彭波輝， 彭 昌△， 黃麗欣， 羅孝美， 韓 笑

(遵義醫(yī)科大學(xué) 1附屬醫(yī)院兒內(nèi)科， 2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理教研室， 貴州 遵義 563000)

心肌肥厚在多種心血管疾病發(fā)生、發(fā)展過程中扮演了不可或缺的角色，是目前公認(rèn)會導(dǎo)致心力衰竭和心源性猝死的獨立危險因素[1]。近年來心肌肥厚的發(fā)病率呈持續(xù)上升的趨勢，而目前針對該病的預(yù)防及治療措施均不完善[2]，因此，尋找更合適的防治措施成為當(dāng)前的研究熱點。研究證實，心肌肥厚是由多條信號通路被激活誘導(dǎo)的，而其中備受關(guān)注的是P38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase， MAPK)信號通路[3]。P38 MAPK信號通路是絲裂原活化蛋白激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中重要組成成員之一，可調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞肥大、凋亡和炎癥等反應(yīng)[4]。證據(jù)表明，P38 MAPK信號通路在心肌細(xì)胞肥大啟動與心肌細(xì)胞肥大病理生理過程中起著重要的作用[5-6]。本課題組前期研究已經(jīng)證實組蛋白乙?；敢种苿┢針渌?anacardic acid, AA)能夠通過下調(diào)組蛋白乙?；綇亩纳票侥I上腺素(phenylephrine, PE)誘導(dǎo)的小鼠心肌肥厚，但參與調(diào)控該作用的上游信號通路仍不清楚[7]。P38 MAPK信號通路是否直接參與了漆樹酸改善心肌肥厚的作用國內(nèi)外尚未見報道。因此，本研究通過體外苯腎上腺素誘導(dǎo)小鼠心肌細(xì)胞肥大模型，觀察漆樹酸對小鼠心肌細(xì)胞肥大的抑制作用，并探討P38 MAPK信號通路在該病理生理過程中可能發(fā)揮的作用。

材 料 和 方 法

1 實驗動物

選取SPF級新生1～3 d健康昆明乳鼠120只，體重2.3～2.7 g，雌雄不限，由重慶醫(yī)科大學(xué)動物中心提供，動物許可證號為SYXK(渝) 2012-0015。

2 主要試劑與儀器

P38 抑制劑SB203580(Calbiochem);膠原酶Ⅱ、苯腎上腺素及4, 6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚(4′, 6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)均購自Sigma;胎牛血清(Gibco);抗P38及p-P38單克隆抗體(Cell Signaling Technology);抗第9位賴氨酸乙?；慕M蛋白H3(acetylated histone H3 at lysine 9, H3K9ac)和心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide,ANP)單克隆抗體及兔 lgG多克隆抗體 (Abcam)；抗Alexa Fluor 488熒光標(biāo)記山羊抗小鼠IgG 熒光Ⅱ抗(中杉金橋生物技術(shù)有限公司);抗α-actin及HRP 標(biāo)記Ⅱ抗(Proteintech);TRIzol 總RNA提取試劑盒(BioTeke);SDS-PAGE凝膠試劑盒(Beyotime);熒光定量PCR試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa);免疫共沉淀(co-immunoprecipitation，Co-IP)試劑盒(Beaver)。熒光定量PCR儀(Bio-Rad)。

