邱小忠 楊罡 陳俊 黃國(guó)昌 龔小華 連晨姿

摘 要 微生物可以用于提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)效益，基于此，介紹和探討飼料用植酸酶、固氮微生物肥料以及微生物農(nóng)藥的研究與開(kāi)發(fā)，如微生物農(nóng)藥中細(xì)菌殺蟲(chóng)劑、真菌殺蟲(chóng)劑、病毒殺蟲(chóng)劑和殺蟲(chóng)抗生素等的最新研究進(jìn)展。同時(shí)，建議加強(qiáng)微生物基因工程的基礎(chǔ)研究，明確確定研究重點(diǎn)，為后續(xù)革新生產(chǎn)工藝，調(diào)整研發(fā)結(jié)構(gòu)，促進(jìn)產(chǎn)業(yè)發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 微生物;基因工程;農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化

中圖分類(lèi)號(hào)：F323.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2020.32.075

微生物與人類(lèi)的關(guān)系十分密切，人們生活中的酒、面包、酸奶、抗生素和疫苗等都來(lái)源于微生物發(fā)酵。但與此同時(shí)，有害微生物也可能導(dǎo)致嚴(yán)重災(zāi)難，如黑死病、新冠病毒等。由于微生物的諸多作用，人們開(kāi)始探索微生物作用于提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)效益的各種可能，并結(jié)合基因工程放大這種效益和成果。

1 飼料用植酸酶的產(chǎn)業(yè)化

在動(dòng)物腸道中，微生物起著促進(jìn)消化的作用，控制禽畜腸道微生物平衡、改善禽畜腸道微生物種類(lèi)能夠使得被禽畜攝入的食物更快速地分解，有助于禽畜消化吸收食物中各種營(yíng)養(yǎng)成分。植酸酶是可以由微生物產(chǎn)生并幫助禽畜消化吸收植酸磷的一種助劑，其不僅有著減少禽畜糞便磷污染的作用，還能夠促進(jìn)禽畜吸收分解后的無(wú)機(jī)磷，減少飼料中磷酸氫鈣的使用，促使禽畜更好更快地生長(zhǎng)。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所結(jié)合微生物基因工程技術(shù)修飾改造了植酸酶基因phAc，研究出了高產(chǎn)植酸酶的畢赤酵母，重組后的畢赤酵母植酸酶產(chǎn)量是原始菌株的3 000倍[1]。該成果已經(jīng)應(yīng)用于禽畜養(yǎng)殖領(lǐng)域，年產(chǎn)植酸酶已經(jīng)超過(guò)20萬(wàn)噸，利潤(rùn)高達(dá)17.35億元。飼料用植酸酶產(chǎn)業(yè)化已經(jīng)相對(duì)成熟，生產(chǎn)出的植酸酶在各個(gè)省市都有供應(yīng)。

2 固氮微生物肥料的產(chǎn)業(yè)化

氮元素是植物生長(zhǎng)并合成蛋白質(zhì)不可或缺的必要元素，在植物種植領(lǐng)域，尿素的使用極大地提高了農(nóng)作物產(chǎn)量，但尿素生產(chǎn)也會(huì)產(chǎn)生很大污染，且尿素生產(chǎn)成本較高，價(jià)格波動(dòng)較大，減少尿素等化肥的使用一直是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)所追求方向。由于土壤中植物根系附近共生著許多固氮微生物，在非豆類(lèi)植物固氮方面存在較大的研究?jī)r(jià)值。如北京大學(xué)等針對(duì)對(duì)固氮斯氏假單胞菌進(jìn)行基因工程層面的研究，通過(guò)構(gòu)建攜帶固氮擠壓和耐銨基因的菌株實(shí)現(xiàn)了菌株固氮作用的提高，并在種植領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[2]。該應(yīng)用最先在遼寧省推廣，使得遼寧省部分植物氮肥使用減少了15%，并增產(chǎn)10%以上。聯(lián)合固氮微生物雖然比不上自身固氮微生物固氮效率高，但其還會(huì)產(chǎn)生吲哚乙酸、維生素、赤霉素、氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同樣具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育的作用。

