陳宏佳 朱應(yīng)群

長沙市第三醫(yī)院呼吸危重癥醫(yī)學(xué)科410015

肺動脈高壓 (pulmonary hypertension,PH)是各種原因引起肺血管阻力增加的疾病或病理生理綜合征,最終結(jié)局是右心衰竭甚至死亡［1-2］。其定義為:在海平面上,經(jīng)右心導(dǎo)管檢查靜息狀態(tài)時平均肺動脈壓≥25 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa),或運動后平均肺動脈壓≥30 mm Hg,同時肺動脈楔壓≤15 mm Hg［3］。PH 的發(fā)病機制尚無定論,主流認為與炎癥激活、肺動脈平滑肌細胞(pulmonary arterial smooth muscle cell,PASMC)、肺動脈內(nèi)皮細胞 (pulmonary artery endothelial cell,PAEC)、肺血管成纖維細胞的異常增生、分化、凋亡等密切相關(guān)。目前無有效的PH 早期監(jiān)測指標(biāo),且缺乏精準(zhǔn)的治療靶點,臨床常規(guī)治療效果差。當(dāng)務(wù)之急是找到能在臨床上大力推廣的有效的PH 診療指標(biāo),以改善疾病預(yù)后及患者生存質(zhì)量。

大量研究提示,微小RNA (microRNA,miRNA)可以作為一種上游信號分子調(diào)控慢性低氧、炎癥、骨形成蛋白Ⅱ型受體 (bone morphogenetic protein type Ⅱreceptor,BMPR2)基因突變、轉(zhuǎn)化生長因子 (transforming growth factor,TGF)/BMP信號通路、Rho激酶系統(tǒng)等PH 致病通 路 的 表 達。 如 miR-21、miR-143/145、miR-17/92、miR-204、miR-130等［4］已證實與PH 關(guān)系密切。

1 miRNA

1.1 miRNA 的簡介 miRNA 是一類約21～25 nt長的高度進化保守的內(nèi)源性單鏈非編碼小分子RNA［5］,幾乎存在于所有的生物體。首個miRNA 是1993年被發(fā)現(xiàn)并命名的lin-4,即Lee等［6］在秀麗隱桿線蟲中意外發(fā)現(xiàn)的一種長約22 nt、不編碼蛋白質(zhì)、對各種胚胎后期的發(fā)育進程起關(guān)鍵調(diào)控作用的基因。截至2018年10月,在動植物以及病毒中已發(fā)現(xiàn)38 589種miRNA。存在于人體中的miRNA 超過2 500個,雖然只占人類基因的2%,但卻調(diào)控著約1/3的m RNA?；A(chǔ)實驗顯示,單個miRNA 可調(diào)控上百個m RNA,而特定的m RNA 也可受多種不同miRNA 的聯(lián)合調(diào)控［7］。miRNA 能在轉(zhuǎn)錄和翻譯層面調(diào)控基因的表達,進而調(diào)控機體穩(wěn)態(tài)和疾病中的各類細胞變化過程。

1.2 miRNA 的生物合成 miRNA 的生物合成大體上分為3個步驟。 (1)前體生成:位于基因間或內(nèi)含子區(qū)域的miRNA 相關(guān)編碼基因在細胞核內(nèi)由RNA 聚合酶Ⅱ或Ⅲ轉(zhuǎn)錄為具有poly A 尾和帽子結(jié)構(gòu)的原始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,即初級miRNA,長約成百上千個核苷酸。隨后與核酸內(nèi)切酶Ⅲ-Drosha及輔助因子DGCR8 發(fā)生反應(yīng),脫去尾巴及帽子,加工成具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)、約70～90 nt長的前體miRNA。(2)出核轉(zhuǎn)運:結(jié)合Ran-GTP 依賴的核質(zhì)/胞質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白5,前體miRNA 可以從胞核轉(zhuǎn)移至胞質(zhì);被Dicer酶剪切成長約21～25 nt的雙鏈miRNA。 (3)成熟:雙鏈miRNA 解螺旋,一條鏈降解,保留下的單鏈即為成熟miRNA,可與RNA 誘導(dǎo)沉默復(fù)合體 (RNA-induced silencing complex,RISC)結(jié)合形成miRNA-RISC,調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄后修飾。

