǔ)充受損或功能異常的胰島β細(xì)胞或腺泡細(xì)胞將是治療這類疾病的根本途徑。終末分化胰島細(xì)胞和胰腺腺泡細(xì)胞均起源于胚胎發(fā)育早期胰腺干細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)，成體胰腺含有1%的胰腺干/祖細(xì)胞，激活成體胰腺干/祖細(xì)胞增殖分化，獲得終末分化胰腺內(nèi)、外分泌細(xì)胞，是胰腺疾病治療的新希望。

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)是重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，參與干擾素、白細(xì)胞介素和生長(zhǎng)因子等多種細(xì)胞因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，是白細(xì)胞介素6/Janus 激酶(interleukin-6/Janus kinase，IL-6/JAK)和表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)等酪氨酸激酶信號(hào)通路效應(yīng)分子，STAT3被上游的蛋白激酶磷酸化，形成二聚體，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)調(diào)控促增殖、抗凋亡、免疫反應(yīng)等基因表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、遷移、凋亡、自噬、免疫以及代謝等重要生命活動(dòng)。正常生理?xiàng)l件下STAT3低表達(dá)或短暫性激活，而在胰腺疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中STAT3被活化并持續(xù)激活。被激活的STAT3促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞異常增殖、轉(zhuǎn)移、生成新生血管[1]，炎癥在胰腺癌的進(jìn)展過(guò)程中扮演重要角色，能顯著加速胰腺上皮腫瘤癌變，STAT3作為一種急性期反應(yīng)因子，參與調(diào)控胰腺炎和胰腺纖維化進(jìn)程[2]，另外，STAT3參與糖尿病腎病、糖尿病心肌病和糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生和發(fā)展的過(guò)程[3-5]。阻斷STAT3信號(hào)通路，能改善胰腺癌、胰腺炎和糖尿病并發(fā)癥癥狀，STAT3信號(hào)通路有可能成為治療胰腺疾病的藥物靶點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，STAT3對(duì)腫瘤干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞的增殖、自我更新和重編程有重要調(diào)控作用。STAT3促進(jìn)牙髓干細(xì)胞增殖、抑制分化[6]，促進(jìn)甲狀腺癌干細(xì)胞細(xì)胞集落形成[7]，維持慢性髓細(xì)胞性白血病干細(xì)胞的特性[8]，STAT3是否調(diào)控胰腺干/祖細(xì)胞的功能尚未報(bào)道。本研究以小鼠胰腺祖細(xì)胞為研究對(duì)象，沉默STAT3基因表達(dá)，檢測(cè)STAT3基因?qū)σ认僮婕?xì)胞增殖的影響，探究胰腺祖細(xì)胞增殖的機(jī)制，將為利用胰腺干/祖細(xì)胞開展疾病治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞

小鼠成體胰腺祖細(xì)胞為東北林業(yè)大學(xué)發(fā)育生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供[9]。

2 主要試劑

DMEM/F12培養(yǎng)液、胰蛋白酶、雙抗和L-谷氨酰胺購(gòu)自HyClone；B-27細(xì)胞培養(yǎng)添加劑和胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)自Gibco；細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)別重組人胰島素和表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)購(gòu)自Becton, Dickinson and Company；細(xì)胞轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體Lipofectamine RNAiMAX購(gòu)自Invitrogen；總RNA提取試劑Tripure和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑RT-qPCR SYRB Green購(gòu)自Roche；脫氧核糖核酸酶I(deoxyribonuclease I，DNaseI)和核糖核酸酶抑制劑(ribonuclease inhibitor，RI)購(gòu)自TaKaRa；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、抗β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體(HC201-02)和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的II抗(HS201-01)購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Cell Counting Kit-8(CCK8)試劑盒購(gòu)自Dojindo Labratories；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒和RIPA蛋白裂解液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；抗STAT3抗體(cst.9139)和抗細(xì)胞周期蛋白D2(cyclin D2，CCND2)抗體(cst. 3741)購(gòu)自Cell Signaling Technology；β-巰基乙醇、過(guò)硫酸銨、丙烯酰胺、甲基雙丙烯酰胺和四甲基乙二胺購(gòu)自Sigma；吐溫20、甲醇等常規(guī)生化試劑購(gòu)自天津天大化學(xué)試劑廠。靶向STAT3的小干擾RNA[STAT3small interfering RNA (siRNA),siSTAT3][10]和對(duì)照siRNA(negative control，NC)由吉瑪基因股份有限公司合成，序列見表1。qPCR引物由金唯智基因公司合成，序列見表2。

