馬會博 杜晶晶

肺癌是最常見的肺原發(fā)性惡性腫瘤，多在40歲以上發(fā)病，在男性中的發(fā)病率多于女性[1]。其中非小細胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）為肺癌的主要類型，臨床表現(xiàn)主要為隱匿起病、迅速發(fā)展，大部分患者在確診以后已進入晚期，預后的生存期短[2，3]。若NSCLC在發(fā)生早期時就能診斷出，并將病灶完全切除，可顯著提高患者的5年生存率。NSCLC的發(fā)病因素較多，但具體機制還未明確[4]。影像學技術在NSCLC早期篩查中未能顯示出良好的效果，且診斷效果易受到主觀因素的影響。一般的病理學檢驗是對肺癌的組織樣本進行檢驗，使得患者受到創(chuàng)傷，且組織樣本的收集較復雜[5，6]?，F(xiàn)代研究表明DNA甲基化在細胞癌變過程中發(fā)揮重要作用，DNA甲基化可細胞周期、DNA修復，致癌物代謝，細胞黏附，凋亡等，誘導惡性腫瘤的發(fā)展[7，8]。有研究顯示，在NSCLC患者，抑癌基因啟動子區(qū)CpG島呈現(xiàn)不同程度的甲基化，并由此出現(xiàn)轉錄沉默[9-11]。所以，對DNA甲基化分子標志物進行檢測，有利于深刻了解NSCLC的發(fā)生發(fā)展機制，在診斷早期腫瘤時提供參考。本文探討血DNA甲基化分子標志物水平對肺癌轉移特征的相關性，現(xiàn)報道如下。

資料與方法

1 研究對象 于2015年1月～2018年2月，采用回顧性方法，選擇在本院診治的NSCLC患者78例作為觀察組（病理學診斷為NSCLC），同期選擇在健康體檢者100例作為對照組。納入標準：兩組入選者均知情同意；NSCLC患者術前未經(jīng)放療、化療；臨床與檢測資料完整；倫理委員會審批通過本次研究。排除標準：患者不具備完整的臨床資料；哺乳期、妊娠期婦女；心腎功能不健全的患者；有出血傾向、出血性疾病的患者。

觀察組中男50例，女28例；平均年齡（55.25±11.11）歲；平均體重指數(shù)（22.19±2.93）kg/m2；平均病程（5.22±1.48）年；腫塊大?。骸? cm 40例，＜3 cm 38例；淋巴結轉移32例，遠端轉移20例；組織學類型：腺癌38例，鱗癌40例。對照組中男60例，女40例；平均年齡（55.11±9.82）歲；平均體重指數(shù)（22.88±2.11）kg/m2。兩組在體重指數(shù)、性別等方面的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2 血液標本采集 取兩組入選者的空腹靜脈血5 mL，用真空采血管檸檬酸鈉收集，在采血2 h以內(nèi)將血漿分離。于4℃ 3 000 g，首次離心10 min取上層血漿；4℃ 8 000 g 第2次離心15 min獲得無血細胞成分的純血漿，分裝后置于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

3 DNA甲基化分子標志物檢測 采用血液基因組DNA提取試劑盒獲得血液樣本DNA，采用PCR法擴增目的基因，候選基因為DAPK和MGMT基因。MGMT基因甲基化的上游引物表現(xiàn)出的序列是：5'-CTGCCCTACTTATGGATGGG-3'，而下游引物的序列是5’-CTGGATTGTAGCAGATCATGC-3'。DAPK基因甲基化上游引物序列為：5'-CCATGTACGTTGCTATCCAG-3'，下游引物序列為5'-CCCCAAGGCCAACCG'。將β-actin（519 bp）做內(nèi)參，引物由上海生工公司合成，DAPK和MGMT基因擴增片段為193 bp和198 bp。

PCR擴增：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，72℃時延伸30 s～1 min，55℃時退火25～30s，35次循環(huán)；72℃時延伸10 min，4℃下保存，對PCR擴增產(chǎn)物，分析瓊脂糖凝膠電泳結果。若甲基化引物擴增有條帶（凝膠電泳有條帶）說明該樣本發(fā)生了甲基化。

4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS20.00軟件，使用均數(shù)±標準差（ ±s），采用t檢驗，計數(shù)數(shù)據(jù)以構成比表示，采用χ2檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 DAPK和MGMT甲基化水平對比 觀察組中血漿樣本DAPK和MGMT甲基化比例為51.3%和53.8%，對照組分別為14.0%和15.0%，以觀察組高于對照組（P＜0.05）。見表1與圖1、2。