1.3 miRNA 的作用機制 miRNA-RISC 與靶基因mRNA的互補性決定其作用機制與效果,可分以下3種。(1)促進靶基因的降解:如果miRNA 與靶m RNA 具有很強的互補性 (完全或接近完全互補,植物中多見),該復(fù)合物可在互補區(qū)特異性地破壞靶m RNA,使其降解,基因不表達。(2)抑制靶基因的翻譯:若miRNA 與靶m RNA 的互補性低 (常見,尤其是動物中),則靶mRNA 的翻譯受阻,蛋白表達水平改變,起負調(diào)控作用。抑制程度與miRNA 結(jié)合靶m RNA 的位點數(shù)有關(guān),大部分位于3'端非翻譯區(qū)。(3)結(jié)合抑制:同時具備上述2種機制。

1.4 miRNA 的生物學(xué)特性 miRNA 有以下幾個明顯的特征:(1)miRNA 在各類生物的基因組中以基因簇、多拷貝或單拷貝等多種形式存在,其轉(zhuǎn)錄不翻譯成蛋白質(zhì),與其他基因無關(guān)。(2)通常來說,長度約為22 nt;3'端能增減幾個堿基。(3)miRNA 在物種之間的演變高度保守,在莖部尤其明顯,但可在環(huán)部出現(xiàn)突變。(4)miRNA 可按5'端基因序列差異分為具有高度組織特異性、時序性和保守性的不同家族。(5)miRNA 的抗降解能力較強,在血漿中大多以與蛋白質(zhì)結(jié)合的形式穩(wěn)定存在,不易被RNA 酶降解,能在室溫下放置1 d或反復(fù)凍融8次后相對分子質(zhì)量保持不變。

2 與PH 相關(guān)的miRNA

2.1 miR-21 miR-21是近年來報道較多的一種與PH 密切相關(guān)的miRNA。Parikh等［8］使用網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)方法鑒定了多種與PH 致病因素包括低氧、炎癥、遺傳單倍體功能不全、BMPR2基因突變和Rho/Rho激酶信號傳導(dǎo)等相關(guān)的miRNA,結(jié)合體內(nèi)驗證性數(shù)據(jù),證實miR-21 在其中作用顯著。缺氧和BMPR2可直接上調(diào)miR-21在PAEC 內(nèi)的表達,而miR-21 可反向下調(diào)BMPR2。在PH 小鼠中抑制miR-21表達,結(jié)果RhoB表達增加,Rho激酶活化,并有PH 加重現(xiàn)象。White等［9］研究顯示在缺少miR-21基因的小鼠中肺組織程序性細胞死亡蛋白4 (programmed cell death 4,PDCD4)/caspase-3 (一種半胱氨酸蛋白酶)凋亡通路激活,導(dǎo)致進行性PH 的發(fā)生;而miR-21 過表達的PH 小鼠肺組織中的PDCD4 表達降低,并在慢性缺氧和SU5416 (一種抑制血管內(nèi)皮生長的人工制劑)損傷的情況下可部分抵抗PH 發(fā)展。說明miR-21在PH 發(fā)病中起保護性作用。

但是有些研究結(jié)果與此相矛盾,認為miR-21是PAEC和PASMC的促增殖因子,促進PH 發(fā)展。Sarkar等［10］提出,人PASMC中miR-21表達量在低氧 (3%O2)刺激6 h后升高了3倍,在缺氧24 h后仍保持高表達 (2倍),導(dǎo)致靶基因表達抑制,特別是PDCD4、過氧化物酶增殖物激活受 體 α (peroxisome proliferator activated receptor-α,PPARα)、Sprouty2 (由SPRY2基因編碼的蛋白)等促凋亡基因表達降低,刺激PASMC 增殖。Iannone等［11］研究顯示,低氧誘導(dǎo)的PH 小鼠中,miR-21在內(nèi)皮細胞中特異性 下 調(diào) 二 甲 基 精 氨 酸 二 甲 基 氨 基 水 解 酶 1(dimethylarginine dimethylaminohydrolase 1,DDAH1),引起內(nèi)皮功能障礙,進而促進PH 發(fā)生;而使用miR-21抑制劑或DDAH1轉(zhuǎn)基因治療后小鼠肺DDAH1升高,PH 進程阻斷。Yang等［12］研究表明,miR-21在缺氧暴露小鼠的肺遠端小動脈中表達增加,在低氧暴露前后,抑制miR-21均可抑制缺氧所致的肺血管重構(gòu)、減少PH 生成。同時,體外細胞培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)［12-13］,miR-21高表達可上調(diào)細胞增殖相關(guān)的蛋白 (如增殖細胞核抗原、細胞周期蛋白D1 和Bcl-x L),下調(diào)抑癌基因PTEN,刺激PASMC增殖。