3 主要實驗方法

3.1心肌細(xì)胞原代培養(yǎng) 選取新生1～3 d昆明乳鼠，在超凈工作臺上常規(guī)手術(shù)取出心室肌組織，預(yù)冷PBS液洗凈殘血，眼科剪將其剪成1～3 mm3大小的組織塊，0.05%膠原酶Ⅱ反復(fù)吹打消化2 min，沉淀后吸取上清液，重復(fù)直至組織塊被消化完全。將收集的上清液240×g離心10 min，棄上清，將沉淀與4 mL含20%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液重懸后接種到25 mL培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中差速培養(yǎng)90 min后，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，加入終濃度為0.1 mmol/L BrdU繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3.2實驗分組及細(xì)胞干預(yù) 各組藥物濃度參照文獻(xiàn)[8-10]，培養(yǎng)心肌細(xì)胞48 h后，按隨機(jī)數(shù)字表法將心肌細(xì)胞分為6組：空白對照(control)組，給予等量生理鹽水處理；溶劑對照(PE+DMSO)組，用100 μmol/L PE加等體積的DMSO作用于心肌細(xì)胞；PE組，用100 μmol/L PE作用于心肌細(xì)胞；PE+AA組，用50 μmol/L AA孵育心肌細(xì)胞 30 min 后，再加入 100 μmol/L PE; PE+AA+P38抑制劑SB203580(PE+AA+SB)組，用50 μmol/L AA和20 μmol/L SB203580同時孵育心肌細(xì)胞 30 min后，再加入100 μmol/L PE；PE+SB組，用20 μmol/L SB203580孵育心肌細(xì)胞 30 min后，再加入100 μmol/L PE。

3.3Western blot檢測 心肌細(xì)胞干預(yù)48 h后，提取各組心肌細(xì)胞漿蛋白和核蛋白，用BCA法進(jìn)行蛋白定量分析。12% SDS-PAGE分離蛋白，半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)至PVDF膜后，5% BSA封閉 2 h，分別加入兔來源單克隆抗體P38(1∶1 000)、p-P38 (1∶2 000)、H3K9ac (1∶5 000)和ANP(1∶5 000)，4 ℃ 搖床孵育過夜，TBST 洗滌 6次，每次 5 min，然后加入 HRP標(biāo)記的山羊抗兔Ⅱ抗(1∶2 000) 搖床上孵育 1 h，TBST洗滌 6 次，每次 5 min，化學(xué)發(fā)光試劑發(fā)光顯影。采用Bio-Rad圖像分析儀進(jìn)行圖像掃描；應(yīng)用Quantity One 4.4軟件進(jìn)行分析。

3.4RT-qPCR 檢測 針對肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2C(myocyte enhancer factor 2C,MEF2C)基因CDS核心編碼區(qū)設(shè)計特異性引物，引物用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計，由寶生物公司合成。將MEF2C基因產(chǎn)物進(jìn)行梯度稀釋，運用Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀擴(kuò)增，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到R2值和擴(kuò)增效率。MEF2C的上游引物序列為5′-CCTTTTCCTTTTCTGGGGACTTGTT-3′，下游引物序列為5′-TGCCGCTGTGAGCCTCTATTTG-3′，產(chǎn)物大小為176 bp;β-actin的上游引物序列為5′-CCTTTATCGGTATGGAGTCTGCG-3′，下游引物序列為5′-CCTGACATGACGTTGTTGGCA-3′，產(chǎn)物大小為289 bp。反應(yīng)條件為：94 ℃ 30 s; 94 ℃ 5 s, 60 ℃ 30 s,共40個循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參照，所得數(shù)據(jù)用PCR儀自帶的基于Pfaffl原理的相對定量數(shù)據(jù)分析軟件處理。

3.5免疫共沉淀 移去培養(yǎng)液，用結(jié)合緩沖液(含蛋白酶抑制劑)裂解細(xì)胞，混勻后置于冰上孵育10 min，4 ℃、20 000×g離心10 min，收集上清。將磁珠預(yù)處理后，分別加入p-P38抗體和H3K9ac抗體，室溫翻轉(zhuǎn)15 min，結(jié)合緩沖液洗滌3次，加入細(xì)胞裂解液4 ℃翻轉(zhuǎn)孵育過夜。結(jié)合緩沖液洗滌3次?？乖疵摚杭尤?×SDS-PAGE Loading Buffer混合均勻，95 ℃加熱 5 min，室溫下18 000×g離心10 min，收集上清液進(jìn)行Western blot檢測。

