張鄰川， 鄭武揚(yáng)， 唐文明△

(1廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院杏林分院心內(nèi)科， 福建 廈門 361022； 2廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科， 福建 廈門 361000)

心血管疾病是一種缺血性或出血性疾病，具患病率高、死亡率高和致殘率高的特點(diǎn)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，從1990年～2016年，我國(guó)心血管疾病致死人數(shù)由251萬(wàn)增加到397萬(wàn)，患病人數(shù)從4 060萬(wàn)上升到9 400萬(wàn)[1]，已成為嚴(yán)重威脅人類健康和生命的主要疾病[2]。心肌缺氧是指各種原因引起冠狀動(dòng)脈血流量降低，致使心肌氧等物質(zhì)供應(yīng)不足和代謝產(chǎn)物清除減少為主的病理過(guò)程[3]。作為臨床上常見(jiàn)的心血管疾病之一[4]，心肌缺氧損傷會(huì)引起心肌細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致心肌壞死[5]。然而，關(guān)于缺氧心肌損傷的相關(guān)機(jī)制尚不明確。微小RNAs(microRNAs，miRNAs，miR)是一種高度保守的非編碼RNA，參與缺氧心肌細(xì)胞損傷過(guò)程[6]。資料顯示， miR-323在缺氧誘導(dǎo)豬心肌組織中表達(dá)上調(diào)[7]，miR-323通過(guò)靶向BRI3調(diào)控缺血/再灌注損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞死亡[8]，但miR-323對(duì)缺氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的影響鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究構(gòu)建體外缺氧心肌H9C2細(xì)胞損傷模型，觀察miR-323是否通過(guò)調(diào)控成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子9(fibroblast growth factor 9，F(xiàn)GF9)表達(dá)來(lái)影響缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，為心肌缺氧的臨床診治提供潛在生物標(biāo)志物。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞、實(shí)驗(yàn)主要試劑和儀器

心肌H9C2細(xì)胞購(gòu)自ATCC。DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自Gibco；胰酶和RIPA裂解液購(gòu)自北京索萊寶公司；miR-323、anti-miR-323、miR-con、pcDNA-FGF9和si-FGF9購(gòu)自廣州銳博生物有限公司；青霉素、鏈霉素和Lipofectamine 2000購(gòu)自賽默飛世爾有限公司；miRNA提取試劑盒購(gòu)自Qiagen；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和qPCR試劑盒購(gòu)自Applied Biosystems；MTT購(gòu)自Sigma;Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物公司；抗FGF9、β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)、cleaved caspase-3、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)和p-JNK抗體購(gòu)自Cellular Signaling Technology；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的II 抗和ECL發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；螢光素酶報(bào)告基因載體購(gòu)自上海吉瑪生物公司；細(xì)胞培養(yǎng)瓶購(gòu)自上海生工科技有限公司。ABI 7500熒光定量PCR儀購(gòu)自ABI；離心機(jī)購(gòu)自Eppendorf；酶標(biāo)儀購(gòu)自Bio-Rad；FACSCalibur流式細(xì)胞儀購(gòu)自BD。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組 H9C2細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)液，其中包含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素，放入37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱，待細(xì)胞融合度大于80%，加入適量胰酶消化，進(jìn)行接種傳代。將H9C2細(xì)胞隨機(jī)分為正常對(duì)照(normal control，NC)組(常氧培養(yǎng)H9C2細(xì)胞)和不同處理時(shí)間的缺氧(hypoxia)組(缺氧培養(yǎng)H9C2細(xì)胞0 h、12 h、24 h和48 h),其中，37 ℃、5% CO2環(huán)境為常氧培養(yǎng)條件，1% O2、94% N2、5% CO2為缺氧培養(yǎng)條件[9]。

2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 調(diào)整H9C2細(xì)胞密度為1×108/L，將其接種于6孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%融合度時(shí)，根據(jù)Lipofectamine 2000試劑說(shuō)明書的指示開(kāi)始轉(zhuǎn)染。將anti-miR-323、pcDNA-FGF9和si-FGF9以及相應(yīng)的陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染入H9C2細(xì)胞，并在缺氧條件下培養(yǎng)48 h備用。