2 相關性分析 在觀察組中，血漿DAPK和MGMT甲基化與病理組織學類型、淋巴結轉移、遠端轉移的相關性有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表1 兩組血漿樣本DAPK和MGMT甲基化水平對比（n）

討 論

NSCLC是臨床常見的惡性腫瘤之一，其死亡人數(shù)超過了乳腺癌、結腸癌、前列腺癌的總和，當前在我國發(fā)病率和死亡率均呈明顯上升趨勢[12]。該病的發(fā)病年齡高峰在60～79歲，男女之比為2.13∶1。雖然通過藥物、放射及手術可以治療早期肺癌，然而5年存活率始終低于20%。尤其是NSCLC存在腫塊過大、多發(fā)病灶等癥狀，導致術后極易復發(fā)，因此，這就需要增強臨床早期診斷[13，14]。早期用于NSCLC診斷的方法多為胸部X線等影像學方法，雖然檢出的敏感性高，但是特異性差，很難降低NSCLC的死亡率。病理學檢查對于患者的創(chuàng)傷較大，早期篩查效果不太適合[15，16]。

表2 血漿DAPK和MGMT甲基化與NSCLC患者病理學特征的相關性（n=78）

伴隨分子生物技術飛速發(fā)展，在早期診斷NSCLC時，可以提供特異性分子標志物。特別是NSCLC從不具備侵襲發(fā)展到侵襲性需要較長時間，而此期間就為NSCLC提供了診斷窗口[17]。所謂DNA甲基化是指DNA甲基的轉移酶對生物體起到催化作用，將s-腺苷甲硫氨酸當作甲基供體，把甲基轉移至特定堿基這一過程[18]。通常在腫瘤的形成過程中發(fā)生DNA甲基化，特別是DNA甲基化作為分子標志物可以經(jīng)PCR法擴增；其也可以從遠離腫瘤的外周組織中分離出來，也使診斷NSCLC成為可能。本研究觀察組中血漿樣本DAPK和MGMT甲基化比例為51.3%和53.8%，對照組分別為14.0%和15.0%，觀察組高于對照組（P＜0.05）。MGMT作為DNA修復酶，是最近才被發(fā)現(xiàn)的新酶，能夠引起化劑化療類藥物的失效或失敏，在腫瘤細胞中有較高表達，引起肺癌細胞及組織對烷化劑類藥產(chǎn)生耐藥性，進而對治療及預后效果產(chǎn)生影響[19]。在腫瘤細胞中，MGMT分子包含烷基受體2個，能夠接納烷基化損傷的DNA中6-烷基鳥嘌呤包含的烷基，對于被烷基化鳥嘌呤起到修復作用，對DNA交聯(lián)形成起到限制，繼而削弱細胞毒[20]。死亡有關的蛋白激酶（DAPK）能夠有效調節(jié)細胞凋亡，定位于人染色體9q3411，其蛋白定位于肌動蛋白微絲中，而生物學作用大多與細胞凋亡密切相關，能夠利用多條通路對細胞凋亡起到誘導作用[21]。

由于診斷技術限制，在診斷NSCLC時，大部分患者已進入中晚期，術后的5年生存率一直徘徊在15%左右[22]。DNA甲基化是NSCLC發(fā)生發(fā)展階段的早期事件[23]。且極易獲取外周血，外周血游離DNA的甲基化檢測可作為早期檢測的最佳介質，NSCLC患者血漿的游離DNA出現(xiàn)甲基化，將血漿游離DNA作為檢查介質時，欠缺組織特異性。本研究顯示，觀察組中血漿DAPK和MGMT甲基化與病理組織學類型、淋巴結轉移、遠端轉移有相關性（P＜0.05）。DAPK基因是一種調節(jié)細胞凋亡的正向調控因子，其甲基化可以導致DAPK基因表達下降或失活，在細胞凋亡與疾病發(fā)生過程中起重要作用[24]。MGMT基因作為修復基因，能夠修復受損DNA，該基因的甲基化能夠使表達下調，誘發(fā)惡性腫瘤的發(fā)生[25]。不過本研究也存在一定的缺陷，如樣本數(shù)目不夠，將在下一步研究中擴大樣本量，以提高結果的科學性，同時通過高通量的手段篩選出更有價值的分子標志物。

綜上所述，DAPK和MGMT甲基化與NSCLC患者病理特征有明顯相關性。