楊娟生, 叢 林, 王翠倫, 侯棟元, 周浩楠, 于士將, 成祿艷,雷 雙, 傅云梅, 程明明, 冉 春

(西南大學(xué)柑桔研究所, 重慶 400712)

等鉗蠊螨Blattisociusdentriticus屬蜱螨亞綱(Acari)囊螨科(Ascidae)，為世界性廣布種，在歐洲、亞洲、美洲等多個(gè)地區(qū)均有分布(Hughes, 1976)，在我國上海、浙江、廣東、遼寧、四川等也有發(fā)現(xiàn)(謝少遠(yuǎn)等, 2000)。潘紀(jì)文(1985)發(fā)現(xiàn)，等鉗蠊螨可在暗處大量捕食腐食酪螨Tyrophagusputrescentiae。Mashaya(2002)則發(fā)現(xiàn)該螨對嗜蟲書虱Liposcelisentomophila有一定的捕食效果。鄭大睿(2011)進(jìn)一步研究指出，等鉗蠊螨對柑橘全爪螨Panonychuscitri、腐食酪螨T.putrescentiae和茶短須螨Brevipalpusobovatus具有捕食反應(yīng)，可作為3種害螨的捕食性天敵。

由于藥劑的頻繁濫用，導(dǎo)致害螨極易產(chǎn)生抗藥性，僅依賴藥劑防治已不能從根本解決害螨猖獗問題(Khajehalietal., 2011)。1985年，忻介六引進(jìn)“以螨治螨”的生防手段并運(yùn)用在果樹上，成功利用捕食螨來防治柑橘害螨(忻介六, 1985)。隨著“雙減”要求的提出和食品安全關(guān)注度的日益提高，捕食螨的大面積推廣應(yīng)用已成為綠色農(nóng)業(yè)發(fā)展的熱點(diǎn)(徐學(xué)農(nóng)等, 2013; 汝陽等, 2017)。但由于生物防治見效慢、制約因素多等問題，現(xiàn)階段有害生物綜合治理仍需藥劑防治的輔助。但藥劑的使用，就不可避免地造成捕食螨的死亡。

為緩解化學(xué)防治和生物防治之間的矛盾，Huffaker和Kennett(1953)開發(fā)利用了抗藥性捕食螨。關(guān)注抗藥性捕食螨開發(fā)的同時(shí)，越來越多的學(xué)者致力于殺蟲劑對昆蟲(螨)的亞致死效應(yīng)的研究(Howeetal., 2015; 全林發(fā)等, 2016)。昆蟲(螨)在長期的化學(xué)農(nóng)藥亞致死劑量的選擇壓下，可發(fā)展和累積昆蟲(螨)的抗藥性(Young, 2003; 梁煒博等, 2017; Rugnoetal., 2019)。溴蟲腈和毒死蜱目前是柑橘園應(yīng)用較廣、銷量較大的殺蟲(螨)劑(鐘決龍, 2006; 孫國強(qiáng)和陸貽通, 2007)，目前尚未發(fā)現(xiàn)溴蟲腈和毒死蜱對等鉗蠊螨生長繁殖及解毒酶影響的研究。為明確農(nóng)藥亞致死劑量對等鉗蠊螨的影響，本研究選用溴蟲腈和毒死蜱作為供試藥劑，通過生物測定、生物化學(xué)和分子生物學(xué)等方法，分析比較上述兩種藥劑對等鉗蠊螨的影響，旨在為農(nóng)藥的科學(xué)使用及等鉗蠊螨的田間推廣提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

等鉗蠊螨和橢圓食粉螨Aleuroglyphusovatus均為實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)種群，且長期不接觸藥劑。

1.2 供試藥劑及主要儀器

10%溴蟲腈(chlorfenapyr)懸浮劑，購自巴斯夫歐洲公司；48%毒死蜱(chlorpyrifos)乳油，購自美國陶氏益農(nóng)公司；體視顯微鏡，購自重慶市奧特光學(xué)儀器公司；智能人工氣候箱，購自Percival公司；酶標(biāo)儀，購自Thermo Scientific公司；定量PCR儀，購自Analytik Jena公司；酶活性檢測試劑盒，購自酶聯(lián)生物公司；RNA通用提取試劑盒，購自O(shè)MEGA公司；反轉(zhuǎn)試劑盒、定量試劑盒，購自Vazyme公司。