表1 siRNAs序列

表2 qPCR引物序列

3 主要方法

3.1細(xì)胞培養(yǎng) 傳代胰腺祖細(xì)胞用10%貼壁培養(yǎng)液過(guò)夜培養(yǎng)，次日早更換2%生長(zhǎng)培養(yǎng)液，置于37 ℃、5.0% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d更換生長(zhǎng)培養(yǎng)液。貼壁培養(yǎng)液成分：含10% FBS、1%雙抗和1% L-谷氨酰胺的DMEM/F12培養(yǎng)液。生長(zhǎng)培養(yǎng)液成分：含2% FBS、1%雙抗、1% L-谷氨酰胺、2% B-27、50 μmol/L β-巰基乙醇、10 mg/L重組人胰島素和20 μg/L EGF的DMEM/F12培養(yǎng)液。

3.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取培養(yǎng)8代的胰腺祖細(xì)胞，96 孔和12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔分別接種3×103和1×105個(gè)細(xì)胞，生長(zhǎng)培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞40%匯合后，每孔轉(zhuǎn)染50 nmol/L siSTAT3或NC，細(xì)胞轉(zhuǎn)染參照Lipofectamine RNAiMAX說(shuō)明書操作。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。同時(shí)轉(zhuǎn)染陽(yáng)性對(duì)照siRNA，qPCR檢測(cè)基因沉默效果， 間接判斷轉(zhuǎn)染效率。

3.3qPCR檢測(cè)各基因mRNA的表達(dá) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h，提取細(xì)胞總RNA，利用隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA，qPCR檢測(cè)基因mRNA表達(dá)，所得數(shù)據(jù)通過(guò)2-ΔΔCt方法計(jì)算，β-actin作為內(nèi)參照，設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

3.4Western blot檢測(cè)蛋白的表達(dá) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h，PBS洗滌，RIPA裂解細(xì)胞，收集裂解液，10 000×g離心10 min，取上清，測(cè)定蛋白濃度，分裝樣品凍存。樣品進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，37 ℃封閉1 h，抗β-actin、STAT3和CCND2 抗體4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次，II抗室溫孵育1 h，Tanon 5200發(fā)光成像系統(tǒng)采集圖像，β-actin作為內(nèi)參照。

3.5活細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖 24孔板接種胰腺祖細(xì)胞，生長(zhǎng)至40%匯合，轉(zhuǎn)染siSTAT3或NC 72 h，胰酶消化為單細(xì)胞，收集到離心管定容到1 mL，稀釋后，在光學(xué)顯微鏡下用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

3.6CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活力 96 孔板接種胰腺祖細(xì)胞，生長(zhǎng)至40%匯合，轉(zhuǎn)染siSTAT3或NC 72 h，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌細(xì)胞，補(bǔ)加110 μL含有10% CCK8的DMEM/F12培養(yǎng)液，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，通過(guò)酶標(biāo)儀讀取各孔吸光度(A)值。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

3.7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布 細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h，收集各組細(xì)胞1×106個(gè)，PBS洗滌2次，1 100×g離心5 min，70%冷乙醇4 ℃固定2 h，PBS洗2 次，30 mg/L RNAse A 37 ℃孵育30 min，50 mg/L PI避光孵育30 min，冷PBS洗2次，600 μL PBS重懸細(xì)胞，Accuri C6流式細(xì)胞儀檢測(cè)，隨機(jī)收集30 000個(gè)細(xì)胞，采集信號(hào)，采用ModFit 4.1流式數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 敲減STAT3基因表達(dá)的效果

50 nmol/L siSTAT3或NC轉(zhuǎn)染胰腺祖細(xì)胞48 h和72 h后，分別提取RNA和蛋白，通過(guò)qPCR和Western blot檢測(cè)siRNA對(duì)STAT3基因的沉默效果。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組胰腺祖細(xì)胞STAT3的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)(P<0.05)，mRNA的表達(dá)水平降低了(49.75±0.03)%，蛋白的表達(dá)水平降低了(78.62±0.08)%，見圖1。

Figure 1. The relative expression ofSTAT3gene in the pancrea-tic progenitor cells transfected withSTAT3siRNA. A: the mRNA expression of STAT3 was detected by qPCR after transfection for 48 h; B: the protein expression of STAT3 was determined by Western blot after transfection for 72 h. Mean±SEM.n=3.**P<0.01vsNC group.

