黃寧珍 蘇江 冼康華 付傳明 龔慶芳 黃惠錦 何金祥

摘 要：該文以青錢柳幼嫩莖段為外植體，研究其種苗快速繁殖技術(shù)。結(jié)果表明：青錢柳最佳采樣時(shí)間為4月—6月，最佳外植體為輕微木質(zhì)化莖段;最佳的外植體表面消毒方法為用0.1% HgCl2浸泡5～7 min，消毒成功率54.1%，無(wú)菌外植體存活率88.7%;初代芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg培養(yǎng)40 d，最高生根率83.3%;生根苗較適合的移栽基質(zhì)為泥碳土，較好的移栽季節(jié)為3月—5月和10月—11月，移栽后在遮光度70%的大棚中培養(yǎng)40 d，移栽成活率為54.3%～65.6%。該研究為其優(yōu)良無(wú)性系的規(guī)?；庇於ɑA(chǔ)。

關(guān)鍵詞：青錢柳，幼嫩莖段，快速繁殖

Abstract：Cyclocarya paliurus is a unique fast-growing tree in China and a mono species of Cyclocarya genus in Juglandaceae family. It has important medical value and is honored as “the third tree in the medical field”. But its seedling breeding is difficult and inefficient. Therefore，tissue culture and rapid propagation of Cyclocarya paliurus were studied by using the young stem segments as explants. The results were as follows：The optimal sampling time of explants was from April to June. The best explants for tissue culture were the slight lignification stem segments. And the best explants surface disinfection method was to soak stem segments in 0.1% HgCl2? for about 5-7 min. The success rate of disinfection was 54.1% and the survival rate of aseptic explants was 88.7%. The medium of MS+6-BA 2.0 mgCultivated 40 d in this medium，and the highest rooting rate was 83.3%. The suitable transplanting matrix for rooting seedlings was slimy soil，and the best transplanting seasons were the periods from March to May and from October to November. After transplanting，the rooting seedlings were cultured for 40 d in a greenhouse with a shade of 70%，and the survival rates were 54.3%-65.6%. This work would lay a foundation for large-scale breeding of its superior clones.

Key words：Cyclocarya paliurus，young stem segments，rapid propagation

青錢柳（Cyclocarya paliurus）是胡桃科青錢柳屬單種屬植物，又名搖錢樹(shù)、麻柳等，是第四紀(jì)冰川幸存下來(lái)的珍稀樹(shù)種，我國(guó)獨(dú)有的單種屬喬木植物和國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)瀕危植物之一。青錢柳被譽(yù)為植物界的大熊貓，醫(yī)學(xué)界的第三棵樹(shù)，據(jù)記載，青錢柳的樹(shù)皮、樹(shù)葉具有清熱解毒、止痛等功能，用于治療頑癬，民間用其葉制成保健茶飲用已有約200 a歷史（中國(guó)藥材公司，1994; 付燕等，2017）。青錢柳富含多糖、黃酮類化合物、齊墩果酸、萜類化合物、有機(jī)酸、生物堿以及甾醇等多種有效成分（李俊等，2008; Li et al.，2008; 唐梅等，2017），具有降血糖、降血壓、降血脂、增加機(jī)體免疫力、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤等作用（韓澄等，2009; 唐梅等，2017; 鄒榮燦等，2018）。目前，青錢柳制成的保健茶，不僅在國(guó)內(nèi)得到廣大消費(fèi)者認(rèn)可，并得到美國(guó)食品與藥品管理局、日本厚生省和德國(guó)衛(wèi)生部的認(rèn)可，是我國(guó)第一個(gè)獲得美國(guó) FDA 認(rèn)證的保健茶產(chǎn)品（謝明勇和謝建華，2008）。