1.3 室內(nèi)毒力測定方法

參照Van Leeuwen等(2005)的藥膜法加以改進(jìn)(下同)：將兩種藥劑分別稀釋為6個(gè)濃度梯度(溴蟲腈: 250.00, 125.00, 83.33, 62.50, 55.56和40.00 mg/L；毒死蜱: 150.00, 80.00, 75.00, 68.57, 56.47, 53.33和46.15 mg/L)，用毛筆蘸取藥劑均勻涂抹在六孔凹玻片凹槽內(nèi)壁(凹槽直徑1.5 cm，深2.2 mm)，放入通風(fēng)櫥自然晾干。每孔放入充足的橢圓食粉螨，轉(zhuǎn)接30頭健康的2-3日齡等鉗蠊螨成螨，蓋上蓋玻片，用毛筆蘸取清水涂在蓋玻片邊緣，防止逃逸。將凹玻片置于智能人工氣候箱內(nèi)(溫度25±1℃，相對濕度75%-85%，光周期14L∶10D)，24 h后，在體視鏡下檢查其死亡率。用毛筆尖輕觸螨體，無任何反應(yīng)者視為死亡。每處理3次重復(fù)，以清水處理作對照。

1.4 溴蟲腈和毒死蜱對等鉗蠊螨F0代和F1代的亞致死效應(yīng)

采用藥膜法，選用剛蛻皮6 h以內(nèi)的成螨，用溴蟲腈和毒死蜱LC10和LC30劑量處理24 h后，挑選一對活潑的雌雄成螨(F0)至一潔凈的凹槽中飼養(yǎng)，定期補(bǔ)充足量橢圓食粉螨。每隔12 h觀察雌成螨的產(chǎn)卵量和產(chǎn)卵期至其自然死亡；挑取F0代在同一天所產(chǎn)的卵30粒于另一干凈的凹玻片中，觀察其孵化率。挑取F0代同一天產(chǎn)的卵至潔凈的凹槽中飼養(yǎng)，在其蛻皮至成螨后，選取雌雄成螨(F1)各1頭，進(jìn)行配對飼養(yǎng)，記錄雌成螨壽命、產(chǎn)卵量、產(chǎn)卵期和孵化率，方法同F(xiàn)0代。每劑量30個(gè)重復(fù)，以清水處理作對照。

1.5 等鉗蠊螨解毒酶活力測定

方法與螨態(tài)選擇同1.4節(jié)，用溴蟲腈和毒死蜱LC10, LC30和LC50劑量處理盡可能多的成螨24 h后，收集活潑的成螨至新的離心管中，稱重后液氮速凍，置于-80℃超低溫冰箱中保存，用于酶活力的測定和RNA的提取。每處理3個(gè)重復(fù)，以清水處理作對照。利用酶聯(lián)免疫分析試劑盒提取、酶標(biāo)儀測定等鉗蠊螨GST, CYP450和CarE活性。

1.6 RT-PCR

從等鉗蠊螨轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(數(shù)據(jù)待發(fā)表)中篩選出17個(gè)解毒酶基因，用DNAMAN 7.0設(shè)計(jì)相應(yīng)的上下游引物(表1)，利用RT-PCR方法，評價(jià)其在溴蟲腈和毒死蜱亞致死劑量(LC10, LC30和LC50)脅迫24 h后的相對表達(dá)量，材料處理方法同1.5節(jié)。以β-actin基因作為內(nèi)參基因(GenBank登錄號: KP310115)(Wangetal., 2018)。PCR反應(yīng)體系: 2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL,正反向引物(10 μmol/L)各0.4 μL, cDNA 1.0 μL, ddH2O 8.2 μL。PCR反應(yīng)程序: 95℃預(yù)變性30 s; 95℃變性5 s, 57℃退火30 s, 循環(huán)40次； 95℃延伸15 s。以清水處理作對照。用7500 Software v2.0.6分析軟件分析和處理數(shù)據(jù)，采用2-△△Ct法計(jì)算基因的相對表達(dá)量(Pfaffl, 2001)。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用農(nóng)藥室內(nèi)生物測定數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(武漢市蔬菜科學(xué)研究所和農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所， 2006)計(jì)算致死中濃度等毒力參數(shù)；利用SPSS 20.0軟件，對各處理組間的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差顯著性分析(ANOVA, Duncan氏多重比較,P<0.05)(Huizingh, 2012)。