2.3qPCR檢測(cè)miR-323的表達(dá) 根據(jù)miRNA提取試劑盒說(shuō)明書，提取細(xì)胞中的總miRNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書操作，將miRNA合成為cDNA，并以cDNA為模板，用實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。條件為：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72℃ 8 min，循環(huán)40次；然后檢測(cè)擴(kuò)增曲線和熔解曲線。收集Ct值，以2-ΔΔCt法計(jì)算miR-323的相對(duì)表達(dá)量。

2.4Western blot實(shí)驗(yàn) 使用RIPA裂解液充分裂解各組H9C2細(xì)胞提取總蛋白，加緩沖液于沸水變性10 min，進(jìn)行10%的SDS-PAGE，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜，用5%脫脂奶粉常溫封閉1 h，加入 I 抗(1∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過(guò)夜，隨后用Tris-HCl-Tween緩沖鹽溶液洗膜3次，每次10 min,加入 II 抗(1∶2 000稀釋)，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，ELC顯色，以β-actin為內(nèi)參照，進(jìn)行蛋白灰度分析。

2.5MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活力 收集各組H9C2細(xì)胞，用PBS沖洗3次，棄上清，使用胰酶消化，將細(xì)胞以每孔1×104個(gè)的密度接種于96孔板，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，各孔加入MTT工作液100 μL，37 ℃孵育4 h，棄上清液，加入二甲基亞砜200 μL，37 ℃搖床孵育10 min，置酶標(biāo)儀測(cè)定各孔細(xì)胞在490 nm處的吸光度(A)。細(xì)胞相對(duì)活力(%)=A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組×100%。

2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 使用胰酶消化各組H9C2細(xì)胞，收集1×108/L細(xì)胞，加入500 μL緩沖液懸浮細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC混勻，加入5 μL PI 混勻，在室溫避光條件下反應(yīng)15 min，置流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

2.7靶基因預(yù)測(cè)及雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.targetscan.org/vert_71/)預(yù)測(cè)miR-323和FGF9的3’-非翻譯區(qū)(3’-untranslated region，3’UTR)部分堿基可形成互補(bǔ)配對(duì)。分別構(gòu)建含有miR-323結(jié)合位點(diǎn)的FGF9-3’UTR野生型(FGF9-WT)及FGF9-3’UTR突變型(FGF9-MUT)報(bào)告基因載體，并分別轉(zhuǎn)染miR-323或miR-con，培養(yǎng)48 h后，收集H9C2細(xì)胞，參照雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書，測(cè)定雙螢光素酶活性。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。兩組數(shù)據(jù)的比較用t檢驗(yàn)，多組間數(shù)據(jù)比較用單因素方差分析，各組均數(shù)間的兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 缺氧處理心肌H9C2細(xì)胞對(duì)miR-323和FGF9表達(dá)、細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡的影響

MTT法檢測(cè)缺氧對(duì)心肌H9C2細(xì)胞活力的影響，與0 h組相比，缺氧處理H9C2細(xì)胞12 h、24 h和48 h后，細(xì)胞活力顯著下降(P<0.05)，并呈時(shí)間依賴性，見(jiàn)圖1A。對(duì)細(xì)胞凋亡的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與0 h組相比，缺氧處理H9C2細(xì)胞12 h、24 h和48 h后，細(xì)胞凋亡率逐漸增加(P<0.05)，并呈時(shí)間依賴性，見(jiàn)圖1B。qPCR檢測(cè)缺氧對(duì)心肌H9C2細(xì)胞中miR-323表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)缺氧不同時(shí)間(12 h、24 h和48 h)較0 h組顯著增加H9C2細(xì)胞中miR-323的表達(dá)量(P<0.05)，見(jiàn)圖1C。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，缺氧不同時(shí)間(12 h、24 h和48 h)較0 h組明顯減少FGF9蛋白的表達(dá)，提高cleaved caspase-3蛋白的水平(P<0.05)，表現(xiàn)出一定的時(shí)間依賴性，見(jiàn)圖1D。

Figure 1. The effects of hypoxic exposure for different time on the viability and apoptosis of H9C2 cells. A: the viability of H9C2 cells exposed to hypoxia for different time detected by MTT assay; B: the apoptosis of the H9C2 cells exposed to hypoxia for different time analyzed by flow cytometry; C: the expression of miR-323 in the H9C2 cells exposed to hypoxia for different time detected by qPCR; D: the protein expression of FGF9 and cleaved caspase-3 in the H9C2 cells exposed to hypoxia for different time determined by Western blot. Mean±SD.n=9.*P<0.05vs0 h group.