現(xiàn)有的青錢柳不僅資源數(shù)量少，而且大多零星分布于深山老林和自然保護(hù)區(qū)中，可供利用的資源有限，嚴(yán)重制約了青錢柳的研究、開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。青錢柳種子具有硬質(zhì)種皮和深度休眠雙重特性，種子敗育嚴(yán)重，空殼率在90%左右，一般播種后需隔年才能萌發(fā)，自然發(fā)芽率低（0.1%～0.5%）（徐慶和宋蕓娟，2004）;青錢柳扦插育苗普遍存在插穗生根難、生根率不高等問(wèn)題（李先民等，2014; 何志國(guó)，2016）;少數(shù)獲得較高的生根率，但長(zhǎng)出的根為肉質(zhì)根，其移栽成活率相當(dāng)?shù)?，到目前為止還未被廣泛應(yīng)用于林業(yè)生產(chǎn)（童方平等，2016; 姚甲寶和曾平生，2017）。

目前，關(guān)于青錢柳的組培快繁研究報(bào)道雖然不多（上官新晨等，2006; 謝寅峰等，2009，2011，2012; 魯萌等，2013; 王紀(jì)等，2016; 付燕等，2017; 張文泉等，2018），但均獲得不錯(cuò)的效果和獨(dú)到的發(fā)現(xiàn)，為后續(xù)研究提供了良好的科學(xué)參考，如王紀(jì)等（2016）的研究結(jié)果表明，青錢柳莖段的初代誘導(dǎo)和繼代增殖無(wú)需使用高濃度激素培養(yǎng)基。但是，在這些研究中，仍存在實(shí)驗(yàn)規(guī)模小，繼代材料質(zhì)量不理想，生根率低等問(wèn)題。針對(duì)這些問(wèn)題，本研究以青錢柳幼嫩莖段為外植體，對(duì)其種苗組培快繁的全過(guò)程進(jìn)行系統(tǒng)研究，為進(jìn)一步完善青錢柳種苗組培快繁技術(shù)體系提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料及消毒方法

植物材料：用于實(shí)驗(yàn)的青錢柳種源來(lái)自于湖北五峰山。采樣株為定植于廣西植物研究所內(nèi)2～3 a的植株。于每年的4月—6月和8月—10月采樣。采樣部位為帶5～6個(gè)腋芽的嫩枝。

外植體處置和消毒：將采回的青錢柳嫩枝去掉葉片后，用0.1%～0.2%的洗衣粉水浸泡約5 min，用自來(lái)水沖洗干凈，將材料轉(zhuǎn)至超凈工作臺(tái)，剪成帶1個(gè)腋芽、長(zhǎng)3～5 cm的節(jié)段;將未木質(zhì)化（頂端1～2芽）和輕微木質(zhì)化（頂芽以下第3～第5芽）的材料分類消毒。消毒時(shí)先用75%酒精浸泡30 s;再用0.1%HgCl2浸泡5～7 min和8～10 min;取出后用無(wú)菌水漂洗4～5次;之后放置到無(wú)菌不銹鋼盤中，剪掉兩端傷口，保留2～4 cm的帶腋芽莖段，接種到初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。培養(yǎng)14 d后，統(tǒng)計(jì)消毒污染率和存活率（表1）。污染率=污染的外植體數(shù)/總外植體數(shù)×100%;存活率=存活的無(wú)菌外植體數(shù)/（總外植體數(shù)-污染的外植體數(shù)）×100%。

1.2 培養(yǎng)基制備及篩選

初代培養(yǎng)基：以MS和WPM為基本培養(yǎng)基;通過(guò)初步的預(yù)實(shí)驗(yàn)，按10∶1的比例，添加6-BA （1.0、2.0、4.0、8.0 mg

通過(guò)觀測(cè)統(tǒng)計(jì)不同培養(yǎng)基芽誘導(dǎo)率及芽苗生長(zhǎng)情況，篩選出最佳初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方。芽誘導(dǎo)率=（萌芽的外植體數(shù)/消毒成功的外植體數(shù)）×100%。

繼代增殖培養(yǎng)基：以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度和組合的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，附加蔗糖30 gpH 5.8;所用的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑包括6-BA、KT、ZT、IBA、NAA、IAA和TIBA（三碘苯鉀酸）（表3，表4）。篩選增殖系數(shù)高、繼代芽苗健壯、效果穩(wěn)定的繼代增殖和壯苗培養(yǎng)基配方。