圖1 轉(zhuǎn)染STAT3siRNA后胰腺祖細(xì)胞STAT3基因表達(dá)水平的變化

2 敲減STAT3基因表達(dá)對(duì)胰腺祖細(xì)胞增殖和活力的抑制作用

細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，倒置顯微鏡下觀察，轉(zhuǎn)染72 h后，采集細(xì)胞圖像結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染STAT3siRNA的胰腺祖細(xì)胞孔板中細(xì)胞密度降低，見圖2A；活細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，敲減STAT3基因的表達(dá)使細(xì)胞數(shù)量減少了(45.62±0.03)%(P<0.01)，見圖2B。CCK8法檢測(cè)結(jié)果顯示敲減STAT3基因的表達(dá)使胰腺祖細(xì)胞活力減少了(43.68±0.05)%(P<0.05)，見圖2C。

Figure 2. The effects ofSTAT3silencing on the proliferation and viability of pancreatic progenitor cells. A: the images of cells under the inverted optical microscope after transfection for 72 h (×100); B: the effect ofSTAT3silencing on the proliferation of pancreatic progenitor cells was detected by cell counting after transfection for 72 h; C: the effect ofSTAT3silencing on the viability of pancreatic progenitor cells was measured by CCK8 assay after transfection for 72 h. Mean±SEM.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsNC group.

圖2 沉默STAT3對(duì)胰腺祖細(xì)胞增殖和活力的影響

3 敲減STAT3的表達(dá)對(duì)胰腺祖細(xì)胞細(xì)胞周期分布的影響

細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布。與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染siSTAT3干擾片段的胰腺祖細(xì)胞其周期阻滯在G0/G1期,見圖3。

4 敲減STAT3的表達(dá)對(duì)CCND2蛋白表達(dá)的影響

細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h，Western blot 檢測(cè)結(jié)果可見轉(zhuǎn)染siSTAT3的胰腺祖細(xì)胞中CCND2蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，見圖4。

討 論

糖尿病發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，利用胚胎、多能性、成體干細(xì)胞誘導(dǎo)生成分泌胰島素的細(xì)胞是糖尿病干細(xì)胞治療的主要研究方向，激活內(nèi)源胰腺干/祖細(xì)胞生成功能細(xì)胞，將是一種更為有效和安全的治療方案，然而成體胰腺干/祖細(xì)胞數(shù)量少且常處于靜息狀態(tài)，因此，探究胰腺干/祖細(xì)胞的增殖機(jī)制具有重要的科學(xué)意義。研究表明，STAT3 在不同類型的細(xì)胞和組織中廣泛表達(dá)，參與細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡等功能的調(diào)控，本研究利用RNAi技術(shù)成功敲減胰腺祖細(xì)胞STAT3基因表達(dá)，細(xì)胞計(jì)數(shù)和CCK8檢測(cè)結(jié)果表明，敲減STAT3抑制胰腺祖細(xì)胞增殖和細(xì)胞活力。

Figure 3. The effects ofSTAT3silencing on the cell cycle distribution of pancreatic progenitor cells were analyzed by flow cytometry after transfection for 72 h. Mean±SEM.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsNC group.

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)沉默STAT3對(duì)胰腺祖細(xì)胞細(xì)胞周期分布的影響

Figure 4. The effects ofSTAT3silencing on the protein expression of CCND2 in the pancreatic progenitor cells after transfection for 72 h. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vsNC group.

