劉晨睿，吳勇軍，李智，張鈺華，王丹慧，吳娟

1.吉首大學醫(yī)學院，湖南吉首416000；2.南華大學附屬湘潭醫(yī)院(湘潭市第一人民醫(yī)院)病理科，湖南湘潭411100；3.中南大學湘雅醫(yī)院臨床藥理研究所，湖南長沙410000；4.南華大學附屬湘潭醫(yī)院(湘潭市第一人民醫(yī)院)腫瘤內科，湖南湘潭411100

腫瘤是摧毀人類健康的“殺手”，我國每年因為惡性腫瘤而死亡、殘疾的人數(shù)約為130萬人，治療惡性腫瘤的費用也是家庭難以承受之重。目前針對惡性腫瘤的特效藥尚未問世，及早發(fā)現(xiàn)并預防惡性腫瘤對于提升我國公民健康水平和降低醫(yī)療負擔具有重要意義。腫瘤的發(fā)生是一個漸進式的過程，多種基因和信號通路參與其中。線粒體通過持續(xù)不斷地“融合分裂再融合再分裂”循環(huán)，確保細胞完成正常的分裂過程。腫瘤細胞的產生源于細胞分裂活動強于細胞融合活動，使得細胞內線粒體處于片段化狀態(tài)。

深入研究線粒體參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的全過程，有助于為針對線粒體的靶向治療提供理論依據(jù)和實驗支撐。線粒體分裂異常導致腫瘤發(fā)生與MAPK信號通路激活有關。該文通過RNA對DAPK2基因進行靶向沉默，探討DAPK2基因表達與腫瘤發(fā)生的相關性以及DAPK2基因表達與膠質瘤細胞增殖、侵襲的相關性。

1 DAPK2結構與功能

DAPK2(死亡相關蛋白激酶2)基因位于人體染色體12p11.21區(qū)，是典型的蘇氨酸蛋白激酶，由鈣調蛋白(CAM)進行調節(jié)。DAPK2基因編碼蛋白分子質量為15 Kda，能夠轉錄成熟的mRNA全長為2.4 Kmb。DAPK2隸屬于死亡相關蛋白激酶家族[1](DAPK、DRP-1/DAPK2、Dlk/ZIPK、DRAK1和DRAK2)，是典型的可溶性胞漿蛋白、核蛋白。DAPK2基因是Dynein超家族一員，在線粒體分裂體系中起到重要作用。DAPK2基因具有GTPase結構域[2](Dy namin_domain)、中間區(qū)(middle_domain)和效應結構域(Effector_domain)。DAKP2基因在維持介導線粒體融合/分裂動態(tài)平衡方面起到關鍵作用，是核心因素之一。

國外學者[3-5]經過研究發(fā)現(xiàn)，DAPK2基因能夠介導胚胎發(fā)育所不可或缺的線粒體分裂活動。Fis1(線粒體分裂蛋白)是DAPK2的線粒體受體，其胞漿內含有“N端結構域”，其線粒體外膜上含有“C-端跨膜結構域”并形成穩(wěn)定的超螺旋結構，F(xiàn)is1通過超螺旋結構與其他蛋白質互動。DAPK2基因在自然狀態(tài)下主要駐留在胞漿之內，當駐留在線粒體外膜的Fis1蛋白感應到線粒體發(fā)生分裂后：①Fis1自動將胞漿內含有的DAPK2基因進行收集并放置到線粒體外膜，經過生化反應后形成寡聚體；②這些寡聚體大部分聚集在線粒體潛在分裂位點，并形成指環(huán)狀結構。由于水解GTP擠壓線粒體膜，這些指環(huán)狀結構的寡聚體集合最終發(fā)生斷裂并產生2個相互獨立的線粒體；③DAPK2基因最終重新駐留在胞漿之內。步驟①、②、③循環(huán)反復，形成一個持續(xù)的過程。

DAPK2基因的活性組件位于中間區(qū)(middle_domain)，其它與線粒體分裂相關的蛋白體對于活性組件的定位具有重要作用。研究人員可以通過抑制內源性DAPK2基因表達可以抑制線粒體分裂并提升線粒體集合網絡化程度；通過S-亞硝基化、泛素化和磷酸化等方式調整DAPK2基因的活性水平。研究人員通過大量實驗確認DAPK2基因與腫瘤發(fā)生存在強關聯(lián)，DAPK2在常見的腫瘤組織或者腫瘤細胞(如結腸癌、甲狀腺嗜酸性細胞癌、胰腺癌和膠質瘤等)中普遍存在過表達現(xiàn)象，研究人員可以使用基因沉默技術降低DAPK2基因表達水平，削弱惡性細胞的侵襲能力和增值能力，誘導惡性細胞逐步調亡[6-10]。