生根培養(yǎng)基：以1/2MS和1/2WPM為基本培養(yǎng)基，添加不同種類、濃度和組合的IBA、NAA、IAA、DA-6（己酸二乙氨基乙醇酯，又名胺鮮脂）和5-NGS（5-硝基愈創(chuàng)木酚鈉）;附加蔗糖20 g5.8（表5和表6）。篩選合適的生根培養(yǎng)基配方。

上述每次實(shí)驗(yàn)每個(gè)處理10～60瓶。培養(yǎng)基配制分裝后，于125 ℃滅菌25 min，冷卻待用。

1.3 接種和培養(yǎng)

初代接種：為防交叉感染，每瓶接種1個(gè)外植體。繼代接種：當(dāng)芽苗長(zhǎng)到3～5 cm時(shí)，將再生芽分成單芽，剪掉葉片后切成含1個(gè)腋芽節(jié)段，接種于繼代培養(yǎng)基上，每瓶8～10個(gè)接種點(diǎn)，培養(yǎng)時(shí)間30～40 d。生根接種：選擇高度4.5 cm以上、植株健壯的繼代芽苗，從基部剪下，整株接入生根培養(yǎng)基中，每瓶接種8～10株，培養(yǎng)時(shí)間30～40 d。培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度為（28±3） ℃，光照時(shí)間為10～12 h·d-1，光照強(qiáng)度為30～40 μmol·m-2·s-1。

1.4 生根苗煉苗移栽

當(dāng)青錢柳組培苗長(zhǎng)出2～5條根、根長(zhǎng)2.0 cm以上時(shí)，將生根瓶苗開(kāi)蓋煉苗3～5 d，洗凈植株根部附著的培養(yǎng)基，在1 000倍的“枯萎根腐特效靈—噁霉·嘧啶·申嗪”溶液中消毒2～3 min;用該藥劑噴灑消毒移栽基質(zhì)（園土、泥碳土和椰糠）后，裝于營(yíng)養(yǎng)杯中，栽種上青錢柳生根苗，在蔭蔽度70%的大棚中培養(yǎng)，注意保持環(huán)境及基質(zhì)濕度，每周噴上述藥劑預(yù)防病害。40 d后統(tǒng)計(jì)移栽成活率（表7）。根據(jù)不同移栽基質(zhì)、移栽季節(jié)的移栽成活率，確定適合青錢柳組培苗移栽的基質(zhì)和時(shí)間。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

外植體消毒處理與初代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)每個(gè)處理60瓶，重復(fù)3次;繼代與生根培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)每個(gè)處理10瓶，重復(fù)3次。所有數(shù)據(jù)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體采集及消毒

比較不同采樣時(shí)間、外植體部位和消毒時(shí)間對(duì)青錢鉚消毒成功率和存活率的影響（表1）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：（1）在8月—10月份采樣，不論是頂芽、未木質(zhì)化莖段或輕微木質(zhì)化莖段，也不論消毒時(shí)間長(zhǎng)短，污染率均較高，為67.6%;且所有的外植體在后續(xù)的培養(yǎng)過(guò)程中全部褐化死亡。（2）在4月—6月份采樣，頂芽及未木質(zhì)化莖段為外植體，消毒后2～3 d內(nèi)全部褐化死亡。而輕微木質(zhì)化莖段為外植體，消毒5～7 min，污染率45.9%，存活率高達(dá)88.7%;輕微木質(zhì)化莖段消毒8～10 min，污染率43.9%，褐化死亡率增多，存活率下降至65.3%。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，5～7 min和8～10 min的消毒處理，污染率差異不明顯，但存活率差異較大。綜上所述，青錢鉚外植體最佳的采集時(shí)間為4月—6月;最佳外植體部位為輕微木質(zhì)化莖段;最佳消毒方法為0.1% HgCl2浸泡5～7 min。

2.2 初代培養(yǎng)

將經(jīng)表面消毒的青錢柳輕微木質(zhì)化莖段接種于不同初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基上（表2），培養(yǎng)3周后發(fā)現(xiàn)，在以MS和WPM為無(wú)機(jī)鹽的培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)，但以MS為無(wú)機(jī)鹽的培養(yǎng)基的芽誘導(dǎo)率和芽苗高度均優(yōu)于WPM。培養(yǎng)基中的6-BA和IBA在低濃度（1.0～2.0 mg-1+0.1～0.2 mg時(shí)芽苗生長(zhǎng)較快;在高濃度（8.0 mg-1+0.8 mg時(shí)，腋芽萌發(fā)和芽苗生長(zhǎng)均顯著受到抑制?？傮w上看，青錢柳在初代培養(yǎng)階段耐受的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度范圍較寬，在6-BA 1.0～4.0 mg