固氮菌肥料的生產(chǎn)應(yīng)嚴(yán)格按照微生物要求在設(shè)備完善的工廠(chǎng)生產(chǎn)，通過(guò)原始生產(chǎn)菌種、一級(jí)擴(kuò)大斜面菌種、二級(jí)擴(kuò)大液體菌種、種子罐、發(fā)酵罐和分裝出廠(chǎng)等流程完成生產(chǎn)工序。生產(chǎn)的固氮菌肥料主要有3種劑型：1）液體劑型，該劑型生產(chǎn)使用均十分便利，但在高溫條件下菌株數(shù)量下降較快，適合隨產(chǎn)隨用，一般面向工廠(chǎng)周邊的農(nóng)業(yè)生產(chǎn);2）固體劑型，一般以草炭等作為吸附劑載體，由于載體中含有大量有利于固氮菌生產(chǎn)的有機(jī)質(zhì)，固體劑型中固氮菌還能再繁殖，適用于更遠(yuǎn)地區(qū)使用;3）凍干制劑型，凍干制劑通常是將發(fā)酵制成的菌液通過(guò)低溫真空凍干技術(shù)制造成型，每瓶制劑可含活菌200億個(gè)以上，該方法生產(chǎn)的制劑通過(guò)冷凍保存可以擁有更長(zhǎng)的保質(zhì)期，但生產(chǎn)成本更高。

除了固氮菌外，還有很多有助于植物生長(zhǎng)的細(xì)菌，如醋桿菌、枯草桿菌、巨大芽孢桿菌等，并衍生出植物根際促生菌肥，如熒光假單胞菌、惡臭假單胞菌能產(chǎn)生類(lèi)赤霉素物質(zhì)以及吲哚乙酸，還有些植物根際促生菌有抑制鐮刀菌、腐霉菌等病菌的作用。這些植物根際促生菌與其他微生物肥料共同使用效果往往更好，但也需要注意是否會(huì)產(chǎn)生拮抗作用。

3 微生物農(nóng)藥的研究與開(kāi)發(fā)

3.1 細(xì)菌殺蟲(chóng)劑

農(nóng)藥是農(nóng)業(yè)中用于消滅病蟲(chóng)害、保證農(nóng)作物正常生長(zhǎng)的制劑，但農(nóng)藥不僅對(duì)害蟲(chóng)有效也可能因?yàn)槭秤枚饔糜谌梭w，因此農(nóng)藥的使用開(kāi)始被限制。在農(nóng)藥使用受限的背景下，研發(fā)對(duì)人體無(wú)害的非化學(xué)農(nóng)藥，微生物農(nóng)藥就是在這背景下產(chǎn)生的。微生物農(nóng)藥可分為兩種，分別是利用微生物活體制成的農(nóng)藥和利用微生物的代謝產(chǎn)物制成的農(nóng)藥;亦可以根據(jù)用途劃分為殺蟲(chóng)劑、殺菌劑以及除草劑。專(zhuān)門(mén)寄生于昆蟲(chóng)的病原菌有日本緊箍咒芽孢桿菌、緩死芽孢桿菌等，可誘發(fā)金龜子幼蟲(chóng)發(fā)生乳狀病，但這些菌種只在幼蟲(chóng)體內(nèi)生長(zhǎng)，培養(yǎng)難度較大。常用的芽孢桿菌主要是產(chǎn)伴孢晶體昆蟲(chóng)病原菌——蘇云金芽孢桿菌，該昆蟲(chóng)病原菌對(duì)鱗翅目、直翅目、毛翅目等超過(guò)600種昆蟲(chóng)有致病作用，在殺蟲(chóng)領(lǐng)域被廣泛使用和研究。在此基礎(chǔ)上，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)、中山大學(xué)等獨(dú)立發(fā)現(xiàn)了蘇云金芽孢桿菌超過(guò)35個(gè)新基因型，并將超過(guò)10種的蘇云金芽孢桿菌應(yīng)用于棉花、蔬菜等的病蟲(chóng)害防治，如WG001就是我國(guó)首個(gè)成功商業(yè)化的蘇云金芽孢桿菌菌劑[3]。蘇云金芽孢桿菌制劑通常是通過(guò)人工生產(chǎn)培養(yǎng)后獲取芽孢、伴孢晶體等有效殺蟲(chóng)毒素，然后制作成殺蟲(chóng)菌劑，生產(chǎn)方法有液體深層通氣發(fā)酵法和固體發(fā)酵法兩種，制劑類(lèi)型有粉劑、顆粒劑和懸浮劑等多種。

