李松巖， 于 洋， 劉師兵， 徐 路， 孫 奇， 徐 冶△

(吉林醫(yī)藥學(xué)院 1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 2科研實(shí)驗(yàn)室， 吉林 吉林 132013)

卵巢癌是女性多發(fā)的婦科腫瘤之一，發(fā)病率占據(jù)第7位，且呈逐年遞增趨勢(shì)[1-2]。化療藥物是治療卵巢癌的常用藥物，但其存在較大副作用以及容易出現(xiàn)耐藥性，在臨床上的使用受到了限制[3-5]。白藜蘆醇(resveratrol,Res)是一種天然多酚類(lèi)化合物，在虎杖、花生和桑椹等植物中含有這種天然的活性成分[6]。研究表明，白藜蘆醇具有抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖，抑制腫瘤的侵襲和遷移等生物學(xué)效應(yīng)[7]。沉默交配型信息調(diào)節(jié)因子2同源蛋白3(silent mating type information regulation 2 homolog 3，Sirt3)是一種依賴(lài)于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)的Ⅲ類(lèi)去乙?；福湓诰€(xiàn)粒體的適應(yīng)性反應(yīng)中起調(diào)節(jié)作用。Sirt3可以通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞線(xiàn)粒體內(nèi)活性氧簇(reaction oxygen species,ROS)水平，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[8-9]。但Sirt3在白藜蘆醇誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制尚不完全清楚。本研究從細(xì)胞水平探討Sirt3-SOD2-ROS途徑在白藜蘆醇誘導(dǎo)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制，探究白藜蘆醇對(duì)SKOV3細(xì)胞凋亡的作用。

材 料 和 方 法

1 材料和主要試劑

人卵巢癌SKOV3細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。白藜蘆醇購(gòu)自Sigma；抗Sirt3、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase 2, SOD2)和β-actin抗體均購(gòu)自Santa Cruz；抗Bcl-2和Bax抗體購(gòu)自Abcam；ROS熒光探針購(gòu)自Invitrogen；新生胎牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)液購(gòu)自Gibco；甘氨酸、甲叉丙烯酰胺和相應(yīng) Ⅱ 抗購(gòu)自長(zhǎng)春德?tīng)査?；PVDF膜購(gòu)自Milipore；Hoechst 33342熒光染料購(gòu)自北京鼎國(guó)公司；MTT購(gòu)自Sigma。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)和分組處理 用含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用0.25%胰蛋白酶消化傳代。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。調(diào)整細(xì)胞密度為8×106/L，接種于96空板，每孔200 μL，隨機(jī)分為0、2.5、5、10、20、40和80 mg/L白藜蘆醇組，分別處理24 h后進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。

2.2MTT方法檢測(cè)細(xì)胞活力 取2.1分組處理的細(xì)胞，每孔加入20 μL新配制MTT(0.5 mg/L)，37 ℃孵育4 h，棄去孔中培養(yǎng)液，加入DMSO 150 μL，室溫振蕩10 min，用Model-680型酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度(A490nm)。測(cè)3次，取平均值。細(xì)胞活力抑制率(%)=[1-(A實(shí)驗(yàn)組-A空白組)/(A對(duì)照組-A空白組)]×100%。

2.3Hoechst 33342染色檢測(cè)細(xì)胞核形態(tài) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以1×108/L密度接種于24孔板中，每孔500 μL，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。待細(xì)胞長(zhǎng)至80%密度，根據(jù)IC50結(jié)果，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、白藜蘆醇(10 mg/L)組、白藜蘆醇(20 mg/L)組和白藜蘆醇(40 mg/L)組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。用PBS洗滌細(xì)胞3次，用4%多聚甲醛室溫固定20 min后，用PBS洗滌3次。用Hoechst 33342(1 mg/L)染色液50 μL，避光處理細(xì)胞2 min后，用冰PBS洗滌3次。用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞核變化。