圖1 缺氧不同時(shí)間對(duì)心肌H9C2細(xì)胞活力和凋亡的影響

2 下調(diào)miR-323表達(dá)增強(qiáng)缺氧處理心肌H9C2細(xì)胞活力和抑制細(xì)胞凋亡

qPCR檢測(cè)結(jié)果表明，與hypoxia+anti-miR-con組比較，轉(zhuǎn)染anti-miR-323顯著降低缺氧處理H9C2細(xì)胞中miR-323表達(dá)量(P<0.05)，說(shuō)明轉(zhuǎn)染成功,見(jiàn)圖2A。對(duì)細(xì)胞活力和凋亡的檢測(cè)結(jié)果顯示，下調(diào)miR-323表達(dá)較hypoxia+anti-miR-con組增強(qiáng)缺氧處理的H9C2細(xì)胞活力，降低細(xì)胞凋亡率和cleaved caspase-3蛋白的水平(P<0.05)，見(jiàn)圖2B～D。

Figure 2. The effects of anti-miR-323 transfection on the viability and apoptosis of H9C2 cells exposed to hypoxia. A: the effects of transfection with anti-miR-323 on the miR-323 expression in H9C2 cells exposed to hypoxia; B: the effects of the anti-miR-323 transfection on the viability of H9C2 cells exposed to hypoxia; C: the effects of anti-miR-323 transfection on the apoptotic rate of H9C2 cells exposed to hypoxia; D: the effects of anti-miR-323 transfection on the protein level of cleaved caspase-3 in H9C2 cells exposed to hypoxia. Mean±SD.n=9.*P<0.05vsNC group;#P<0.05vshypoxia+anti-miR-con group.

圖2 轉(zhuǎn)染anti-miR-323對(duì)缺氧處理心肌H9C2 細(xì)胞活力和凋亡的影響

3 miR-323靶向調(diào)控FGF9的表達(dá)

生物信息學(xué)信息預(yù)測(cè)FGF9的3’UTR含有與miR-323互補(bǔ)的核苷酸序列,見(jiàn)圖3A，推測(cè)miR-323對(duì)FGF9表達(dá)具有一定的調(diào)控作用。雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，miR-323明顯減弱FGF9-WT報(bào)告基因的螢光素酶相對(duì)活性(P<0.05)，而對(duì)FGF9-MUT報(bào)告基因的螢光素酶相對(duì)活性無(wú)明顯影響,見(jiàn)圖3B。轉(zhuǎn)染miR-323顯著降低FGF9蛋白表達(dá)，轉(zhuǎn)染anti-miR-323顯著提高FGF9蛋白表達(dá)(P<0.05)，見(jiàn)圖3C。

4 過(guò)表達(dá)FGF9促進(jìn)缺氧處理心肌H9C2細(xì)胞的活力和抑制細(xì)胞凋亡

與hypoxia+pcDNA組比較，轉(zhuǎn)染pcDNA-FGF9顯著促進(jìn)缺氧處理的H9C2細(xì)胞中FGF9的表達(dá)(P<0.05)，提示pcDNA-FGF9轉(zhuǎn)染成功，見(jiàn)圖4C。與hypoxia+pcDNA組比較，過(guò)表達(dá)FGF9大幅提升缺氧處理心肌細(xì)胞的存活率，見(jiàn)圖4A，減少細(xì)胞凋亡率,見(jiàn)圖4B，降低cleaved caspase-3蛋白表達(dá)的水平(P<0.05)，見(jiàn)圖4C。

5 下調(diào)FGF9表達(dá)逆轉(zhuǎn)anti-miR-323對(duì)缺氧處理心肌H9C2細(xì)胞的保護(hù)作用

與hypoxia+anti-miR-con+si-con組比較，anti-miR-323和si-FGF9共轉(zhuǎn)染顯著降低缺氧處理的H9C2細(xì)胞活力(P<0.05)，見(jiàn)圖5A，提高細(xì)胞凋亡率和cleaved caspase-3的蛋白水平，降低FGF9的蛋白水平(P<0.05)，見(jiàn)圖5B、C。

Figure 3. miR-323 specifically regulated the expression of FGF9 in the H9C2 cells. A: the 3’UTR of FGF9 contained nucleotide sequences complementary to miR-323; B: dual-luciferase reporter assay; C: the effect of miR-323 on the protein expression of FGF9 determined by Western blot. Mean±SD.n=9.*P<0.05vsmiR-con group.