3.6免疫熒光檢測 制作細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌，0.3% Triton X-100室溫孵育20 min，PBS洗滌，山羊血清室溫封閉30 min，抗α-actin(1∶50)4 ℃孵育過夜，PBS洗滌，Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗小鼠IgG Ⅱ抗(1∶1 000)，室溫避光孵育1.5 h，PBS洗滌，DAPI染核5 min，PBS洗滌，封片劑封片，于熒光倒置顯微鏡下觀察，應(yīng)用Image-Pro Plus專業(yè)圖像分析軟件測定細(xì)胞表面積。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用 SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。多組間比較采用單因素方差分析，組間均數(shù)比較應(yīng)用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組小鼠心肌細(xì)胞中P38磷酸化水平

Western blot實驗結(jié)果顯示,在小鼠心肌細(xì)胞中，總P38的表達(dá)水平無明顯變化，而p-P38的水平在苯腎上腺素組顯著高于空白對照組(P<0.05)；P38 抑制劑處理組和漆樹酸干預(yù)組P38的磷酸化水平則顯著低于苯腎上腺素組(P<0.05)，見圖1。

Figure 1. The expression of P38 and p-P38 in the mouse myocardial cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsPE group.

圖1 小鼠心肌細(xì)胞中P38和p-P38的表達(dá)水平

2 各組小鼠心肌細(xì)胞中 H3K9ac水平

Western blot實驗結(jié)果顯示,在小鼠心肌細(xì)胞中，H3K9ac的水平在苯腎上腺素組顯著高于空白對照組(P<0.05)；而P38 抑制劑處理組和漆樹酸干預(yù)組H3K9ac水平則顯著低于苯腎上腺素組(P<0.05)，見圖 2。

3 p-P38與H3K9ac之間的相互調(diào)控作用

免疫共沉淀結(jié)果顯示,p-P38可特異性地將H3K9ac共沉淀下來，見圖3。

Figure 2. The level of H3K9ac in the mouse myocardial cells with different treatments. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsPE group.

圖2 小鼠心肌細(xì)胞組蛋白H3K9ac水平的比較

4 P38抑制劑和漆樹酸下調(diào)苯腎上腺素誘導(dǎo)的心臟發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)

RT-qPCR結(jié)果顯示，苯腎上腺素組心臟核心轉(zhuǎn)錄因子MEF2C的mRNA水平及心肌肥厚標(biāo)志物ANP的蛋白水平均顯著高于空白對照組(P<0.05)；而P38 抑制劑干預(yù)組和漆樹酸干預(yù)組MEF2C和ANP表達(dá)水平則顯著低于苯腎上腺素組(P<0.05)，見圖4。

5 P38抑制劑和漆樹酸改善苯腎上腺素誘導(dǎo)的小鼠心肌細(xì)胞肥大

免疫熒光結(jié)果表明，與空白對照組比較，苯腎上腺素組小鼠心肌細(xì)胞表面積明顯增大(P<0.05)；與苯腎上腺素組相比，P38 MAPK抑制劑組和漆樹酸組心肌細(xì)胞表面積均明顯著縮小(P<0.05)，見圖5。

討 論

心肌肥厚是多種心血管疾病共同的病理生理過程，是由多種因素刺激心肌細(xì)胞產(chǎn)生的病理反應(yīng)，主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞體積增大，蛋白合成增多[11]。早期階段表現(xiàn)為一種適應(yīng)性反應(yīng)，如果治療不當(dāng)這種適應(yīng)過程由于失代償可能逐漸發(fā)展為心力衰竭和心源性猝死,因此，尋找更為有效的治療措施具有重要的意義。研究表明，苯腎上腺素作為一種重要的神經(jīng)體液因素在心肌肥厚的病理發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用[12]。心肌細(xì)胞內(nèi)的一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在各種心血管疾病中扮演了重要角色。而在心肌肥厚中備受關(guān)注的是MAPKs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。MAPKs信號通路是真核細(xì)胞的一個重要信號系統(tǒng)，能將多種細(xì)胞外刺激信號從細(xì)胞膜傳遞至細(xì)胞核內(nèi)，從而參與調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖和肥大[13]。P38 MAPK信號通路是MAPKs家族中重要成員之一。P38磷酸化可刺激心臟核心轉(zhuǎn)錄因子MEF2C表達(dá)增加及下游肥大基因ANP表達(dá)上調(diào)，從而促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大，P38信號通路抑制劑SB203580可以阻斷該通路[14]。本課題組前期已經(jīng)證明漆樹酸能改善苯腎上腺素誘導(dǎo)的心肌肥厚[7]。在本研究中我們用苯腎上腺素誘導(dǎo)體外培養(yǎng)原代心肌細(xì)胞，探討P38 MAPK信號通路是否參與了漆樹酸改善苯腎上腺素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大。