2 DAPK2抑癌基因與機體免疫和腫瘤發(fā)生的相關性

2.1 腫瘤成因概述

腫瘤是目前危害人類健康最嚴重的三大疾病之一。每年全球約800萬人死于惡性腫瘤，《中國腫瘤登記年報》顯示我國每年因各類腫瘤死亡病例約達270萬，且其發(fā)病率有逐年增高的趨勢。腫瘤發(fā)生是一個非常復雜的生物過程，涉及到多個生物信號通路、多個步驟和多種類基因的共同參與。腫瘤活性氧自由基(ROS)生成、腫瘤能量代謝故障、抵抗細胞凋零和組織浸潤轉移等都需要線粒體的參與，腫瘤治療可以使用以線粒體為靶向治療目標的全新策略[11]。線粒體是典型的細胞器，處于復雜的動態(tài)變化之中。線粒體不斷地啟動融合/分裂的循環(huán)，以最大限度地適應并滿足細胞內環(huán)境變更和細胞持續(xù)的能量需求，研究這種動態(tài)循環(huán)過程的學科叫做線粒體動力學(mitochondrial_dynamics)。在穩(wěn)定環(huán)境下線粒體的融合/分裂循環(huán)處于動態(tài)平衡狀態(tài)，當融合/分裂循環(huán)因為外力原因被打破之后，線粒體形狀會因為循環(huán)失衡發(fā)生形狀上的變化，形態(tài)不同的線粒體在功能上也會呈現(xiàn)區(qū)別。國內外大量研究證實[12]，線粒體分裂/融合循環(huán)被打破可以導致腫瘤、肥胖、Parkinson病癥和阿爾茨海默病癥(Alzheimer_disease)等多種疾病的發(fā)生。

圖1 DAPK2基因甲基化率和常見腫瘤Figure 1 DAPK2 gene methylation rate and common tumors

2.2 DAPK2基因表達與腫瘤發(fā)生的相關性

腫瘤細胞的線粒體分裂/融合循環(huán)處于失衡狀態(tài)，一般體現(xiàn)為“強分裂、弱融合”的特征（分裂活動大于融合活動），失衡循環(huán)導致細胞內線粒體呈現(xiàn)片段化狀態(tài)。抑制腫瘤細胞侵襲和增值的關鍵在于糾正線粒體分離/融合失衡狀態(tài)，讓線粒體分裂受到抑制。國內外研究人員[13-15]通過實驗發(fā)現(xiàn)，MAPK信號通路的激活可能會導致線粒體分裂異常使得正常細胞異化為腫瘤細胞。

線粒體融合/分裂循環(huán)動態(tài)平衡的關鍵因子是DAPK2基因，DAPK2基因的異常表達和腫瘤發(fā)生具有強關聯(lián)。我們可以采用慢病毒介導的shRNA干擾技術使得DAPK2基因表達處于沉默狀態(tài)，通過對比實驗去研究[shRNA-DAPK2]對腫瘤細胞的生物學行為有怎樣的影響。整個實驗步驟可以分為如下幾步：①RNA干擾實驗材料準備。使用qPCR監(jiān)測MKN-45/BCG-823/AGS/MKN-28/SGC-7901/CES-1細胞株中[DAPK2-mRNA]的表達水平，選擇[DAPK2-mRNA]表達水平較高的細胞株MKN-45/BGC-823用于RNA干擾實驗。②干擾序列篩選。將構建好的[shRNA-DRP1]慢病毒載體注入到MKN-45細胞株和BGC-823細胞株，在qPCR內源選取有效靶點，從干擾序列中篩選效率最高的KD3序列。③比對實驗。采用多種實驗手段(劃痕愈合實驗、克隆形成實驗、MTT實驗、流式細胞術和Transwell侵襲實驗等)，研究在腫瘤細胞增殖、侵襲、遷移、凋亡等生物學行為中DAPK2基因的作用。

通過比對實驗可以證明，DAPK2基因在組織或細胞中的陽性表達和腫瘤發(fā)生存在有效關聯(lián)，抑制腫瘤細胞侵襲和增值可以從抑制DAPK2基因表達方面入手，誘導腫瘤細胞逐步凋亡。BCG-823/MKN-45細胞株在感染[shRNA-DAPK2]慢病毒載體之后，DAPK2基因表達被沉默，細胞侵襲、細胞遷移和細胞增殖等生物學行為均受到抑制，G2/M期細胞凋亡率和細胞數(shù)增高。在移植瘤模型實驗中發(fā)現(xiàn)DAPK2基因被沉默之后移植瘤重量減輕、體積縮小。

細胞在相關指令基因的精準控制下，可以發(fā)生程序性、自主行的死亡行為，這種受控的生物學行為稱作細胞凋亡(apoptosis)。腫瘤細胞形成的主要原因就是正常的細胞凋亡行為受到阻礙。治療腫瘤的常見策略就是通過各種技術手段誘導腫瘤細胞主動凋亡。Cleaved_caspase_3是凋亡信號通路的重要執(zhí)行者、核心凋亡效應分子和細胞凋亡早期標志，Cleaved_caspase_3是以酶原形式存在的Caspases-3的激活形式。通過Western_blot檢測發(fā)現(xiàn)，Cleaved_caspace_3表達明顯升高的細胞其凋亡率隨之明顯升高，從側面正面DAPK2基因被沉默之后，細胞凋亡率和Caspases_3存在強關聯(lián)。