圖3 miR-323靶向調(diào)控H9C2細(xì)胞FGF9的表達(dá)

Figure 4. Over-expression of FGF9 promoted the viability of H9C2 cells exposed to hypoxia and inhibited cell apoptosis. A: the changes of the cell viability; B: the changes of the apoptosis rate; C: the results of Western blot for determining the effects of FGF9 over-expression on the protein levels of FGF9 and cleaved caspase-3 in H9C2 cells exposed to hypoxia. Mean±SD.n=9.*P<0.05vsNC group;#P<0.05vspcDNA group.

圖4 過(guò)表達(dá)FGF9增強(qiáng)缺氧處理的心肌H9C2細(xì)胞活力和抑制細(xì)胞凋亡

Figure 5. The effects of FGF9 and anti-miR-323 on the viability and apoptosis of hypoxia-treated H9C2 cells. A: the effects of FGF9 and anti-miR-323 on the viability of H9C2 cells under hypoxia; B: the effects of FGF9 and anti-miR-323 on the apoptosis of hypoxic-treated H9C2 cells; C: the results of Western blot for determining the effects of FGF9 and anti-miR-323 on the protein levels of FGF9 and cleaved caspase-3 in hypoxia-treated H9C2 cells. Mean±SD.n=9.*P<0.05vsNC group;#P<0.05vshypoxia+anti-miR-con group;&P<0.05vshypoxia+anti-miR-con+si-con group.

圖5 FGF9和anti-miR-323對(duì)缺氧處理心肌H9C2細(xì)胞活力和凋亡的影響

6 miR-323調(diào)控FGF9對(duì)JNK和p-JNK蛋白水平的影響

Western blot檢測(cè)H9C2細(xì)胞中JNK和p-JNK的蛋白水平，發(fā)現(xiàn)缺氧處理、下調(diào)miR-323表達(dá)或下調(diào)FGF9表達(dá)均不影響細(xì)胞中JNK表達(dá)，但缺氧處理組和hypoxia+anti-miR-con+si-FGF9組較相應(yīng)的對(duì)照組細(xì)胞中p-JNK表達(dá)量顯著增加，下調(diào)miR-323表達(dá)較hypoxia+anti-miR-con組明顯降低缺氧處理H9C2細(xì)胞中p-JNK的蛋白水平(P<0.05)，見(jiàn)圖6。

討 論

miRNA約有22個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，通過(guò)與下游靶基因3’UTR序列特異性結(jié)合，調(diào)控基因表達(dá)，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和周期等生物學(xué)過(guò)程[10]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，miRNA在缺氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色[11-12]。高表達(dá)miR-22可以保護(hù)體外培養(yǎng)的缺氧心肌細(xì)胞損傷，提高細(xì)胞活力，減少細(xì)胞凋亡[13]。miR-145-5p可作為心肌細(xì)胞保護(hù)分子，通過(guò)調(diào)節(jié)CD40改善缺氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，減輕細(xì)胞凋亡[14]。下調(diào)miR-122保護(hù)心肌 H9C2細(xì)胞免受缺氧誘導(dǎo)的凋亡，增強(qiáng)缺氧誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞的活力[15]。本研究發(fā)現(xiàn)缺氧處理以時(shí)間依賴方式抑制H9C2細(xì)胞的活力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。miR-323在缺氧12 h、24 h和48 h處理的H9C2細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。下調(diào)miR-323表達(dá)顯著提高缺氧處理H9C2細(xì)胞活力，降低細(xì)胞凋亡率，與下調(diào)miR-122表達(dá)的作用[15]一致。另外，下調(diào)miR-323表達(dá)明顯提高缺氧處理H9C2細(xì)胞后cleaved caspase-3的水平。這些結(jié)果說(shuō)明下調(diào)miR-323表達(dá)可以保護(hù)心肌H9C2細(xì)胞免受缺氧損傷。

Figure 6. The protein levels of JNK and p-JNK in H9C2 cells detected by Western blot. Mean±SD.n=9.*P<0.05vsNC group;#P<0.05vshypoxia+anti-miR-con group;&P<0.05vshypoxia+anti-miR-con+si-con group.

