李紀(jì)鵬， 王建華

(寧波市鄞州人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室， 浙江 寧波 315040)

非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell lung cancer, NSCLC)是全球范圍內(nèi)最常見的肺部惡性腫瘤，具有極高的發(fā)病率和死亡率，居所有的惡性腫瘤之首[1]。因此有必要進(jìn)一步探索研究新基因的功能及其在肺癌惡性進(jìn)展中的精確機(jī)制。環(huán)狀RNAs(circular RNAs，circRNAs)是一類不具有5′-末端帽子和3′-末端poly(A)尾巴，以共價(jià)鍵形成環(huán)形結(jié)構(gòu)的非編碼RNA分子[2-3]。最近的研究表明，circRNAs廣泛參與了包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生發(fā)展[4-7]。通過分析GSE104854 RNA-seq數(shù)據(jù)，我們發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA_0000231 (circ_0000231)在肺腺癌中的表達(dá)顯著升高。circ_0000231位于Chr10： 32197099-32199491，全長794 nt，由ARHGAP12基因的第16和17號外顯子環(huán)化而成。通過查閱文獻(xiàn)，我們發(fā)現(xiàn)目前對circ_0000231的研究幾乎是空白的。因此，本研究將探討circ_0000231在NSCLC中的表達(dá)及功能。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞和主要試劑

人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系 SPC-A1、A549、LTEP-A2、H1299 及正常人支氣管上皮細(xì)胞 BEAS-2B 均培養(yǎng)于含 10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。收集60對在鄞州人民醫(yī)院接受手術(shù)患者的NSCLC組織和鄰近正常組織，所有標(biāo)本一經(jīng)收集立即保存于-80 ℃條件下，待后續(xù)使用。本研究所有標(biāo)本采集均經(jīng)過患者家屬簽署知情同意書，并經(jīng)本醫(yī)院倫理委員會審核通過。細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑和TRIzol試劑購自Invitrogen；circ_0000231小干擾RNA序列(5′-ACUGAACAGAUAA-GGGUUUAA-3′)和陰性對照siRNA(negative control siRNA, NC)均為上海吉瑪公司產(chǎn)品；RT-qPCR引物由Invitrogen合成；RT-qPCR試劑購自Transgen；抗細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1, CCND1)、Bcl-2和β-actin抗體購自Santa Cruz；CCK-8和Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物公司。

2 方法

2.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染 在轉(zhuǎn)染前 1 d，取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，用胰酶消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，均勻鋪于細(xì)胞板。12～16 h后時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行。

2.2CCK-8法檢測細(xì)胞活力 取對數(shù)生長期的SPC-A1和H1299細(xì)胞，接種于96孔板，每孔2×103個(gè)細(xì)胞。分別轉(zhuǎn)染NC和si-circ_0000231，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。于轉(zhuǎn)染的0、24、48和72 h分別在每個(gè)孔中加入10 μL CCK-8溶液，在37 ℃下孵育2 h后，于450 nm處測量吸光度(A)值。

2.3集落形成實(shí)驗(yàn) 各組細(xì)胞按照每孔1×103個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)約2周后形成肉眼可見的細(xì)胞集落。PBS清洗3次，75%的乙醇固定后，用1%的結(jié)晶紫染色10 min，經(jīng)PBS清洗、晾干后拍照，計(jì)算集落形成數(shù)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 按照凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行，轉(zhuǎn)染48 h后使用不含EDTA的胰酶消化SPC-A1和H1299細(xì)胞，用培養(yǎng)液終止消化，1 000 r/min 離心5 min，收集細(xì)胞，PBS清洗細(xì)胞2次，棄上清，加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，再加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI 室溫避光染色20 min，然后通過流式細(xì)胞術(shù)分析凋亡率。

