魏世剛 曾光群 彭倩 陳艷

據(jù)WHO調(diào)查顯示[1]，2012年全世界范圍內(nèi)罹患乳腺癌的患者約有170萬(wàn)，其中與乳腺癌相關(guān)的死亡人數(shù)為50萬(wàn)。美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)[2]（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）乳腺癌臨床實(shí)踐指南中提出，手術(shù)及術(shù)前放、化療依然是可切除乳腺癌的主要治療手段。人表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epithelial growth factor receptor-2，HER-2）陽(yáng)性乳腺癌約占所有乳腺癌的20%～30%[3，4]，HER-2陽(yáng)性乳腺癌具有分化程度低、侵襲性高、預(yù)后差等特點(diǎn)，成為難治性乳腺癌分型之一。蒽環(huán)類化療是HER-2陽(yáng)性乳腺癌的主要方法之一，李迅等[5]報(bào)道稱HER-2陽(yáng)性乳腺癌較HER-2陰性乳腺癌更能從蒽環(huán)類化療中獲益。有絲分裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）是調(diào)控HER-2/MEK/MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的蛋白激酶，能夠介導(dǎo)HER-2陽(yáng)性乳腺癌高增殖、高轉(zhuǎn)移和高復(fù)發(fā)；而MAPK磷酸化（pMAPK）是激活此信號(hào)通路的關(guān)鍵[6，7]。本研究通過(guò)檢測(cè)新行輔助化療的HER-2陽(yáng)性乳腺癌MAPK蛋白及磷酸化程度，探討MAPK信號(hào)通路相關(guān)分子對(duì)乳腺癌新輔助化療療效及預(yù)后的評(píng)估價(jià)值，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

資料與方法

1 一般資料 選擇2010年5月～2012年5月本院收治的83例HER-2陽(yáng)性乳腺癌患者作為研究對(duì)象，均為女性，年齡23～68歲，平均（47.3±5.1）歲；按照美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)[8]（American Joint Committee on Cancer，AJCC）乳腺癌TNM分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分為ⅡA期17例，ⅡB期39例，ⅢA期18例，ⅢB期9例。所有患者均接受FEC（表柔比星+氟尿嘧啶+環(huán)磷酰胺）新輔助化療：靜脈滴注表柔比星80 mg/m2，第1天；靜脈滴注氟尿嘧啶500 mg/m2，第1天；靜脈推注環(huán)磷酰胺600 mg/m2，第1天，化療21 d為1個(gè)周期；患者接受2～4個(gè)化療周期后休息1周行手術(shù)治療，包括保乳手術(shù)11例，乳腺癌改良根治術(shù)37例，乳腺癌根治術(shù)35例。術(shù)中切除乳腺組織和癌旁組織，并制成病理切片保存待檢。

2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者術(shù)前經(jīng)空芯針穿刺活檢證實(shí)為HER-2陽(yáng)性乳腺癌；②初治單側(cè)乳腺癌患者，術(shù)前未接受放療、化療或內(nèi)分泌等治療；③臨床資料完整；④治療方案得到患者及家屬同意，并簽署知情同意書(shū)。

2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：①雙側(cè)乳腺癌；②既往接受過(guò)其他抗癌治療者；③術(shù)前明確有臨床遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；④凝血機(jī)制異常、近3個(gè)月大型手術(shù)史或合并全身嚴(yán)重感染者。

3 方法

3.1 組織MAPK、pMAPK蛋白檢測(cè)：將術(shù)中收集的癌旁組織和癌組織切片，置于-20℃冰箱保存待檢。采用免疫組化染色檢測(cè)組織MAPK、pMAPK蛋白表達(dá)：二甲苯脫蠟、乙醇梯度洗脫，PBS沖洗3次；加入枸櫞酸緩沖液（0.01 mol/L），微波抗原修復(fù)，3%H2O2孵育5 min消除內(nèi)源性過(guò)氧化酶。加入3%山羊血清封閉液體，37℃孵育10 min棄去封閉液；分別滴加1∶2 000的小鼠抗人MAPK單克隆抗體（購(gòu)自上海士鋒生物科技有限公司）和1：500的兔抗人pMAPK單克隆抗體（購(gòu)自上海新肽生物科技有限公司），4℃孵育24 h。加入FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG作為二抗，37℃孵育50 min，DAB顯色液顯色，自來(lái)水反復(fù)沖洗，復(fù)染，封片。結(jié)果判定：由兩位病理科醫(yī)生采用盲法閱片，顯微鏡下隨機(jī)選擇10個(gè)視野，采用半定量法[9]進(jìn)行評(píng)分；染色強(qiáng)度：無(wú)染色代表0分，淺色代表1分，棕黃色代表2分，深色代表3分。著色細(xì)胞所占百分比：染色細(xì)胞＜5%代表0分，染色細(xì)胞5%～25%代表1分，染色細(xì)胞26%～50%代表2分，染色細(xì)胞51%～75%代表3，染色細(xì)胞＞75%代表4分；以染色強(qiáng)度×染色細(xì)胞百分比作為總分，其中總分0分代表陰性，1～4分代表弱陽(yáng)性。5～8分代表陽(yáng)性，9～12分代表強(qiáng)陽(yáng)性；總分≥1分代表蛋白表達(dá)陽(yáng)性。