3.2 真菌殺蟲(chóng)劑

除蘇云金芽孢桿菌制作而成的細(xì)菌殺蟲(chóng)劑外，部分真菌同樣具有殺蟲(chóng)效力。當(dāng)前已知的以昆蟲(chóng)為寄主的真菌超過(guò)750種，涉及昆蟲(chóng)超過(guò)200種，如蟲(chóng)草菌是殺死昆蟲(chóng)產(chǎn)生冬蟲(chóng)夏草的一種真菌。但冬蟲(chóng)夏草生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，并不適合作為殺蟲(chóng)菌劑使用。關(guān)于殺蟲(chóng)真菌方面，相關(guān)研究較多主要為白僵菌和綠僵菌。白僵菌主要以分生孢子作為侵染手段，當(dāng)分生孢子附著于昆蟲(chóng)體壁上時(shí)，在濕潤(rùn)條件下萌發(fā)孢子的芽管可以穿透昆蟲(chóng)體壁吸收營(yíng)養(yǎng)并在昆蟲(chóng)血腔中大量繁殖，最終導(dǎo)致昆蟲(chóng)死亡。白僵菌常用于玉米螟蟲(chóng)和松毛蟲(chóng)的防治。在我國(guó)開(kāi)始大量種植玉米后，關(guān)于白僵菌的研究主要方向轉(zhuǎn)為研制對(duì)玉米螟蟲(chóng)毒性更高的白僵菌。如吉林省農(nóng)科院研制出Mad1基因球孢白僵菌工程菌株，通過(guò)克隆來(lái)源于生防真菌綠僵菌的黏著蛋白基因Mad1結(jié)合PEG介導(dǎo)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法最終獲得了轉(zhuǎn)Mad1基因球孢白僵菌[4]。轉(zhuǎn)Mad1基因球孢白僵菌對(duì)亞洲玉米螟幼蟲(chóng)致死時(shí)間縮短34.07%，具有較高的實(shí)用價(jià)值。白僵菌培養(yǎng)較為容易，通過(guò)麥麩、玉米粉等制半固體培養(yǎng)基即可培養(yǎng)得分芽孢，將培養(yǎng)物干燥即可得到白僵菌粉劑。

3.3 病毒殺蟲(chóng)劑

除細(xì)菌真菌外，病毒也可作為殺蟲(chóng)劑使用。當(dāng)前已知能夠作用于昆蟲(chóng)的病毒超過(guò)1 600種，其中研究和使用較多的是核多角體病毒（Nuclear Polyhedrosis Viruses，簡(jiǎn)稱(chēng)NPV），NPV病毒的特點(diǎn)是宿主特異高，殺蟲(chóng)范圍窄，但不影響天敵也無(wú)污染，主要傳播手段為宿主的繁殖行為，殺蟲(chóng)時(shí)間較長(zhǎng)且適用蟲(chóng)譜較窄。關(guān)于NPV病毒的研究有很多，如薛貴收等對(duì)野生型斜紋夜蛾核型多角體病毒（SpltMNPV）日本株進(jìn)行了改造，通過(guò)缺失polh或egt基因并插入由多角體啟動(dòng)子pph啟動(dòng)外源毒素蝎毒素基因，獲得了殺蟲(chóng)效力更高的重組病毒[5]。由于NPV病毒生產(chǎn)不如細(xì)菌真菌便捷，且適用范圍較窄，NPV商業(yè)化成功的案例還較少。

3.4 殺蟲(chóng)抗生素

殺蟲(chóng)抗生素也是常見(jiàn)的殺蟲(chóng)產(chǎn)品，殺蟲(chóng)抗生素主要由微生物次級(jí)代謝物為主要成分，這些次級(jí)代謝物對(duì)部分昆蟲(chóng)有毒害作用。殺蟲(chóng)抗生素種類(lèi)很多，如抗霉素、殺蝶素、尼可霉素、殺螨素和密爾比菌素等?？姑顾貙?duì)蠅類(lèi)、蜘蛛等毒性很高，還有抑制真菌生長(zhǎng)的作用，但由于其對(duì)人體同樣有較高傷害因此未被廣泛使用。當(dāng)前廣泛使用的殺蟲(chóng)抗生素主要是阿維菌素，其有阿維鏈霉菌產(chǎn)生，對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)、節(jié)肢動(dòng)物以及螨類(lèi)都有非常高的殺蟲(chóng)活性。作用機(jī)理為抑制無(wú)脊椎動(dòng)物的γ-氨基丁酸的激活劑使昆蟲(chóng)神經(jīng)麻痹并最終死亡。浙江海正藥業(yè)股份有限公司通過(guò)的破壞除蟲(chóng)鏈霉菌ave D基因，提高阿維菌素B1a的發(fā)酵單位，使得阿維菌素單位發(fā)酵產(chǎn)量提高了33.6%[6]。另外，多殺菌素也是一種重要的殺蟲(chóng)抗生素，其對(duì)小菜蛾、棉鈴蟲(chóng)等常見(jiàn)害蟲(chóng)菌有效，適用于上百種農(nóng)作物。關(guān)于多殺菌素的基因工程研究以提高多殺菌素產(chǎn)量為主，如黃穎等針對(duì)基于組學(xué)分析開(kāi)展了構(gòu)建多殺菌素高產(chǎn)基因工程菌及其代謝調(diào)控的研究[7]。