國內(nèi) 學(xué) 者［14-15］發(fā) 現(xiàn),COPD 合 并PH 患 者 的 血 清 中miR-21含量大幅升高,并與血清N 末端腦鈉肽前體含量、平均肺動脈壓、肺血管阻力等PH 檢測指標(biāo)呈正相關(guān),提示miR-21在評估PH 病情嚴重程度方面有診斷價值。

2.2 miR-143/145 miR-143和miR-145是參與調(diào)控血管平滑肌細胞 (vascular smooth muscle cells,VSMC)表達的2個關(guān)鍵miRNA［4,16］。有研究表明,miR-143/145簇選擇性高表達于發(fā)育過程中的VSMC,加速細胞分化、抑制增殖。VSMC缺失miR-143 和miR-145,將無法在血管壓力升高的刺激下保持可收縮表型［17］。動物實驗發(fā)現(xiàn),miR-143/145可以協(xié)同靶向轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò),包括Krüppel樣因子4 (Krüppel-like factor 4,KLF-4)、KLF-5、心肌素和ELK1 (ETS癌基因家族的成員),以調(diào)控肌鈣蛋白、平滑肌肌動蛋白和平滑肌22α蛋白的表達水平,從而維持VSMC 的 可 收 縮 表 型,抑 制VSMC 增 生［17-20］。同 時,Albinsson等［16］發(fā)現(xiàn)miR-145 可有效控制內(nèi)膜增生、血管損傷、重塑等病變的發(fā)生。

然而,Caruso等［21］通 過PCR 手 段 檢 測 出miR-145 在缺氧的野生型PH 小鼠模型、特發(fā)性和遺傳性PH 患者發(fā)生重構(gòu)的肺血管中表達上調(diào)。同時發(fā)現(xiàn),BMPR2突變或缺陷可導(dǎo)致小鼠和PH 患者PASMC 中miR-145 表達增加,進而通過下調(diào)靶蛋白ELK1和KLF-4發(fā)揮促進PASMC 增殖的作用。提示miR-145參與了BMP的下游通路。此外,對敲除miR-145基因或經(jīng)抗miR-145干預(yù)后的小鼠進行評估,發(fā)現(xiàn)收縮期右心室壓力得到改善,右心室肥厚程度減輕,血管重塑百分比降低,PH 發(fā)展受阻。提示miR-150促進PH 生成,特異性地下調(diào)miR-145的表達對低氧性PH的形成具有保護作用。但未發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-143對PH 有相似的保護作用。國內(nèi)學(xué)者［22］報道,在PH 動物及人體PASMC中,miR-143和miR-145明顯上調(diào)而ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白 A1 (ATP binding cassette transporter A1,ABCA1)下調(diào)。確定ABCA1 是PASMC 中miR-143/145的直接靶標(biāo),可部分逆轉(zhuǎn)miR-143/145介導(dǎo)的暴露于低氧的PASMC中細胞增殖和遷移的促進作用;并進一步在體內(nèi)實驗證實,抑制miR-143/145可通過靶向過表達ABCA1來預(yù)防低氧誘導(dǎo)的PH 和肺血管重塑。

綜上所述,miR-145 可以通過不同的信號通路在PH形成中發(fā)揮不同作用,在未來的研究中應(yīng)著眼于其綜合作用的探索并應(yīng)用于臨床。

2.3 miR-17/92 miR-17/92 是一個位于人類染色體上的多 順 反 子 基 因 簇, 由 miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-19b-1、miR-20a 和miR-92-1 組 成［23］。miR-17/92 簇最初被認為是最具特征性的致癌miRNA。近年來通過功能基因組學(xué)中的基因敲除技術(shù)發(fā)現(xiàn)它與心肺發(fā)育有關(guān),在血管重構(gòu)中發(fā)揮一定作用。

在PAEC 方面,Brock等［24］發(fā)現(xiàn)miR-17/92基因簇中的miR-17-5p和miR-20a異位過表達可直接導(dǎo)致內(nèi)皮細胞中的BMPR2蛋白明顯減少,促進內(nèi)皮細胞增殖。通過刺激實驗證實miR-17/92簇受IL-6的調(diào)節(jié),而IL-6信號由信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3 (signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)介導(dǎo)。研究者進一步探索了敲除STAT3基因能否阻止miR-17/92上調(diào),發(fā)現(xiàn)STAT3基因被剔除后,IL-6 介導(dǎo)的miR-17/92 一系列反應(yīng)消失,但BMPR2可保持不變。