3.2 組織MAPK、pMAPK mRNA檢測(cè)：取約50 mg樣本組織，達(dá)成勻漿，選用Trizol試劑盒提取勻漿總RNA，提取方法按照試劑盒說(shuō)明書(shū)；采用紫外分光光度法、5%瓊脂糖電泳檢測(cè)總RNA完整性。在逆轉(zhuǎn)錄體系中加入0.5 μg總RNA，37℃反應(yīng)60 min合成cDNA，再將總反應(yīng)物94℃滅活5 min，-20℃保存待檢。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)組織MAPK、pMAPK mRNA表達(dá)水平，引物委托武漢博士德生物工程有限公司合成，MAPK上游：5＇-GGGTCAAAGATCACGTGCACAG-3＇，下游：5＇-TTGTCAAAGCAGACGGAGGTC-3＇，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度216bp；pMAPK 上游：5＇-CGGAAGACTGTGTCGAGCAA-3＇，下游：5＇-GGATCAAGCGCACTGTGGA-3＇，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度195bp；GAPDH 上游：5＇-GGTGAACGTGCGTCTCAAGC-3＇，下游：5＇-GTCGGTGGTGGAAGATCGTC-3＇，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度121 bp。PCR反應(yīng)體系：DNA提取物1 μL，10×buffer 2.5 μL，dNTP 0.5 μL，Taq酶1 μL，延伸體系2 μL，ddH2O 15 μL，上下游引物各0.5 μL，總反應(yīng)體系23 μL。反應(yīng)條件：96℃預(yù)變性1 min；95℃變性60 s，60℃退火30 s，72℃延伸60 s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃ 10 min；以GAPDH為內(nèi)參照進(jìn)行校正，計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

3.3 臨床資料收集與療效評(píng)價(jià)：以患者年齡、手術(shù)方式、臨床分期、月經(jīng)、雌激素受體、MAPK、pMAPK表達(dá)等作為觀察指標(biāo)，單因素分析影響乳腺癌化療療效的因素，再將變量指標(biāo)代入Cox回歸模型，分析影響化療療效的危險(xiǎn)因素。術(shù)后6周采用參考RECIST 1.1版實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[10]對(duì)化療療效進(jìn)行評(píng)價(jià)，完全緩解（CR）：所有目標(biāo)病灶消失；部分緩解（PR）：基線病灶長(zhǎng)徑總和縮小≥30%；進(jìn)展（PD）：基線病灶長(zhǎng)徑總和增加≥30%或出現(xiàn)新病灶；穩(wěn)定（SD）：基線病灶長(zhǎng)徑總和有縮小但未達(dá)PR或有增加但未達(dá)PD；其中臨床有效=CR+PR。

3.4 隨訪：本研究對(duì)83例乳腺癌患者進(jìn)行隨訪，化療結(jié)束第2天開(kāi)始，觀察患者無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間，定義無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間為乳腺癌確診之日至患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時(shí)間；隨訪截止日期為2015年7月31日。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，率的比較采用χ2檢驗(yàn)或fishers確切概率法；患者生存分析采用Kaplan-Meier法，組間比較采用Log-Rank test；多因素采用Cox回歸模型進(jìn)行分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 癌組織與癌旁組織MAPK、pMAPK蛋白表達(dá) 免疫組化染色顯示，癌組織MAPK、pMAPK蛋白表達(dá)均顯著高于癌旁組織，兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1、圖1。