2.4細(xì)胞質(zhì)游離ROS水平檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞，以1×108/L密度接種于24孔板中，藥物作用24 h后，移去培養(yǎng)液，用RPMI-1640培養(yǎng)液輕輕洗2次，加入ROS熒光探針37 ℃孵育30 min。用RPMI-1640培養(yǎng)液輕輕洗2次后，加入RPMI-1640培養(yǎng)液37 ℃孵育10 min。再次用RPMI-1640培養(yǎng)液輕輕洗2次，應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡獲取細(xì)胞內(nèi)ROS熒光圖像。

2.5Western blot法檢測(cè)cleaved caspase-3、Sirt3、SOD2、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、白藜蘆醇(10 mg/L)組、白藜蘆醇(20 mg/L)組和白藜蘆醇(40 mg/L)組，培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)液，胰酶消化，離心收集細(xì)胞，加入含有蛋白酶抑制劑(PMSF)的RIPA蛋白裂解液150 μL，超聲細(xì)胞粉碎儀超聲細(xì)胞2次，每次3～5 s，4 ℃放置30 min，蛋白裂解液充分裂解細(xì)胞后，高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)離心收集上清液。Bradford法進(jìn)行蛋白定量。SDS-PAGE結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，膜用5%脫脂奶粉封閉1.5 h，PBST洗3次，加入相應(yīng)稀釋度的 Ⅰ 抗(1∶1 000)，4 ℃過(guò)夜。次日PBST洗3次，加入相應(yīng)稀釋度的HRP標(biāo)記的 Ⅱ 抗(1∶2 000)，室溫?fù)u床孵育1.5 h；PBST洗5次，ECL顯色，掃描紀(jì)錄。以β-actin作為內(nèi)參照，采用Quantity One軟件進(jìn)行分析處理，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參照蛋白的吸光度比值表示蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用(mean±SD)表示，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)3次，組間比較采用單因素方差分析或重復(fù)測(cè)量方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 MTT法檢測(cè)SKOV3細(xì)胞活力

白藜蘆醇(0、2.5、5、10、20、40和80 mg/L)對(duì)SKOV3細(xì)胞的活力具有顯著抑制作用，且呈現(xiàn)濃度依賴(lài)關(guān)系(r=0.982,P<0.05)，見(jiàn)圖1。白藜蘆醇作用24 h的IC50為(47.6±0.1) mg/L。

Figure 1. The effect of resveratrol (Res) on the viability of human ovarian cancer SKOV3 cells was measured by MTT assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 mg/L group.

圖1 MTT法檢測(cè)白藜蘆醇對(duì)SKOV3細(xì)胞活力的影響

2 白藜蘆醇對(duì)SKOV3細(xì)胞活力抑制率的影響

與空白對(duì)照組相比，白藜蘆醇(20 mg/L)組和白藜蘆醇(40 mg/L)組SKOV3細(xì)胞活力抑制率顯著上升(P<0.01)，見(jiàn)圖2。

Figure 2. The inhibitory effect of resveratrol (Res) on the viability of SKOV3 cells was measured by MTT assay. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖2 MTT法檢測(cè)不同濃度白藜蘆醇組中SKOV3細(xì)胞活力抑制率的變化

3 白藜蘆醇對(duì)SKOV3細(xì)胞細(xì)胞核形態(tài)的影響

Hoechst 33342染色，在激光共聚焦顯微鏡下觀察，空白對(duì)照組中SKOV3細(xì)胞核未見(jiàn)核著色聚集和核固縮現(xiàn)象；不同濃度白藜蘆醇組中SKOV3細(xì)胞中出現(xiàn)明顯的細(xì)胞核著色聚集和核固縮現(xiàn)象,見(jiàn)圖3。

Figure 3. Hoechst 33342 staining was used to evaluate the effect of resveratrol (Res) on apoptosis of the SKOV3 cells. A: control group; B: Res (10 mg/L) group; C: Res (20 mg/L) group; D: Res (40 mg/L) group.