+ IBA 0.1～0.4 mg濃度范圍內(nèi)，初代芽誘導(dǎo)率均在40.0%以上，其中，以MS+6-BA 2.0 mg+IBA 0.2 mg培養(yǎng)基的初代誘導(dǎo)效果最好，芽誘導(dǎo)率和芽苗高度均達(dá)到最高，分別為80.5%和3.5 cm（表2，圖1：A），可以作為初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

2.3 繼代增殖及壯苗培養(yǎng)

2.3.1 初步繼代增殖培養(yǎng)研究 根據(jù)初代培養(yǎng)結(jié)果設(shè)計(jì)表3培養(yǎng)基，青錢柳初步繼代增殖培養(yǎng)結(jié)果如下：（1）青錢柳比較適合在含有6-BA+IBA或6-BA+IAA激素組合的培養(yǎng)基上生長(zhǎng);但在誘導(dǎo)叢生芽方面，前者優(yōu)于后者。（2）當(dāng)6-BA濃度為0.5～2.0 mg、IBA或IAA濃度為0.05～0.2 mg時(shí)，所誘導(dǎo)的再生芽以單芽為主;在6-BA濃度為4.0 mg時(shí)，所誘導(dǎo)的再生芽中有一定數(shù)量的叢生芽，但玻璃化比較嚴(yán)重。（3）青錢柳在繼代增殖培養(yǎng)基中易玻璃化，當(dāng)培養(yǎng)基中6-BA≥1.0 mg、IBA或IAA濃度在0.1 mg以上時(shí)，隨著激素濃度升高和培養(yǎng)代數(shù)增多，玻璃化程度越加嚴(yán)重（圖1：B）。（4）以KT或ZT代替6-BA，產(chǎn)生大量愈傷組織，無(wú)法誘導(dǎo)出下一代芽苗。（5）以NAA代替IBA或IAA，誘導(dǎo)的愈傷過(guò)多，雖能誘導(dǎo)出芽苗，但隨著培養(yǎng)進(jìn)程的后延，芽苗逐漸黃化。因此，可用于青錢柳繼代培養(yǎng)的激素組合和濃度為6-BA 0.5 mg+IBA 0.05 mg，在此條件下所誘導(dǎo)的再生芽以單芽為主，增殖系數(shù)偏低，為3.5/35 d，但芽苗高壯，培養(yǎng)35 d，平均苗高為6.0 cm（表3，圖1：C，D），適用于生根前的壯苗培養(yǎng)。

2.3.2 后續(xù)繼代增殖培養(yǎng)研究 初步的繼代增殖培養(yǎng)研究表明，相對(duì)適合于青錢柳繼代增殖的培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg+IBA 0.05 mg，但增殖系數(shù)偏低，為3.5/35 d。因此，在后續(xù)的繼代增殖培養(yǎng)研究中，在低濃度范圍內(nèi)，通過(guò)調(diào)整6-BA和IBA比例，并向培養(yǎng)基中添加TIBA，在有效控制玻璃化的前提下，提高叢生芽的誘導(dǎo)率和增殖系數(shù)（表4）。通過(guò)綜合分析，得到如下結(jié)果：

（1）經(jīng)過(guò)多次繼代培養(yǎng)后，培養(yǎng)基中的6-BA濃度相對(duì)較高（1.0 mg）時(shí)，再生芽苗長(zhǎng)勢(shì)偏弱，玻璃化率高達(dá)70%，增殖系數(shù)低;6-BA濃度過(guò)低（0.2 mg）時(shí)，雖未出現(xiàn)玻璃化，但芽苗普遍矮小，增殖系數(shù)也較低; 當(dāng)6-BA濃度為0.5 mg時(shí)，芽苗高壯，無(wú)玻璃化苗，增殖系數(shù)相對(duì)較高，說(shuō)明6-BA 0.5 mg是維持青錢柳繼代苗正常生長(zhǎng)的細(xì)胞分裂素濃度水平。