圖4 沉默STAT3對(duì)胰腺祖細(xì)胞CCND2表達(dá)的影響

STAT3 是轉(zhuǎn)錄激活因子家族成員之一，在多種信號(hào)分子刺激下，STAT3被磷酸化激活，結(jié)合于靶基因DNA調(diào)控區(qū)，調(diào)控功能基因表達(dá)。STAT3活化后可通過(guò)激活其靶基因MYC原癌基因、細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1，CCND1)、CCND2、存活蛋白(survivin)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2，MMP2)、p21、p27等，調(diào)控細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期進(jìn)程、遷移、侵襲和凋亡[11-12]。通過(guò)慢病毒介導(dǎo)的短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)沉默STAT3基因表達(dá)，可降低survivin基因表達(dá)，抑制成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]。人工合成STAT3蛋白抗體SBT-100特異性抑制磷酸化STAT3功能，可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖[14]；siRNA沉默STAT3基因表達(dá)可降低survivin和CCND1表達(dá)，抑制白細(xì)胞介素17(interleukin-17，IL-17)對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的誘導(dǎo)作用[15]。研究表明，STAT3還通過(guò)調(diào)控下游基因表達(dá)影響干細(xì)胞增殖、自我更新和分化[16]。已報(bào)道，減弱JAK/STAT3信號(hào)活性抑制骨髓基質(zhì)細(xì)胞增殖和成骨分化[17]。激活STAT3基因，促進(jìn)小鼠胚胎干細(xì)胞多潛能性調(diào)控因子MYC和Bcl-3表達(dá)，有利于維持細(xì)胞自我更新特性[18-19]。STAT3促進(jìn)CD24、CD34、CD38、CD44、CD90和CD133等腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志性基因表達(dá)[20]，STAT3與CD44形成二聚物并乙?；牒撕蠼Y(jié)合CCND2、MYC和TWIST1基因啟動(dòng)子，激活細(xì)胞周期調(diào)控基因表達(dá)[21-22]。本研究顯示，在胰腺祖細(xì)胞中敲減STAT3基因可降低CCND2蛋白表達(dá)，使細(xì)胞周期進(jìn)程阻滯在G0/G1期，抑制胰腺祖細(xì)胞細(xì)胞增殖。這表明，STAT3基因通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期蛋白CCND2的表達(dá)調(diào)控胰腺祖細(xì)胞增殖。

STAT3磷酸化能被多種途徑激活。EGF、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等與相應(yīng)受體結(jié)合，使受體磷酸化，利用其內(nèi)源性酪氨酸激酶活性直接磷酸化STAT3；IL-6等細(xì)胞因子與細(xì)胞膜上相應(yīng)受體結(jié)合，募集JAK使受體的酪氨酸殘基磷酸化，募集STAT3并使其磷酸化。 研究表明，EGF是小鼠和人胚胎胰腺祖細(xì)胞、小鼠成體胰腺祖細(xì)胞維持體外增殖、自我更新和誘導(dǎo)分化的必需因子，用缺乏EGF的培養(yǎng)液培養(yǎng)胰腺祖細(xì)胞，使細(xì)胞增殖速度減慢[23-24]。EGF與其受體EGFR結(jié)合，使受體磷酸化，激活促進(jìn)細(xì)胞增殖和細(xì)胞存活的信號(hào)通路，如JAK/STAT3、絲裂原活化蛋白激酶/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase，MAPK/ERK)和磷酯酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/AKT)信號(hào)通路。我們推測(cè)，敲減STAT3基因表達(dá)可能阻斷了上游EGFR/JAK/STAT3信號(hào)通路的傳導(dǎo)作用，從而抑制細(xì)胞增殖。

STAT3已成為轉(zhuǎn)錄因子、微小RNA(microRNA，miRNA)、長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)、小分子抑制劑和藥物調(diào)控細(xì)胞功能的靶點(diǎn)，如抗腫瘤藥CDK5抑制劑Roscovitine對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖的抑制作用，以及l(fā)ncARSR(lncRNA activated in renal cell carcinoma with sunitinib resis-tance)對(duì)肝癌干細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用是通過(guò)調(diào)控STAT3途徑實(shí)現(xiàn)的[25-26]。STAT3信號(hào)通路在胰腺癌、胰腺炎和糖尿病并發(fā)癥中發(fā)揮重要功能，STAT3信號(hào)通路可能成為胰腺疾病治療的靶點(diǎn)。本研究揭示了STAT3調(diào)控胰腺祖細(xì)胞增殖的機(jī)制，為利用胰腺干/祖細(xì)胞開展疾病治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。