2 結(jié)果

2.1 溴蟲腈和毒死蜱對等鉗蠊螨成螨的亞致死劑量

溴蟲腈對等鉗蠊螨成螨的亞致死劑量LC50, LC30, LC20和LC10分別為42.56, 23.11, 15.97和9.57 mg/L，毒死蜱對等鉗蠊螨成螨的亞致死劑量LC50, LC30, LC20和LC10分別為72.42, 49.92, 39.86和29.17 mg/L(表2)。

表1 RT-PCR所用引物

表2 溴蟲腈和毒死蜱對等鉗蠊螨成螨的室內(nèi)毒力測定結(jié)果

C.L.: 置信區(qū)間Confidential limit.

2.2 溴蟲腈和毒死蜱對等鉗蠊螨的亞致死效應(yīng)

由表3和表4可知，溴蟲腈LC10和LC30劑量處理等鉗蠊螨24 h后，F(xiàn)0代雌成螨壽命分別為20.95和21.33 d，較對照(清水處理)明顯縮短；LC30劑量下產(chǎn)卵期僅為5.53 d，明顯短于對照(P<0.05)；在毒死蜱處理后F0代雌成螨壽命和產(chǎn)卵期均明顯縮短，LC30劑量下總產(chǎn)卵量明顯少于對照(P<0.05)；而LC10下則差異不顯著(P>0.05)。 兩種藥劑處理對卵孵化率無明顯影響。兩種藥劑對F1代的總產(chǎn)卵量、產(chǎn)卵期、卵孵化率和壽命均無明顯影響(P>0.05)。

表3 亞致死劑量溴蟲腈和毒死蜱對等鉗蠊螨F0代雌成螨壽命及產(chǎn)卵特性的影響

CK: 清水處理, 作空白對照Treatment with water as the blank control. 表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；同列數(shù)據(jù)后不同的小寫字母代表差異顯著(P<0.05, Duncan氏多重檢驗(yàn))。Data in the table are mean±SD, and the lowercase letters following the data in the same column represent significant differences (P<0.05, Duncan’s multiple range test). 表3和4同The same for Tables 3 and 4.

表4 亞致死劑量溴蟲腈和毒死蜱對等鉗蠊螨F1代雌成螨壽命及產(chǎn)卵特性的影響

2.3 亞致死劑量溴蟲腈和毒死蜱對等鉗蠊螨解毒酶活性影響

由表5可知，溴蟲腈和毒死蜱LC10, LC30和LC50劑量處理等鉗蠊螨24 h后，GST, CYP450和CarE 3種酶活力均有不同程度的上升。其中，溴蟲腈LC50劑量下，3種酶活力分別為752.80, 1 375.59和198.70 mIU/L，顯著高于對照(P<0.05)；而其余劑量下則無明顯差異(P>0.05)。同樣，在毒死蜱LC50劑量下，3種酶活力均顯著高于對照(P<0.05)；但LC30劑量下，CYP450酶活力1 291.85 mIU/L，顯著高于對照(P<0.05)；其余處理下3種酶活力差異不明顯(P>0.05)。

表5 亞致死劑量溴蟲腈和毒死蜱對等鉗蠊螨成蟲GST, CYP450和CarE酶活性的影響

2.4 亞致死劑量溴蟲腈和毒死蜱脅迫對等鉗蠊螨體內(nèi)解毒酶基因表達(dá)的影響

2.4.1對GST基因表達(dá)的影響：由圖1(A)可知，溴蟲腈處理下，隨著劑量增加，等鉗蠊螨BdGST3和BdGST6表達(dá)量均顯著高于對照(P<0.05)；在LC10和LC30劑量下其余GST基因表達(dá)量差異不明顯(P>0.05)，但LC50劑量下較對照明顯增加(P<0.05)。由圖1(B)可知，在毒死蜱LC10, LC30和LC503個(gè)劑量下，等鉗蠊螨BdGST1,BdGST3和BdGST4基因表達(dá)量均明顯高于對照(P<0.05)；BdGST2和BdGST6基因在LC10劑量下表達(dá)量無明顯變化(P>0.05)，但LC30和LC50劑量下較對照明顯增加(P<0.05)；BdGST5基因在LC10和LC30劑量下表達(dá)量變化不明顯(P>0.05)，而LC50劑量下相對表達(dá)量高達(dá)5.76，明顯高于對照(P<0.05)。