2.5RNA提取和RT-qPCR 轉(zhuǎn)染48 h后，采用TRIzol試劑提取總RNA，取總RNA 1 μg，按照Transgen試劑盒說明書進(jìn)行cDNA合成，采用SYBR Green I熒光染料法完成qPCR。circ_0000231的正向引物序列為5′-ATTCCGCAGGAGAAGGCTCT-3′，反向引物序列為5′- GCTTAGAACAAGGAGATCTACACCA-3′;Bcl-2的正向引物為5′-ACGGTGGTGGAGGAGC-TCTT-3′，反向引物為5′-CGGTTGACGCTCTCCACAC-3′；CCND1的正向引物為5′-TGAGGGACGCTTTGTCTGTC-3′，反向引物為5′-GCCTTTGGCCTCTCG-ATACA-3′；GAPDH的正向引物為5′-CAATGACCCCTTCATTGACC-3′，反向引物為5′-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3′。采用GAPDH作為內(nèi)參照，通過2-ΔΔCt方法分析RNA的相對表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6Western blot法檢測蛋白的表達(dá)水平 轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞，運(yùn)用總蛋白提取試劑盒提取總蛋白，經(jīng)10%SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)膜，將膜置于含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液中，37 ℃封閉2 h。分別加入抗CCND1和Bcl-2單克隆抗體，在4 ℃下孵育過夜。1×TBST緩沖液洗膜，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗，于37 ℃下孵育2 h。1×TBST緩沖液洗膜，采用化學(xué)發(fā)光法檢測目的蛋白條帶。以β-actin作為內(nèi)參照。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 circ_0000231在NSCLC中表達(dá)上調(diào)

RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，與正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B相比，circ_0000231在NSCLC細(xì)胞系(A549、LTEP-A2、H1299和SPC-A1)中有不同程度的表達(dá)上調(diào)(P<0.05),見圖1A。隨后我們評估了circ_0000231在NSCLC組織中的表達(dá),結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，circ_0000231的表達(dá)在NSCLC組織中顯著上調(diào)(P<0.01),見圖1B。這些結(jié)果表明circ_0000231可能在NSCLC中發(fā)揮癌基因作用。

2 沉默circ_0000231抑制NSCLC細(xì)胞的活力

由于circ_0000231在NSCLC中上調(diào)，我們使用小干擾RNA敲減circ_0000231的表達(dá)以評估其生物學(xué)功能。 首先，RT-qPCR檢測結(jié)果顯示circ_0000231小干擾RNA抑制效果顯著，見圖2A。 CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染si-circ_0000231 72 h后SPC-A1細(xì)胞和H1299細(xì)胞的活力顯著低于對照組(P<0.05),見圖2B。

Figure 1. The circ_0000231 level was up-regulated in the NSCLC cells and tissues. A: circ_0000231 expression was assessed by RT-qPCR in 4 NSCLC cell lines and normal bronchial epithelial BEAS-2B cells; B: circ_0000231 expression was assessed in lung tissues of 60 NSCLC patients. circ_0000231 levels were normalized to GAPDH levels. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsBEAS-2B group;##P<0.01vspara-carcinoma group.

圖1 circ_0000231在NSCLC細(xì)胞和組織中的表達(dá)

Figure 2. The effect of si-circ_0000231 on NSCLC cell viability. A: specific siRNAs targeting circ_0000231 were transfected into SPC-A1 and H1299 cells; B: CCK-8 assay showed the cell viability in si-circ_0000231 group and NC group. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsNC group.