（2）在6-BA∶IBA為20∶1、5∶1和10∶1的培養(yǎng)基中，前兩者的叢芽率、芽苗高度和增殖系數(shù)均低于后者。因此，合適的6-BA和IBA比例應(yīng)為10∶1。

（3）在相對(duì)較高的6-BA（1.0 mg）和IBA（0.1 mg）濃度下，添加TIBA后，合適的6-BA、IBA和TIBA濃度配比（1.0∶0.1∶0.04）玻璃化率比較低，僅為20.5%; 而不合適的配比則使玻璃化

率增高 （1.0∶0.1∶0.06玻璃化率為80.0%，1.0∶0.1∶0.02玻璃化率為100%）?？梢?jiàn)，玻璃化苗的產(chǎn)生不僅與培養(yǎng)基中各個(gè)激素的絕對(duì)濃度有關(guān)，更與激素之間的濃度配比相關(guān)，合適的激素配比能夠在很大程度上阻抑玻璃化的產(chǎn)生。

（4）在適合6-BA（0.5 mg）和IBA（0.05 mg）濃度下，添加TIBA 0.01～0.05 mg后，當(dāng)TIBA為0.01、0.03、0.04、0.05 mg時(shí)，叢芽誘導(dǎo)率為65.0%～82.3%，但芽苗相對(duì)較弱，玻璃化率為4.0%～38.6%，增殖系數(shù)偏低（4.0～5.0 / 35 d）;當(dāng)TIBA為0.02 mg時(shí)，叢芽誘導(dǎo)率高達(dá)80.5%，芽苗較壯，培養(yǎng)35 d平均高度為4.5 cm，無(wú)玻璃化苗，增殖系數(shù)為7.0/35 d（表4，圖1：E，F(xiàn)），在這一條件下連續(xù)繼代10代以上，均獲得良好且穩(wěn)定的效果。說(shuō)明6-BA、IBA和TIBA合適的濃度水平及配比為0.5∶0.05∶0.02。

綜合所述兩個(gè)階段的繼代增殖培養(yǎng)研究結(jié)果得出，青錢柳的最佳繼代增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg+IBA 0.05 mg+TIBA 0.02 mg，在此培養(yǎng)基中培養(yǎng)35 d，3～5芽的叢生芽誘導(dǎo)率為80.5%，芽苗健壯，平均苗高為4.5 cm，長(zhǎng)期繼代玻璃化率為0，增殖系數(shù)為7.0/35 d;最佳壯苗培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg+IBA 0.05 mg+蔗糖30.0 g（pH 5.8），培養(yǎng)35 d，長(zhǎng)出的芽苗高大健壯，無(wú)玻璃化，平均苗高為6.0 cm，適用于生根前的壯苗培養(yǎng)。

2.4 生根培養(yǎng)

以1/2MS和1/2WPM為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度IBA、NAA或IAA，篩選能夠誘導(dǎo)青錢柳生根的基本培養(yǎng)基及生長(zhǎng)素種類和濃度（表5），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以1/2MS為基本培養(yǎng)基添加不同濃度IBA不能誘導(dǎo)青錢柳生根。而1/2WPM為基本培養(yǎng)基添加不同濃度IBA、NAA或IAA誘導(dǎo)生根存在差異，其中NAA在0.5～4.0 mg的濃度范圍內(nèi)誘導(dǎo)的生根率為0，且隨著濃度增高愈傷增多、褐化嚴(yán)重;IAA在0.5～4.0 mg的濃度范圍，均能不同程度誘導(dǎo)生根，當(dāng)濃度為2.0 mg時(shí)，生根率最高，為20.0%;IBA在0.5～4.0 mg的濃度范圍內(nèi)，均能不同程度誘導(dǎo)生根，其中，當(dāng)IBA為1.5 mg時(shí)生根率最高，為55.2%。另外，以不同濃度的IBA和IAA組合誘導(dǎo)生根，生根率不僅未見(jiàn)提高，反而有所下降。在生根培養(yǎng)過(guò)程中，