國內外研究者通過體內實驗和體外細胞實驗發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞的遷移、侵襲、自噬和凋亡等生物學行為和DAPK2基因存在強關聯(lián)。通過回歸臨床樣本檢測挖掘臨床病例指標、預后與DAPK2基因表達的關系，得到如下結果:①DAPK2基因在腫瘤組織中過表達，隨著TNM分期基站和淋巴結轉移，DAPK2基因表達陽性比率也隨之升高；②患者生存幾率和DAPK2基因陽性表達存在強的負相關聯(lián)系；③通過qPCR監(jiān)測發(fā)現(xiàn)非腫瘤區(qū)域組織的[DAPK2-mRNA]表達水平遠遠低于腫瘤組織[DAPK2-mRNA]表達水平。

在真核細胞中存在自噬(autophagy)現(xiàn)象，該現(xiàn)象屬于一種保守的細胞生物學行為。自噬相關基因(Atg)通過生物指令控制溶酶體降解活動清除受損細胞器和大部分細胞內聚物，降低細胞應急壓力的同時，維持細胞內環(huán)境平衡。腫瘤細胞通過激活自噬行為實現(xiàn)“廢物再循環(huán)利用”，為自身生存提供一部分必須的營養(yǎng)物質。DAPK2基因參與線粒體分裂行為的調節(jié)，DAPK2表達被抑制后，線粒體自噬也隨之受到抑制。

2.3 DAPK2基因與膠質瘤細胞增殖、侵襲的相關性

膠質瘤細胞在不受控制的條件下具有強大的侵襲生長能力。生物活細胞內循環(huán)重塑的動態(tài)平衡是由肌動蛋白細胞骨架參與維持的，動態(tài)平衡的基礎是細胞信號傳導控制平衡和肌動蛋白絲可塑性平衡。腫瘤細胞維持強大的侵襲生長能力的“密碼”就是細胞膜褶皺和細胞偽足，它們均依托肌動蛋白細胞骨架而生長。微絲中F-action以聚合態(tài)形式呈現(xiàn)，G-action以游離態(tài)形式呈現(xiàn)，它們共同組成細胞肌動蛋白。細胞肌動蛋白除了維持細胞基礎形態(tài)這一核心功能之外，在細胞凋亡、細胞遷移、細胞黏附和細胞應力纖維生成等生理過程中也發(fā)揮關鍵作用。

國內學者[16]通過Transwell侵襲性實驗發(fā)現(xiàn)，將膠質瘤細胞內DAPK2基因做沉默處理之后，F(xiàn)-action細胞褶皺和細胞偽足數(shù)量明顯減少,免疫熒光范圍縮小且著色強度降低，細胞整體侵襲能力明顯削弱。實驗結果顯示，siDRP1組細胞穿過基質膠細胞數(shù)為（88±1.2）個，對照組的穿過細胞數(shù)為（290±2.2）個(P<0.05)。實驗結果證明DAPK2基因能夠提升多種腫瘤細胞(如肺癌細胞、卵巢癌細胞、甲狀腺腫瘤細胞、大腸癌細胞和食管鱗狀癌細胞等)的侵襲能力。

肌動蛋白細胞骨架重塑的關鍵因子是RHOA/ROCK通路調節(jié)。ROCK在細胞凋亡、氧自由基產生和盈利纖維形成(由RHOA參與介導)等生物學行為中均發(fā)揮重要作用，其中ROCK1在細胞骨架組裝過程中發(fā)揮重要作用。國內學者通過免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)lag條帶無法在單獨轉染HA-DAPK2或Flag-RHOA質粒的細胞樣本中被檢測到；Flag條帶能夠在共轉染HA-DAPK2或Flag-RHOA質粒的細胞樣本中被檢測到，這說明DAPK2基因和RHOA/ROCK通路之間可能存在交互作用，但是這種交互作用的詳細機理還沒有完全揭開。實驗結果表明，在使用siRNA迫使DAPK2基因表達沉默之后，ROCK1蛋白和RHOA蛋白的表達水平明顯下降，膠質瘤細胞表面褶皺和細胞偽足的數(shù)量也隨之下降，腫瘤細胞增殖受到明顯抑制。DAPK2基因能夠提升RHOA/ROCK2通路活性水平，促進肌動蛋白細胞骨架重塑并提升叫膠質瘤細胞侵襲能力。

3 總結與展望

DAPK2基因表達水平與腫瘤發(fā)生存在強關聯(lián)，通過技術手段將DAPK2基因沉默后能夠抑制腫瘤細胞的侵襲、增值和遷移，并誘發(fā)腫瘤細胞的自我凋亡，減輕腫瘤癥狀。隨著國內外對DAPK2結構功能分析的精度不斷提高，對于各類生物學行為機制研究的深入和完善，必將為腫瘤的靶向治療提供更多的選擇藥物和治療方式。