除了殺蟲(chóng)以外，微生物也可用于殺菌，如引起冠癭病的土壤桿菌可以由放射土壤桿菌的拮抗作用來(lái)治理;木霉菌可以用于鐮刀菌病害防治等。微生物殺菌同樣可以以農(nóng)藥抗生素的方式進(jìn)行，如井岡霉素、公主嶺霉素等都是較好的殺菌抗生素。

4 微生物基因工程農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化發(fā)展建議

4.1 加強(qiáng)基礎(chǔ)研究

關(guān)于微生物基因工程的研究一直在穩(wěn)步推進(jìn)，但大部分是對(duì)已有微生物已知基因功能的挖掘和利用，在DNA蛋白質(zhì)層面的研究嚴(yán)重不足?？茖W(xué)家至今也只清楚部分DNA產(chǎn)生蛋白質(zhì)后的作用，對(duì)于大部分微生物其他DNA的作用并不十分清楚。加強(qiáng)基礎(chǔ)研究有助于更全面地了解微生物，更好地將微生物應(yīng)用于生產(chǎn)生活的各個(gè)領(lǐng)域，并提高人們對(duì)細(xì)胞微生物等的了解。應(yīng)加強(qiáng)農(nóng)業(yè)微生物結(jié)構(gòu)基因組和功能基因組學(xué)研究，加強(qiáng)微生物在除草、堆肥、沼氣發(fā)酵、污水處理、土壤處理等領(lǐng)域的應(yīng)用和研究，促使微生物研究與實(shí)用場(chǎng)景結(jié)合。

4.2 確定研究重點(diǎn)

多年來(lái)，人們高度重視對(duì)細(xì)菌真菌這兩大種類(lèi)微生物的研究，卻忽視了病毒在微生物領(lǐng)域的特殊作用。事實(shí)上，SARS病毒、H5N1禽流感病毒、豬流感病毒乃至現(xiàn)在的新冠病毒多次給人類(lèi)帶來(lái)慘痛損失，關(guān)于病毒的研究卻總是停留在測(cè)序、疫苗研制等有限領(lǐng)域，可見(jiàn)關(guān)于病毒的研究亟待加強(qiáng)。應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注病毒與細(xì)胞結(jié)合的特殊功能，探索病毒修復(fù)目標(biāo)細(xì)胞基因缺陷的可能，探索通過(guò)病毒運(yùn)輸靶向藥的可能，探索病毒為人類(lèi)身體健康服務(wù)，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)服務(wù)的可能。

4.3 革新生產(chǎn)工藝

當(dāng)前，農(nóng)業(yè)微生物產(chǎn)品主要以液態(tài)制劑、固態(tài)制劑以及凍干制劑3種，前兩者雖然生產(chǎn)較為方便但都有較大的保存限制。革新生產(chǎn)工藝有助于微生物產(chǎn)品的保存和更廣泛的應(yīng)用，降低微生物產(chǎn)品的使用門(mén)檻，提高微生物基因工程研究的經(jīng)濟(jì)效益，革新生產(chǎn)工藝應(yīng)以加速微生物培養(yǎng)以及提高產(chǎn)品純度為主要研究方向。

4.4 調(diào)整研發(fā)結(jié)構(gòu)

產(chǎn)學(xué)研一體化是值得借鑒的科研體系，引入企業(yè)的力量不僅有助于高校研究方向的確立，也有助于提高高校科研資金和實(shí)力。應(yīng)盡可能多地與企業(yè)合作，如與生豬養(yǎng)殖企業(yè)合作研制非洲豬瘟病毒疫苗等，相關(guān)研究一旦有研究成果可以快速落地，加速科研成果產(chǎn)業(yè)化的落地速度。

5 結(jié)語(yǔ)

微生物產(chǎn)業(yè)化發(fā)展還有很多路要走，雖然在關(guān)于病蟲(chóng)害防治方面的研究已經(jīng)有很多，但對(duì)于微生物在除草、土壤治理、污水處理等方面的研究依然不足。微生物研究也需要產(chǎn)學(xué)研一體化發(fā)展，提高研究的應(yīng)用價(jià)值和產(chǎn)業(yè)配套速度，以更好地體現(xiàn)微生物研究的應(yīng)用價(jià)值。

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（責(zé)任編輯：趙中正）