Figure 3. Co-immunoprecipitation (CoIP) in cell lysates of mouse myocardial cells exposed to six different experimental conditions with anti-p-P38-protein G magnetic beads and immunoblot (IB) with an anti-H3K9ac or anti-p-P38 antibody for evaluation of protein expression. Input: positive control; IgG: negative control.

圖3 Co-IP檢測p-P38和H3K9ac在小鼠心肌細(xì)胞中的相互調(diào)控作用

已有研究證實，在血管緊張素Ⅱ所致大鼠心肌細(xì)胞肥大模型中，給予P38 信號通路抑制劑SB203580可有效抑制心肌肥大標(biāo)志物腦尿鈉肽(brain natriuretic peptide, BNP)的表達(dá)水平，從而使心肌肥厚癥狀得到改善[15]。本研究結(jié)果證實在苯腎上腺素誘導(dǎo)的小鼠心肌細(xì)胞肥大模型中，苯腎上腺素組P38磷酸化水平是顯著升高，而P38抑制劑和漆樹酸能明顯抑制P38磷酸化的表達(dá)水平。同時也觀察到在苯腎上腺素誘導(dǎo)小鼠心肌細(xì)胞肥大過程中H3K9乙?；揭诧@著升高，而P38抑制劑和漆樹

Figure 4. The expression of MEF2C and ANP in the mouse myocardial cells. A: the mRNA levels of MEF2C; B: the protein levels of ANP. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsPE group.

圖4 小鼠心肌細(xì)胞MEF2C mRNA和ANP蛋白的表達(dá)水平

酸能明顯抑制H3K9乙?；?，且趨勢與p-P38水平相一致。因此，我們推測p-P38與H3K9ac相互調(diào)控參與漆樹酸改善苯腎上腺素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大。為了進(jìn)一步驗證，我們應(yīng)用免疫共沉淀檢測二者之間的調(diào)控關(guān)系，結(jié)果表明p-P38與H3K9ac之間可能存在相互作用。本實驗結(jié)果也顯示，苯腎上腺素處理小鼠心肌細(xì)胞中MEF2C mRNA 表達(dá)水平顯著升高的，而P38抑制劑和漆樹酸能明顯抑制MEF2C mRNA表達(dá)水平，且變化水平與P38磷酸化水平相一致。上游心肌肥厚相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄水平變化不同于下游心肌肥厚相關(guān)基因的變化。因此我們進(jìn)一步檢測了心肌肥厚標(biāo)志物ANP的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果表明ANP的蛋白表達(dá)水平在苯腎上腺素誘

Figure 5. Mouse myocardial cell stained with immunofluorescence and statistical diagram of myocardial cell surface area. A: control group; B: PE+DMSO group; C: PE group; D: PE+AA group; E: PE+AA+SB group; F: PE+SB group. The scale bar=20 μm. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsPE group.

圖5 小鼠心肌細(xì)胞免疫熒光染色及心肌細(xì)胞表面積比較

導(dǎo)小鼠心肌細(xì)胞肥大中也顯著升高，而P38抑制劑和漆樹酸亦能明顯抑制ANP蛋白的表達(dá)。免疫熒光結(jié)果表明，苯腎上腺素能使心肌細(xì)胞表面積明顯增大，而P38抑制劑和漆樹酸能明顯減小心肌細(xì)胞表面積。以上結(jié)果均提示P38 MAPK信號通路可能參與了漆樹酸改善苯腎上腺素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大。本研究進(jìn)一步揭示漆樹酸改善心肌肥厚的具體上游信號調(diào)控機(jī)制，為肥厚型心肌病的防治提供了參考資料。但是，MAPKs家族中其他通路是否參與該病理生理過程仍不是十分清楚，尚待深入研究。