所有的處理均出現(xiàn)不同程度的焦葉現(xiàn)象，焦葉率為28%～50%，焦葉率會(huì)隨著IBA、NAA或IAA濃度的升高有所提升，但未導(dǎo)致植株死亡。綜合表5結(jié)果，青錢柳相對(duì)比較適合的生根培養(yǎng)基配方為1/2WPM+IBA 1.5 mg，但在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在此培養(yǎng)基中進(jìn)行生根誘導(dǎo)，不同的實(shí)驗(yàn)批次起伏波動(dòng)較大，最高生根率僅為55.2%。

以1/2WPM+IBA 1.5 mg為基礎(chǔ)，添加特殊促生根試劑DA-6（己酸二乙氨基乙醇酯）和5-NGS（5-硝基愈創(chuàng)木酚鈉），進(jìn)一步開(kāi)展青錢柳組培苗生根誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)（表6），以獲得更高的生根效率。從表6結(jié)果發(fā)現(xiàn)：IBA 1.5 mg與不同濃度的DA-6組合使用，在DA-6所試的濃度范圍內(nèi)（1.0～8.0 mg），青錢柳組培苗的生根率最高僅為6.9%，遠(yuǎn)低于單獨(dú)使用IBA 1.5 mg的生根率。而IBA 1.5 mg與不同濃度5-NGS組合使用，當(dāng)5-NGS濃度低于2.0 mg、高于8.0 mg時(shí)，青錢柳組培苗的生根率較低（低于22.0%）;當(dāng)5-NGS濃度在3.0～5.0 mg時(shí)，其促生根效果與IBA有一定程度的疊加作用，其中促生根效果最佳的濃度組合為IBA 1.5 mg+5-NGS 4.5 mg，誘導(dǎo)的生根率達(dá)到83.3%，明顯高于單獨(dú)使用IBA 1.5 mg時(shí)的生根率54.6%。因此，適合青錢柳的生根培養(yǎng)基為1/2WPM+IBA 1.5 mg+5-NGS 4.5 mg，培養(yǎng)40 d，生根率為83.3%，植株健壯、長(zhǎng)勢(shì)良好、焦葉率有所下降（圖1：I，J）。但后續(xù)的生根培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證明，在這一培養(yǎng)基中，同樣存在不同批次實(shí)驗(yàn)生根率起伏波動(dòng)較大的現(xiàn)象，其中生根率最高的培養(yǎng)季節(jié)為11月底至12月底。

2.5 生根苗煉苗移栽

青錢柳喜溫暖潮濕、土層深厚肥沃、排水良好的酸性土壤環(huán)境。根據(jù)這些生長(zhǎng)習(xí)性，分別選擇疏松園土、泥碳土和椰糠為移栽基質(zhì)，在3月—6月和9月—11月進(jìn)行移栽（表7）。移栽40 d后觀測(cè)并統(tǒng)計(jì)成活率。從表7結(jié)果發(fā)現(xiàn)：泥碳土和椰糠為移栽基質(zhì)的移栽成活率明顯高于園土;不同的移栽季節(jié)成活率差異較大，其中較好的移栽季節(jié)為3月—5月和10月—11月，在此期間移栽，成活率為54.3%～65.6%，移栽40 d后小苗長(zhǎng)出新根新葉，苗高8～10 cm（圖1：K）。

3 討論與結(jié)論

外植體采集時(shí)間和部位對(duì)青錢柳初代培養(yǎng)十分重要。王紀(jì)等（2016）研究發(fā)現(xiàn)，4月采樣莖段腋芽萌發(fā)率最高，8月以后采樣萌發(fā)率降為0。付燕等（2017）研究發(fā)現(xiàn)青錢柳莖段培養(yǎng)最佳取樣時(shí)間為5月，頂芽下1、2 段萌芽率最高。在本研究中，4月至6月中旬采樣，以輕微木質(zhì)化莖段為外植體，0.1%的升汞消毒5～7 min，可獲得較好的消毒效果，消毒成功率和成活率分別為54.1%和88.7%;