在PASMC方 面,Brock 等［25］在 低 氧 誘 導(dǎo) 的PH 小 鼠及人PASMC 中使用miR-20a拮抗劑,發(fā)現(xiàn)BMPR2 水平恢復(fù),血管重塑受阻。Pullamsetti等［26］發(fā)現(xiàn)miR-17在PH小鼠中表達上調(diào),特異性miR-17 抑制劑可通過顯著上調(diào)PASMC中的細胞周期蛋白依賴蛋白激酶抑制劑1A(cyclin-dependent kinase inhibitor 1A,CDKN1A),大幅降低肺血管阻力和右心室收縮壓,干擾肺血管和右心室的重構(gòu),改善實驗性PH 中的心肺功能。Chen等［27］通過動物及人體外細胞實驗發(fā)現(xiàn),PDZ 和LIM 結(jié)構(gòu)域5 (PDZ and LIM domain 5,PDLIM5)是miR-17/92 的直接靶標(biāo);敲除miR-17/92 基 因 可 激 活PDLIM5 誘 導(dǎo) 的TGF-β/Smad3(一種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白)通路,使肌鈣蛋白、α-平滑肌肌動蛋白、平滑肌22α蛋白表達增加,PASMC 增殖抑制,阻礙PH 形成。該實驗揭示了另一條PH 發(fā)生通路,即miR-17/92-PDLIM5-TGF-β/Smad信號通路。

2.4 miR-204 miR-204主要在肺循環(huán)中表達并發(fā)揮作用,且多數(shù)定位在PASMC。已有資料顯示,維持PASMC的增生和抗凋亡涉及活化T 細胞核因子 (nuclear factor of activated T cell,NFAT)、蛋白酪氨酸磷酸酶2 (SH2 domain-containing protein-tyrosine phosphatase-2,SHP-2)和STAT3的作用。具體機制如下:首先是STAT3的激活可直接誘導(dǎo)NFAT 胞漿蛋白2抗體的表達,抑制miR-204表達;而低水平miR-204可增加SHP-2水平,激活Src激酶與NFAT;最后激活的Src 激酶又可反過來激活STAT3,形成一個正反饋環(huán)路［28-29］。

Courboulin等［28］發(fā)現(xiàn)miR-204在臨床PH 患者和嚙齒動物PH 模型的PASMC 中均明顯下調(diào),且下調(diào)幅度與病情輕重呈正相關(guān),miR-204過表達可在一定程度上緩解病情。結(jié)合miRNA 靶點運算法則及已知的PH 發(fā)展過程,證實Src-STAT3-NFAT-miR-204-SHP-2 信號通路的存在。該組研究者還檢測了8例PH 患者外周血中miR-204的表達水平,提示較明顯的下降,考慮miR-204 有望成為PH外周血診斷標(biāo)志物,但該結(jié)論需在大樣本中進一步驗證。Pan等［30］發(fā)現(xiàn)在PH 大鼠肺組織中給予人工合成的miR-204類似物后,可明顯減輕PH 病情。

2.5 miR-130 多項研究表明miR-130在PH 中表達上調(diào),并與 疾 病 嚴 重 程 度 直 接 相 關(guān)［31］。Wu 等［32］研 究 發(fā) 現(xiàn),miR-130a可通過靶向抑制具有抗血管生成作用的生長終止特異性同源盒基因的表達來促進血管生成、平滑肌增殖,有濃度依賴性和時間依賴性的特點。

Brock等［33］通過缺氧誘導(dǎo)PH 的小鼠模型和體外實驗證實,miR-130 可通過直接靶向調(diào)節(jié)CDKN1A 來控制PASMC 增 殖。 用 miR-130 轉(zhuǎn) 染 人 PASMC 會 降 低CDKN1A 的表達,進而顯著增加平滑肌的增殖;相反,miR-130拮抗劑可使CDKN1A 的表達恢復(fù)。這些數(shù)據(jù)表明,miR-130在缺氧抑制CDKN1A 中起重要作用,參與PH 心肺重構(gòu)過程的可能性大。

Bertero等［34］認為在多種肺血管細胞中,miR-130/301簇通過激活共同的轉(zhuǎn)錄因子YAP/TAZ誘導(dǎo)血管細胞外基質(zhì)的重塑和硬化;還可通過PPARγ-ApoE-LRP8軸調(diào)節(jié)血管活性因子的分泌,調(diào)控肺血管收縮。