圖1 亞致死劑量溴蟲腈(A)和毒死蜱(B)處理下等鉗蠊螨成蟲GST基因相對表達(dá)量

2.4.2對CYP450基因表達(dá)的影響：在溴蟲腈和毒死蜱3個(gè)劑量脅迫下，等鉗蠊螨CYP450基因表達(dá)情況如圖2所示。在溴蟲腈3個(gè)劑量脅迫下，BdCYP1基因表達(dá)量較對照明顯下調(diào)(P<0.05)；BdCYP2,BdCYP3和BdCYP4基因表達(dá)量隨濃度變化均顯著上調(diào)(P<0.05)；在LC10和LC30劑量下BdCYP5和BdCYP6表達(dá)量無明顯變化(P>0.05)，但LC50劑量下上調(diào)明顯(P<0.05)(圖2: A)。毒死蜱3個(gè)劑量脅迫下，BdCYP2,BdCYP5和BdCYP6基因表達(dá)量較對照明顯上調(diào)(P<0.05)；BdCYP4基因無明顯變化(P>0.05)；BdCYP1和BdCYP4基因在LC10劑量下表達(dá)量略有下調(diào)，但無明顯差異(P>0.05)；BdCYP4基因表達(dá)量在LC30和LC50劑量下無明顯變化(P>0.05)，而BdCYP1基因表達(dá)量則在LC50劑量下明顯上調(diào)(P<0.05)(圖2: B)。

圖2 亞致死劑量溴蟲腈(A)和毒死蜱(B)處理下等鉗蠊螨成蟲CYP450基因的相對表達(dá)量

圖3 亞致死劑量溴蟲腈(A)和毒死蜱(B)處理下等鉗蠊螨成蟲CarE基因的相對表達(dá)量

2.4.3對CarE基因表達(dá)的影響：溴蟲腈和毒死蜱LC10, LC30和LC50劑量處理后5個(gè)脂酶基因表達(dá)情況如圖3所示，溴蟲腈處理下BdCarE1,BdCarE4和BdCarE5基因表達(dá)量隨濃度的增加均顯著上調(diào)(P<0.05)；BdCarE2和BdCarE3基因表達(dá)量均高于對照，在LC10劑量下分別為對照的6.97和5.62倍，但在LC30劑量開始卻出現(xiàn)下調(diào)現(xiàn)象(P<0.05)(圖3: A)。毒死蜱處理下BdCarE1基因表達(dá)量隨濃度增加明顯上調(diào)(P<0.05)；LC10處理下BdCarE4基因表達(dá)量與對照相比差異不明顯(P>0.05)，而在LC30和LC50劑量處理下表達(dá)均顯著上調(diào)(P<0.05)；BdCarE5基因表達(dá)量與對照相比無明顯差異(P>0.05)(圖3: B)。

3 討論

農(nóng)藥亞致死效應(yīng)可導(dǎo)致昆蟲(螨)的生長發(fā)育、繁殖等特性的改變(Delpuechetal., 1998)。例如，在二斑葉螨Tetranychusurticae的研究中發(fā)現(xiàn)，溴蟲腈亞致死劑量處理后，其F0代的壽命和產(chǎn)卵期出現(xiàn)縮短的現(xiàn)象(Sani Bozhganietal., 2018)。家蠶幼蟲經(jīng)溴蟲腈處理后，其F0代生長發(fā)育未受影響，但其繭層量卻顯著升高(羅雁婕等, 2011)。而利用毒死蜱LC10和LC25處理褐飛虱3齡若蟲后，其F0代和F1代卵孵化率顯著降低。在對柑橘全爪螨的研究中也發(fā)現(xiàn)，利用甲氰菊酯亞致死劑量處理其若螨后，當(dāng)代雌成螨(F0代)產(chǎn)卵量增加，其后代F1代和F2代產(chǎn)卵前期縮短，后代雌雄性比增大；而阿維菌素處理卻導(dǎo)致F0-F2代產(chǎn)卵量顯著降低(何恒果等, 2016)。本研究也證實(shí)，溴蟲腈和毒死蜱亞致死劑量處理后會導(dǎo)致等鉗蠊螨F0代雌成螨壽命和產(chǎn)卵期縮短，對F1代的壽命及產(chǎn)卵等生物學(xué)特性無明顯影響。由此可見，溴蟲腈和毒死蜱亞致死劑量短期會降低該螨的繁殖速度和防治效果，但對下一代生長繁殖無影響，不會大幅影響其種群數(shù)量變化。文中溴蟲腈的亞致死劑量值由于試驗(yàn)濃度設(shè)置偏高可能有偏差，但對后續(xù)評價(jià)無明顯影響，可為等鉗蠊螨抗性篩選及科學(xué)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