而8月份以后采樣，無(wú)論用任何消毒及培養(yǎng)方法，所有的外植體均逐漸褐化死亡，成活率和初代芽誘導(dǎo)率均為0。值得注意的是，青錢柳在消毒過(guò)程中容易褐化死亡，褐化死亡率與升汞處理時(shí)間呈正相關(guān)，因此消毒時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。

在青錢柳的初代誘導(dǎo)培養(yǎng)中，不同的研究者所用培養(yǎng)基不同，獲得的結(jié)果差異也較大。付燕等（2017）用改良MS+TDZ 0.5 mg+NAA 0.05 mg培養(yǎng)基，可獲得57.1%的芽萌發(fā)率;謝寅峰等（2011）用WPM+6-BA 3.0 mg+2ip 1.0 mg+NAA 0.1 mg培養(yǎng)基，可獲得83.3%的芽萌發(fā)率;魯萌等（2013）研究發(fā)現(xiàn)在合適的培養(yǎng)基中，青錢柳腋芽萌芽率可達(dá)86%。本研究在正確的采樣季節(jié)和采樣部位的前提下，以MS+6-BA 2.0 mg+IBA 0.2 mg為初代培養(yǎng)基，可獲得80.5%的初代芽誘導(dǎo)率，青錢柳初代培養(yǎng)對(duì)基本培養(yǎng)基及激素種類和濃度要求并不嚴(yán)格，適應(yīng)范圍較寬。

在繼代增殖培養(yǎng)中，魯萌等（2013）研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基WPM+TDZ 0.3 mg+6-BA 0.3 mg對(duì)青錢柳的增殖效果最佳，增殖系數(shù)為6.8/20 d;胡冬南等（2009）用細(xì)胞分裂素ZT得到了大量增殖芽;尚旭嵐（2007）等通過(guò)離體胚培養(yǎng)誘導(dǎo)出叢生芽，增殖系數(shù)最高為3.45; 張金鳳和方升佐（2012） A. 初代誘導(dǎo)獲得的再生芽; B. 玻璃化苗; C，D. 繼代培養(yǎng)獲得的單生芽; E，F(xiàn). 繼代培養(yǎng)獲得的叢生芽;G，H. 健壯的繼代瓶苗; I，J. 生根苗; K. 移栽小苗。

A. Regeneration shoot developed from stem segment during initial culture; B. Vitrification buts; C，D. Single shoots from subculture;? E，F(xiàn). Clustered shoots from subculture; G，H. Strong shoots from subculture; I，J. Rooting plantlets; K. Transplanted seedlings.以及魯萌等 （2013）雖然獲得高達(dá)6.71和6.78的增殖系數(shù)，但芽很小，芽基部均包裹大量的愈傷組織，再次繼代的效果很差;謝寅峰等（2011）研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基WPM+TDZ 0.1 mg中繼代，青錢柳增殖系數(shù)為7.3/15 d，且在培養(yǎng)基中添加GA3 2.0 mg能有效地促進(jìn)叢生芽的伸長(zhǎng)及健壯生長(zhǎng)。我們?cè)谇噱X柳的組培快繁過(guò)程中，也曾用WPM為基本培養(yǎng)基進(jìn)行繼代增殖，但發(fā)現(xiàn)會(huì)導(dǎo)致繼代芽苗葉片黃化;在繼代培養(yǎng)基中添加GA3，發(fā)現(xiàn)不僅不能誘導(dǎo)繼代芽苗節(jié)間伸長(zhǎng)、增加植株高度，反而出現(xiàn)莖節(jié)不能伸長(zhǎng)、新生芽苗矮縮、誘發(fā)的愈傷過(guò)多、葉片狹長(zhǎng)彎曲等不良效果，這些截然不同的結(jié)果所預(yù)示的深層原因還有待探討。本研究發(fā)現(xiàn)，ZT、KT和NAA在青錢柳繼代增殖培養(yǎng)中均誘發(fā)大量愈傷，對(duì)再生芽的生長(zhǎng)有抑制作用;青錢柳繼代再生苗比較容易玻璃化，玻璃化程度會(huì)隨著6-BA濃度的提高和繼代培養(yǎng)代數(shù)的增加而加重，但6-BA濃度過(guò)低則不能維持青錢柳繼代再生苗的正常生長(zhǎng);在繼代培養(yǎng)基中添加TIBA，可以明顯提高青錢柳叢生芽誘導(dǎo)率和增殖系數(shù)，這應(yīng)該與該化合物具有抑制頂端優(yōu)勢(shì)和促進(jìn)叢芽產(chǎn)生有關(guān)。通過(guò)長(zhǎng)期的篩選、研究和驗(yàn)證，我們發(fā)現(xiàn)MS+6-BA 0.5 mg可以作為青錢柳長(zhǎng)期繼代增殖的培養(yǎng)基，在此培養(yǎng)基上長(zhǎng)期繼代培養(yǎng)，叢生芽誘導(dǎo)率在80.0%以上，玻璃化率為0，芽苗健壯，平均增殖系數(shù)為7.0/35 d，其重復(fù)性和穩(wěn)定性好，可用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。而在已有的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道中，未見(jiàn)提到有關(guān)青錢柳在繼代增殖中的玻璃化和壯苗培養(yǎng)等問(wèn)題，可能與這些研究所進(jìn)行的繼代增殖的次數(shù)不多有關(guān)。因此，本研究結(jié)果對(duì)青錢柳的長(zhǎng)期繼代增殖和種苗組培快繁生產(chǎn)有一定的參考價(jià)值。