2.6 其他miRNA 有研究發(fā)現(xiàn)［35］在低氧誘導(dǎo)的PH 大鼠模型肺組織中miR-98 表達顯著下調(diào),并通過抑制ALK1的表達來減少肺血管增生和膠原沉積。Kang 等［36］發(fā)現(xiàn)miR-98在PH 的PAEC 中表達下降,敲除PPARγ基因可靶向增加內(nèi)皮素1和增殖細胞核抗原的表達,減少miR-98,促進PAEC增殖。另一項［37］納入116例患者的臨床研究提示COPD 繼發(fā)PH 患者外周血miR-98的表達水平低于健康人群和單純COPD 患者,認為外周血miR-98有望應(yīng)用于COPD 繼發(fā)PH 的早期臨床診斷和病情評估。

miR-214在COPD 相 關(guān)PH 患 者 的PASMC 中 顯 著 上調(diào),并且可以通過靶點CCNL2來促進PASMC 的增殖［38］。另有學(xué)者［39］認為miR-214在PASMC中靶向結(jié)合重組人缺氧誘導(dǎo)因子1α抑制劑的3'端非翻譯區(qū),促進細胞增生。

在野百合堿誘導(dǎo)的PH 大鼠中miR-29a表達大幅度下調(diào),增加miR-29a含量可明顯改善肺血管重構(gòu)［40］。有研究發(fā)現(xiàn)［41］,miR-29b可通過抑制靶基因CCND2 和Mcl-1 來使PASMC增殖抑制,加速凋亡;在PH 動物模型中加入miR-29b類似物后,右心室收縮壓降低,右心室肥厚程度減輕,肺血管重構(gòu)表現(xiàn)出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)。Yang等［42］在人肺成纖維細胞中發(fā)現(xiàn),miR-29 調(diào)控TGF-β1通過PI3K-Akt信號通路介導(dǎo)膠原合成,影響PH 發(fā)展。

Zhou等［43］發(fā) 現(xiàn)COPD 合 并PH 組 的miR-942 表 達 水平遠低于單純COPD 組,但CCND1 的表達水平卻比單純COPD 組高得多;認為低水平miR-942 通過增強CCND1表達來促進PASMC增殖,從而影響PH 的血管重塑。

Rhodes等［44］對8例PH 患者及8 名健康人的血漿總RNA 進行了微陣列篩選,發(fā)現(xiàn)在58個出現(xiàn)差異性表達的miRNA 中,miR-150下調(diào)最明顯。隨后,他們用統(tǒng)計學(xué)方法證實miR-150水平可獨立預(yù)測PH 生存率,miR-150 降低提示PH 預(yù)后差。有學(xué)者發(fā)現(xiàn),高表達的miR-150可以通過Akt/m TOR 信號通路減少Ki67蛋白的表達來抑制平滑肌增生［45］;也可通過降低缺氧誘導(dǎo)因子1α的表達來減輕缺氧引起的PASMC過度增殖和遷移［46］。

Liu等［47］發(fā)現(xiàn)miR-27a在缺氧處理的大鼠和人PAEC中高表達,且通過靶向調(diào)節(jié)Smad5抑制了BMP信號傳導(dǎo),從而減輕了Id2 介導(dǎo)的內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的2 個關(guān)鍵介質(zhì)(Snail和Twist)的抑制作用,即miR-27a通過抑制BMP信號傳導(dǎo)促進低氧誘導(dǎo)的PH 中的內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

3 結(jié)語與展望

miRNA 作為一個轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因在人體內(nèi)數(shù)量龐大,可調(diào)控約1/3的基因表達。大量國內(nèi)外研究證明,miRNA與血管平滑肌細胞、內(nèi)皮細胞及肺血管成纖維細胞的增殖、遷移有著極為密切的關(guān)系,可作為一種上游信號分子調(diào)控肺血管重塑。但由于PH 發(fā)病機制復(fù)雜,作用位點眾多,不同miRNA 在不同細胞中參與的信號通路不同,且當(dāng)前研究成果大多取自動物實驗及人體外細胞培養(yǎng),在PH 患者體內(nèi)的具體靶點及調(diào)控機制可能存在差異,尚難以在臨床推廣應(yīng)用,需進一步研究。可以預(yù)見的是,miRNA 作為新型的PH 診療靶點有很廣闊的研究前景。通過綜合利用各種前沿技術(shù)、精準(zhǔn)追蹤、擴大標(biāo)本量等方式對miRNA進行更深入的研究,相信會取得喜人成果,為PH 的早期診斷和防治提供新的依據(jù)及方向。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突