表1 乳腺癌組織與癌旁組織MAPK、pMAPK蛋白表達(dá)[n（%）]

2 癌組織與癌旁組織MAPK、pMAPK mRNA表達(dá)RT-PCR法檢測(cè)顯示，癌組織MAPK、pMAPK mRNA相對(duì)表達(dá)量（0.879±0.173和0.613±0.057）均高于癌旁組織（0.743±0.078和0.287±0.031），兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。

3 療效評(píng)價(jià) 83例乳腺癌患者中，CR 15例占18.1%，PR 45例占54.2%，SD 22例占26.5%，PD 1例占1.2%，臨床有效共計(jì)60例占72.3%。

4 影響新輔助化療療效的單因素分析 單因素分析顯示，化療療效與年齡、手術(shù)方式、臨床分期、絕經(jīng)狀態(tài)、雌激素狀態(tài)無(wú)關(guān)；MAPK、pMAPK蛋白陽(yáng)性患者臨床有效率顯著低于MAPK、pMAPK陰性患者（P＜0.05），見(jiàn)表2。

5 新輔助化療療效的多因素分析 多因素分析顯示，MAPK、pMAPK蛋白陽(yáng)性表達(dá)是影響乳腺癌化療療效的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P均＜0.05），見(jiàn)表3。

6 MAPK、pMAPK蛋白表達(dá)與生存預(yù)后的關(guān)系 全組83例患者均獲得隨訪，隨訪時(shí)間8～43個(gè)月，中位隨訪時(shí)間25.9個(gè)月；隨訪期間復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移17例，總死亡時(shí)間10例，73例患者存活。MAPK陽(yáng)性患者3年無(wú)復(fù)發(fā)生存率為41.8%，MAPK陰性患者為60.7%，MAPK陽(yáng)性3年無(wú)復(fù)發(fā)生存率低于MAPK陰性（χ2=11.037，P=0.000）；pMAPK陽(yáng)性患者3年無(wú)復(fù)發(fā)生存率為39.1%，pMAPK陰性患者為58.7%，pMAPK陽(yáng)性3年無(wú)復(fù)發(fā)生存率顯著低于MAPK陰性（χ2=4.103，P=0.041），見(jiàn)圖2。

表2 單因素分析影響新輔助化療療效的因素

表3 肝癌預(yù)后影響因素單因素分析

討 論

手術(shù)及術(shù)前化療被認(rèn)為是具有手術(shù)指征的乳腺癌患者治療的首選方案，然而并非所有乳腺癌患者均能取得滿意的化療療效。臨床調(diào)查顯示[11]，約有35%～55%的乳腺癌患者化療反應(yīng)性不佳，導(dǎo)致化療失敗，甚至因治療延誤而使患者錯(cuò)過(guò)最佳治療時(shí)間窗，因此準(zhǔn)確評(píng)估化療療效對(duì)及時(shí)調(diào)整治療方案具有重要的指導(dǎo)意義。HER-2陽(yáng)性乳腺癌約占所有乳腺癌的20%～30%。劉夏等[12]報(bào)道乳腺癌細(xì)胞內(nèi)HER-2基因過(guò)表達(dá)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜上HER-2蛋白產(chǎn)生過(guò)多，進(jìn)而引起腫瘤細(xì)胞快速增殖，增加腫瘤細(xì)胞的侵襲性，因此HER-2陽(yáng)性乳腺癌也被認(rèn)為是預(yù)后差的一種乳腺癌類型。國(guó)外研究證實(shí)[13]，HER-2/MEK/MAPK信號(hào)通路與HER-2陽(yáng)性乳腺癌預(yù)后差有關(guān)，HER-2/MEK/MAPK信號(hào)通路被激活，會(huì)介導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞高增殖、高侵襲、高復(fù)發(fā)等惡性生物學(xué)行為。梁紅玲等[14]對(duì)HER-2陽(yáng)性乳腺癌給予曲妥珠單抗靶向治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MAPK信號(hào)通路異?；罨癕APK磷酸化與乳腺癌細(xì)胞耐藥、后期復(fù)發(fā)密切相關(guān)。本研究顯示，癌組織MAPK、pMAPK蛋白表達(dá)顯著高于癌旁組織，癌組織MAPK、pMAPK mRNA相對(duì)表達(dá)量亦顯著高于癌旁組織，說(shuō)明HER-2陽(yáng)性乳腺癌MAPK處于高活化狀態(tài)，MAPK磷酸化程度顯著升高。國(guó)外亦有學(xué)者[15]認(rèn)為MAPK及MAPK磷酸化狀態(tài)能夠作為HER-2陽(yáng)性乳腺癌化療耐藥的評(píng)估依據(jù)之一。