圖6 Western blot檢測(cè)心肌H9C2細(xì)胞中miR-323調(diào)控FGF9對(duì)JNK和p-JNK蛋白水平的影響

FGF9是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factors，F(xiàn)GFs)家族一員，F(xiàn)GFs主要包括23個(gè)成員[16]，多個(gè)成員如FGF2、FGF19和FGF21等具有保護(hù)心肌的作用[17-20]，其中，F(xiàn)GF9與缺氧心肌細(xì)胞損傷密切相關(guān)，可能成為缺氧心肌細(xì)胞損傷的潛在治療靶點(diǎn)。FGF9在缺血缺氧心肌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，抑制FGF9表達(dá)可以促進(jìn)缺血缺氧損傷的心肌細(xì)胞凋亡；FGF9通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)通路激活來(lái)抑制心肌細(xì)胞凋亡[21]。FGF9可以拮抗小鼠糖尿病心肌梗死[22]。本實(shí)驗(yàn)中，缺氧處理H9C2細(xì)胞后，F(xiàn)GF9蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，過(guò)表達(dá)FGF9明顯增加缺氧處理H9C2細(xì)胞活力，降低細(xì)胞凋亡率和cleaved caspase-3蛋白水平，提示FGF9參與缺氧誘導(dǎo)心肌H9C2細(xì)胞損傷進(jìn)程，并且過(guò)表達(dá)FGF9可減輕缺氧心肌H9C2細(xì)胞的損傷，這與前人的研究結(jié)果[21-22]相符。

研究表明，miRNA通過(guò)靶向其下游靶基因，調(diào)節(jié)缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖、凋亡等過(guò)程，如miR-503通過(guò)靶向IGF-1R促進(jìn)缺氧條件下心肌H9C2細(xì)胞凋亡[23]，過(guò)表達(dá)miR-150通過(guò)靶向葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白-94抑制缺氧誘導(dǎo)的人心肌細(xì)胞的凋亡[24]。為了進(jìn)一步研究下調(diào)miR-323表達(dá)見(jiàn)清缺氧H9C2細(xì)胞損傷的分子機(jī)制，我們運(yùn)用生物學(xué)信息結(jié)合雙螢光素酶基因報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)FGF9是miR-323的靶基因。在細(xì)胞中上調(diào)或下調(diào)miR-323表達(dá)顯著調(diào)控FGF9表達(dá)。過(guò)表達(dá)FGF9與下調(diào)miR-323表達(dá)對(duì)缺氧處理H9C2細(xì)胞的作用結(jié)果相同。另外，下調(diào)FGF9表達(dá)逆轉(zhuǎn)了下調(diào)miR-323表達(dá)對(duì)缺氧處理H9C2細(xì)胞活力的促進(jìn)作用，以及逆轉(zhuǎn)對(duì)細(xì)胞凋亡、cleaved caspase-3蛋白水平的抑制作用，說(shuō)明FGF9是miR-323影響缺氧處理H9C2細(xì)胞凋亡的功能性靶基因。JNK信號(hào)通路是影響細(xì)胞凋亡的主要信號(hào)通路之一，當(dāng)受到外界刺激時(shí)，JNK發(fā)生磷酸化，形成p-JNK，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育和凋亡等生理過(guò)程[25-27]。缺氧復(fù)氧處理H9C2細(xì)胞p-JNK的水平升高[28]，丁香酸下調(diào)p-JNK的水平，抑制JNK信號(hào)通路活性可減輕缺氧復(fù)氧損傷后H9c2細(xì)胞凋亡[29]。miR-486通過(guò)靶向NDRG2滅活JNK/c-Jun信號(hào)通路，從而減輕缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9C2損傷[30]。本研究中，下調(diào)miR-323表達(dá)明顯抑制JNK信號(hào)通路p-JNK的水平，下調(diào)FGF9表達(dá)可逆轉(zhuǎn)這種抑制作用，表明miR-323對(duì)缺氧導(dǎo)致心肌H9C2細(xì)胞凋亡的影響與FGF9表達(dá)、JNK信號(hào)通路密切相關(guān)。

綜上所述，miR-323通過(guò)靶向調(diào)控FGF9表達(dá)，并調(diào)控JNK信號(hào)通路，從而影響缺氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞H9C2凋亡。