亞致死效應(yīng)不僅對昆蟲(螨)的生物學(xué)特性會有影響，也會對其體內(nèi)多種解毒代謝酶產(chǎn)生誘導(dǎo)或抑制作用(尹顯慧等, 2008; 張文成等, 2009)。在韭菜遲眼蕈蚊Bradshawodoriphaga4齡幼蟲研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)溴蟲腈LC10, LC20和LC50處理后，其GST, CarE和O-demethylation活性顯著上升(Zhaoetal., 2018)，說明溴蟲腈亞致死劑量可誘導(dǎo)這3種酶的活性。在二斑葉螨經(jīng)阿維菌素LC10和LC20處理24 h后，其GST, MFO和CarE活力均顯著高于對照(汝陽等, 2017)。認(rèn)為這3種酶在巴氏新小綏螨體內(nèi)均被誘導(dǎo)。不同藥劑脅迫對昆蟲體內(nèi)相關(guān)代謝酶影響不盡相同。用噻蟲胺LC15和LC30處理桃蚜Myzuspersicae24 h后，CarE活力較對照分別上升1.29和1.36倍，而GST的活力則被抑制(抑制率分別為11.9%和22.7%)(任學(xué)祥等, 2017)。在本研究中，溴蟲腈和毒死蜱LC50劑量處理24 h后等鉗蠊螨GST, P450和CarE活性均高于對照，在LC30劑量下P450酶活力分別為1 246.53和1 291.85 mIU/L，較對照明顯上升(P<0.05)(表5)。表明3種酶活力在受到藥劑脅迫時(shí)明顯被誘導(dǎo)，GST, P450和CarE可能是等鉗蠊螨體內(nèi)代謝或水解溴蟲腈和毒死蜱的重要酶系。

在基因表達(dá)量的研究中也證實(shí)，藥劑亞致死劑量還會影響昆蟲(螨)體內(nèi)基因表達(dá)。在二化螟Chilosuppressalis的研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)氯蟲苯甲酰胺亞致死劑量處理其5齡幼蟲后，CsGSTd1,CsGSTd2和CsGSTt1等10個(gè)GST基因表達(dá)明顯上調(diào)，表明這些基因可能參與了其對氯蟲苯甲酰胺的解毒代謝(金燕璐等, 2018)。在巴氏新小綏螨的研究中也有發(fā)現(xiàn)，經(jīng)阿維菌素LC10和LC30處理常溫品系后，發(fā)現(xiàn)其GST3,GST4,CYP1,CYP2,CarE1和CarE2基因可能參與了其對阿維菌素的解毒代謝(胡琴, 2017)。而CYP4G62,CYP6EL1和CYP9AQ1則可能在飛蝗對馬拉硫磷的解毒代謝過程中發(fā)揮重要作用(于榮榮等, 2012)。本實(shí)驗(yàn)對17個(gè)等鉗蠊螨基因在溴蟲腈和毒死蜱脅迫24 h后的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行了相對定量分析，發(fā)現(xiàn)溴蟲腈處理后BdGST3,BdGST6,BdCYP3和BdCYP4以及5個(gè)CarE基因(BdCarE1-5)表達(dá)量均顯著上調(diào)(P<0.05)，毒死蜱處理后BdGST1,BdGST3,BdGST4,BdCYP2,BdCYP3,BdCYP4,BdCarE1和BdCarE3基因表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)(圖1-3)。研究結(jié)果表明，溴蟲腈和毒死蜱亞致死劑量同時(shí)誘導(dǎo)了等鉗蠊螨多個(gè)解毒或代謝抗性基因表達(dá)上調(diào)，由此推斷，等鉗蠊螨對溴蟲腈和毒死蜱的抗性可能是一個(gè)復(fù)雜的過程，可能與多種基因表達(dá)上調(diào)有關(guān)。研究結(jié)果為進(jìn)一步研究等鉗蠊螨對溴蟲腈和毒死蜱的抗性機(jī)制提供了思路。