圖3 應(yīng)用Hoechst染色檢測(cè)白藜蘆醇對(duì)SKOV3細(xì)胞凋亡的影響

4 白藜蘆醇對(duì)SKOV3細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)ROS水平的影響

如圖4所示，紅色熒光表明細(xì)胞內(nèi)ROS水平。與空白對(duì)照組相比，不同濃度白藜蘆醇組中紅色熒光點(diǎn)數(shù)明顯減少，隨著白藜蘆醇濃度的增加，紅色熒光數(shù)量顯著降低。

Figure 4. The effect of resveratrol (Res) on intracellular ROS levels in SKOV3 cells. A: control group; B: Res (10 mg/L) group; C: Res (20 mg/L) group; D: Res (40 mg/L) group.

圖4 不同濃度白藜蘆醇對(duì)SKOV3細(xì)胞胞漿內(nèi)ROS生成的影響

5 白藜蘆醇誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞Sirt3、Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)的影響

Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，隨著白藜蘆醇藥物濃度的增加，Sirt3、SOD2及凋亡相關(guān)蛋白Bax和cleaved caspase-3表達(dá)顯著上升(P<0.05)，而B(niǎo)cl-2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

Figure 5. The related protein expression in the SKOV3 cells detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖5 Western blot法檢測(cè)SKOV3細(xì)胞中相關(guān)蛋白的表達(dá)

討 論

白藜蘆醇具有顯著的抗腫瘤作用，主要表現(xiàn)為抗氧化、抑制環(huán)加氧酶活性、阻滯細(xì)胞周期、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、干擾相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和抑制腫瘤血管生成等[10-12]。白藜蘆醇對(duì)人類(lèi)肝細(xì)胞癌、乳腺癌、胃癌和白血病等多種腫瘤細(xì)胞均有不同程度的拮抗作用。本研究結(jié)果表明，白藜蘆醇作用于人卵巢癌SKOV3細(xì)胞后，細(xì)胞活力下降，細(xì)胞收縮變圓，細(xì)胞密度也明顯下降，這與已報(bào)道結(jié)果一致[13]。

Sirt3在線(xiàn)粒體的適應(yīng)性反應(yīng)中起調(diào)節(jié)作用，包括對(duì)代謝程序的重排、提高抗氧化劑的保護(hù)作用等[14]。研究表明，Sirt3可以通過(guò)SOD2和異枸櫞酸脫氫酶 2 (isocitrate dehydrogenase 2，IDH2)抑制ROS的生成。IDH2和SOD2是Sirt3的靶標(biāo)，IDH2和SOD2可以被Sirt3去乙?；?，使其活性增加[15-16]。Sirt3缺失可使氧化應(yīng)激的防御能力降低，由此可見(jiàn)，Sirt3在細(xì)胞保護(hù)中的重要性[17-19]。研究表明白藜蘆醇可以通過(guò)調(diào)節(jié)Sirt3的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平[20-21]。然而，白藜蘆醇通過(guò)Sirt3誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞凋亡的機(jī)制尚不十分明確。

本研究結(jié)果表明，隨著白藜蘆醇藥物濃度的增加，SKOV3細(xì)胞活力逐漸降低,提示白藜蘆醇具有顯著抑制SKOV3細(xì)胞活力的作用。通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察，白藜蘆醇抑制SKOV3細(xì)胞內(nèi)ROS生成。通過(guò)Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，隨著白藜蘆醇濃度的增加Bax和cleaved caspase-3表達(dá)顯著增強(qiáng)，且Bcl-2蛋白的表達(dá)顯著降低，表明白藜蘆醇可以促進(jìn)SKOV3細(xì)胞凋亡。而白藜蘆醇促進(jìn)SKOV3細(xì)胞凋亡的同時(shí)，Sirt3和SOD2蛋白的表達(dá)也隨之增高，提示白藜蘆醇可能通過(guò)提高SOD2的表達(dá)來(lái)抑制細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，且與Sirt3有關(guān)。

綜上所述，白藜蘆醇在體外能夠上調(diào)Sirt3和SOD2的表達(dá)水平，抑制ROS的表達(dá)，使SKOV3細(xì)胞的活力受到抑制。但是腫瘤的發(fā)生和發(fā)展受到內(nèi)環(huán)境的影響，因此，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)進(jìn)一步通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證白藜蘆醇促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡作用，為白藜蘆醇防治卵巢癌提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。