研究顯示[16]，HER-2陽(yáng)性乳腺癌較HER-2陰性乳腺癌更能從蒽環(huán)類新輔助化療中獲益。含蒽環(huán)類或紫杉醇的新輔助化療藥物依然是我國(guó)治療HER-2陽(yáng)性乳腺癌的首選藥物。蒽環(huán)類化療藥物能夠特異性地抑制細(xì)胞內(nèi)拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ，使腫瘤細(xì)胞DNA復(fù)制受阻。然而臨床上依然發(fā)現(xiàn)約有10%以上HER-2陽(yáng)性乳腺癌患者對(duì)蒽環(huán)類化療藥物無(wú)效[17]，此類患者若繼續(xù)給予原有化療方案，不僅使治療無(wú)效，甚至?xí)?dǎo)致治療延誤。MAPK是以脯氨酸為導(dǎo)向的絲蘇氨酸激酶，當(dāng)受到絲裂原刺激能夠介導(dǎo)MAPK活化，并磷酸化一系列下游信號(hào)分子，如JNK、c-fos、c-myc等，參與調(diào)控細(xì)胞的增殖和分化。國(guó)外最近一項(xiàng)研究證實(shí)[18]，蒽環(huán)類藥物亦有抑制MAPK磷酸化激酶的作用。體外培養(yǎng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)[19]，蒽環(huán)類藥物通過(guò)抑制MAPK磷酸化，降低下游磷酸化的級(jí)聯(lián)效應(yīng)，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖抗原Ki-67的表達(dá)，達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖的目的。本研究的多因素分析顯示，MAPK、pMAPK表達(dá)水平是影響乳腺癌化療療效的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示MAPK信號(hào)通路中關(guān)鍵分子MAPK、pMAPK均可以作為評(píng)估HER-2陽(yáng)性乳腺癌化療療效的指標(biāo)。王晶晶等[20]證實(shí)，對(duì)于部分HER-2陽(yáng)性乳腺癌患者，其本身MAPK磷酸化程度不高，導(dǎo)致蒽環(huán)類藥物抑制磷酸化和細(xì)胞增殖作用相對(duì)較低，這可能是HER-2陽(yáng)性乳腺癌對(duì)蒽環(huán)類新輔助化療療效不佳的原因。這也間接證實(shí)了MAPK、pMAPK作為評(píng)估化療療效的潛在臨床價(jià)值。

本研究對(duì)83例患者進(jìn)行隨訪，結(jié)果顯示MAPK蛋白陽(yáng)性、pMAPK蛋白陽(yáng)性患者無(wú)復(fù)發(fā)生存率均顯著縮短，提示MAPK、pMAPK表達(dá)與患者生存預(yù)后負(fù)相關(guān)。Zhang等[21]報(bào)道，作為HER-2/MEK/MAPK信號(hào)通路關(guān)鍵基因，MAPK活化和磷酸化對(duì)整個(gè)信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)、激活至關(guān)重要。MAPK活化和磷酸化后，能夠磷酸化多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，起到類似磷酸化“瀑布”作用，進(jìn)而介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的增殖、分化。Luo等[22]也證實(shí)MAPK、pMAPK表達(dá)增加使MAPK信號(hào)通路活化，乳腺癌細(xì)胞內(nèi)緊密連接蛋白表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)，從而影響患者預(yù)后。聯(lián)合本研究結(jié)果，可以初步認(rèn)為MAPK、pMAPK亦可以作為HER-2陽(yáng)性乳腺癌生存預(yù)后的評(píng)估指標(biāo)。當(dāng)然，本研究隨訪時(shí)間較短，僅觀察了患者無(wú)復(fù)發(fā)生存期，其對(duì)遠(yuǎn)期總生存期的評(píng)估價(jià)值依然待進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，MAPK、pMAPK表達(dá)與HER-2陽(yáng)性乳腺癌患者化療療效及預(yù)后有關(guān)；MAPK通路相關(guān)分子MAPK、pMAPK可以作為HER-2陽(yáng)性乳腺癌患者化療療效及生存預(yù)后的評(píng)估指標(biāo)之一。