圖2 沉默circ_0000231對NSCLC細(xì)胞活力的影響

3 沉默circ_0000231抑制NSCLC細(xì)胞集落的形成

集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對照組相比，si-circ_0000231轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞集落形成數(shù)顯著降低(P<0.01),見圖3。

4 沉默circ_0000231促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的凋亡

通過流式細(xì)胞術(shù)評估circ_0000231對NSCLC細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示，在SPC-A1細(xì)胞和H1299細(xì)胞中si-circ_0000231組的凋亡率顯著高于對照組(P<0.01)，見圖4。

5 沉默circ_0000231影響CCND1和Bcl-2的表達(dá)

我們隨后檢測了細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白CCND1和bcl-2的表達(dá)，RT-qPCR和Western blot結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染si-circ_0000231后，CCND1和Bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)均受到不同程度的抑制(P<0.01),見圖5。

討 論

近年來， circRNAs已成為非編碼RNA(non-co-ding RNA, ncRNA)領(lǐng)域的重要研究對象。circRNAs最重要的2個(gè)特性是高度保守和非常穩(wěn)定，半衰期大于48 h[8-9],與其它非編碼RNA (如長鏈非編碼RNA和miRNA)相比，這些優(yōu)點(diǎn)為circRNAs成為理想的疾病診斷標(biāo)志物提供了可能[10-12]。

目前報(bào)道最多的circRNAs功能模式是其作為miRNA海綿調(diào)控基因表達(dá)[13-14]，例如，環(huán)狀RNA CDR1as(也稱為ciRS-7)在其序列上有超過60個(gè)保守的miR-7結(jié)合位點(diǎn)，能夠影響miR-7靶標(biāo)基因活性從而促進(jìn)腫瘤惡性進(jìn)展[15];Han等[16]報(bào)道, circMTO1 能夠吸附抑制miR-9從而抑制肝癌細(xì)胞增殖和侵襲;Zhu等[17]發(fā)現(xiàn)circ_0013958能夠促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲，是肺癌早期診斷的標(biāo)志物[17]。本研究中，我們通過RT-qPCR的檢測發(fā)現(xiàn)circ_0000231在NSCLC組織和細(xì)胞系中均有不同程度的表達(dá)上調(diào)，提示circ_0000231在NSCLC中可能發(fā)揮癌基因功能，是潛在的腫瘤標(biāo)志物。隨后我們應(yīng)用小干擾RNA敲減circ_0000231表達(dá)后，通過CCK-8法、集落形成實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞增殖、凋亡情況，結(jié)果顯示與對照組相比，si-circ_0000231組的細(xì)胞活力受到抑制、細(xì)胞集落形成數(shù)減少而凋亡增加，這些結(jié)果表明沉默circ_0000231可顯著抑制NSCLC惡性增殖的生物學(xué)表型。

Figure 3. The effect of si-circ_0000231 on the colony formation ability of NSCLC cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNC group.

圖3 沉默circ_0000231對NSCLC細(xì)胞集落形成能力的影響

Figure 4. The results of flow cytometry analysis showed the apoptosis of the cells transfected with si-circ_0000231. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNC group.

圖4 沉默circ_0000231對NSCLC細(xì)胞凋亡的影響

Figure 5. The effect of si-circ_0000231 transfection on the mRNA (A) and protein (B) expression of CCND1 and Bcl-2 in the SPC-A1 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNC group.

圖5 沉默circ_0000231對CCND1和Bcl-2表達(dá)的影響

細(xì)胞周期蛋白D1和Bcl-2是公認(rèn)的癌基因，其過度表達(dá)可致細(xì)胞增殖失控，與患者臨床表現(xiàn)及預(yù)后不良有關(guān)[18-21]。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)敲減circ_0000231表達(dá)后，CCND1和Bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)水平均有不同程度的下調(diào)，提示circ_0000231可能是通過調(diào)控CCND1和Bcl-2參與NSCLC惡性進(jìn)展的。然而，circ_0000231是直接作用于CCND1和Bcl-2還是通過吸附某些miRNAs間接調(diào)控其表達(dá)的還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，circ_0000231在NSCLC中表達(dá)上調(diào)，沉默circ_0000231能夠抑制NSCLC細(xì)胞增殖并促進(jìn)NSCLC細(xì)胞凋亡，其作用可能是通過調(diào)控CCND1和bcl-2基因表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。