在青錢柳的生根培養(yǎng)中，諸多報(bào)道指出誘導(dǎo)莖段不定根產(chǎn)生的適合外源激素為IBA，喬卿梅等（2009）研究表明IBA的濃度為5.0 mg時(shí)生根率最高，為40%;王紀(jì)和謝寅峰（2009）發(fā)現(xiàn) IBA 0.1 mg+多效唑0.5 mg誘導(dǎo)的生根率最高，為 37.5%，但葉片有凋落現(xiàn)象;而魯萌等（2013）研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基WPM+GGR-6 10.0 mg+IBA 1.0 mg生根效果較好，生根率為25%;謝寅峰等（2009）發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基WPM+IBA 0.2 mg+蔗糖20 g的生根率為16.67%，若先經(jīng)過(guò)15 d暗誘導(dǎo)處理，生根率可提高到23.33%;張文泉等（2018）發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基1/2 MS+IBA 1.5 mg誘導(dǎo)的生根率為27.0%。這些研究結(jié)果顯示，青錢柳組培苗生根較難，誘導(dǎo)的生根率低。而我們研究發(fā)現(xiàn)，1/2 MS為基本培養(yǎng)基很難誘導(dǎo)生根，適宜誘導(dǎo)青錢柳組培苗生根的基本培養(yǎng)基為1/2WPM，適合的外源激素和濃度為IBA 1.5 mg，在此基礎(chǔ)上添加5-NGS 4.5 mg可以大幅度提高生根率，最高可達(dá)83.3%。但還存在不同實(shí)驗(yàn)批次生根率波動(dòng)大、重復(fù)性差等問(wèn)題，這種起伏波動(dòng)是否與植物的生物鐘和培養(yǎng)季節(jié)有關(guān)仍待驗(yàn)證。

在青錢柳組培生根苗移栽方面，目前還未見(jiàn)有相應(yīng)的文獻(xiàn)報(bào)道，我們研究發(fā)現(xiàn)，青錢柳組培生根苗在移栽過(guò)程中比較容易褐化死亡，移栽成活率比較低，目前所獲得的最高移栽成活率也僅為65.6%，離產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的要求還有較大距離，相關(guān)的移栽技術(shù)有待完善提高。

值得注意的是，在相關(guān)研究中我們還發(fā)現(xiàn)，不同的青錢柳種源，在初代培養(yǎng)階段用相同的培養(yǎng)基可能都獲得比較好的結(jié)果，但到后期的繼代增殖及生根培養(yǎng)階段，其對(duì)培養(yǎng)基成分的要求則有明顯的種源特異性。這可能是不同的研究者所得的研究結(jié)果不同，也是我們的研究結(jié)果與諸多已報(bào)道的研究結(jié)果相左的主要原因。

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（責(zé)任編輯 李 莉）