張帥，程昊，邱彩霞，陳賢如

1(肇慶學(xué)院 食品與制藥工程學(xué)院，廣東 肇慶，526601) 2(廣西科技大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西糖資源綠色加工重點實驗室，廣西 柳州，545006) 3(蔗糖產(chǎn)業(yè)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，廣西 南寧，530004)

猴頭菇(Hericiumerinaceus)是一種珍貴的食藥兩用的大型食用菌，富含多糖、蛋白質(zhì)、維生素及微量元素等多種營養(yǎng)和功效成分[1-3]，尤其是猴頭菇多糖因具有較強的抗氧化、抑菌、增強免疫力、抗疲勞等多種生理活性而常用于保健食品的研發(fā)[4-5]。提高食用菌中多糖的含量及活性成為當(dāng)前食用菌領(lǐng)域研究的重點和熱點，菌種誘變技術(shù)或許是解決這一問題的一種有效方法。目前關(guān)于猴頭菇誘變方法的報道較多，如紫外線、60Co-γ射線、離子束注入及交變磁場誘變等[6-10]，但采用超聲波誘變猴頭菇尚未見報道。

超聲波誘變的原理是通過超聲波的機械作用、熱作用、空化作用產(chǎn)生的高溫高壓來破壞微生物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)并引起組織細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運動，從而使DNA突變率增加。超聲波穿透性好，誘導(dǎo)時不用開蓋誘導(dǎo)，這樣可減少微生物污染的幾率。同時，超聲波誘變法操作簡單，安全性高，經(jīng)濟(jì)實惠，一般實驗室條件都可達(dá)到[11-14]。本研究通過對猴頭菇超聲波誘變處理，考察了超聲波誘變對猴頭菇粗多糖含量及其抑菌效果的影響，不僅為提高猴頭菇粗多糖含量和抑菌活性提供了一種簡單可行的方法，而且為其他食用菌中粗多糖等活性成分的提高提供了方法借鑒，這對于食用菌行業(yè)的發(fā)展以及食用菌產(chǎn)品的深加工具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 菌種和培養(yǎng)基

猴頭菇菌種，本學(xué)院食品微生物實驗室試管保藏；PDA培養(yǎng)基，購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，依說明書配好后分裝試管和平面皿，滅菌后做成PDA斜面和PDA平板若干，冷藏備用。

液體種子培養(yǎng)基組成：可溶性淀粉5%、蔗糖1%、KH2PO40.3%、Mg2SO4·7H2O 0.15%、酵母膏0.1%，pH 6.0。液體發(fā)酵培養(yǎng)基組成：葡萄糖2.2%、麩皮1%、KH2PO40.5%、MgSO4·7H2O 0.1%、酵母膏0.05%、蛋白胨0.02%。原種培養(yǎng)基組成：棉籽殼75%、木屑10%、麩皮13%、蔗糖1%、石膏1%。栽培培養(yǎng)基組成：棉籽殼45%、木屑41%、麩皮12%、蔗糖1%、石膏1%。細(xì)菌固體培養(yǎng)基組成：牛肉膏0.3%、蛋白胨0.5%、NaCl 0.5%、瓊脂2%。細(xì)菌液體培養(yǎng)基組成：除不加瓊脂外，其他同細(xì)菌固體培養(yǎng)基。上述培養(yǎng)基中所有百分?jǐn)?shù)均為質(zhì)量百分比。

1.2 主要儀器設(shè)備

YQ-120B型超聲波清洗機,上海易凈超聲波儀器有限公司；DGX-9143 B-1電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司；UV-1240紫外分光光度計,島津企業(yè)管理(中國)有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴箱,江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠；XB-10B高速多功能粉碎機,東莞市隆鑫機電設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 猴頭菇菌懸液制備

取PDA斜面保藏的猴頭菇菌種，用無菌接種鏟取一塊約0.5 cm2接入到10 mL液體種子培養(yǎng)基中，于25℃培養(yǎng)3 d，即得猴頭菇菌懸液。

1.3.2 猴頭菇超聲波誘變

將猴頭菇菌懸液稀釋至106CFU/mL，取若干試管分別裝入10 mL稀釋后的菌懸液，置于40 kHz、300 W超聲波清洗機中進(jìn)行誘導(dǎo)，分組誘導(dǎo)2、4、6、8、10 min，各平行3次。每支試管各取0.1 mL稀釋液涂于不同PDA平板中，25oC培養(yǎng)7 d。以未超聲誘變處理的猴頭菇菌懸液為對照組，計算致死率，見公式(1)：

(1)

1.3.3 猴頭菇變異菌株初篩

從致死率為70%～95%的平板中, 挑取各平板萌發(fā)最早、生長最旺盛的菌落，轉(zhuǎn)接到PDA斜面中，作為猴頭菇變異菌株。待PDA斜面長滿菌絲體后，接到PDA平板中，25 ℃培養(yǎng)7 d。根據(jù)對猴頭菇菌絲體的生長勢、菌絲密度、菌絲色澤、邊緣整齊度的評分，選出總分比原始菌株高的變異菌株。

1.3.4 猴頭菇變異菌株復(fù)篩

原始菌株與經(jīng)1.3.3挑選出的猴頭菇變異菌株，分別接入液體種子培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，25 ℃培養(yǎng)3 d后，分別取15 mL接入200 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，25 ℃培養(yǎng)15 d，得猴頭菇發(fā)酵液。通過測定猴頭菇發(fā)酵液中菌絲體的生物量和粗多糖含量，篩選出生物量最大、粗多糖含量最高的猴頭菇變異菌株。

1.3.4.1 猴頭菇菌絲體生物量測定

將猴頭菇發(fā)酵液于離心機中4 000 r/min離心10 min，取沉淀猴頭菇菌絲體，洗滌3次后于65 ℃烘干至恒重，計算猴頭菇發(fā)酵液中菌絲體的生物量，見公式(2)：

(2)

1.3.4.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

精確稱取干燥恒重的葡萄糖0.1 g，用蒸餾水定容于100 mL容量瓶中，然后吸取10 mL再定容于100 mL容量瓶，得到0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液。采用苯酚-硫酸法[15]，按表1完成操作后，搖勻放置5 min，置沸水浴中加熱15 min，然后冷卻至室溫，于490 nm 波長處測定吸光度。最終建立葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=12.675x-0.011 3，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 2，在0.01～0.06 mg/mL葡萄糖含量與吸光度呈良好線性關(guān)系。

表1 苯酚-硫酸法葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.4.3 猴頭菇菌絲體粗多糖的測定

將經(jīng)1.3.4.1處理后的猴頭菇菌絲體粉碎，過30目篩，精確稱重。用熱水浸提[16]，固液比1∶10，浸提溫度90 ℃，浸提時間2.5 h，過濾去渣，浸提液用Sevag法[17-18]除蛋白后，得到猴頭菇菌絲體粗多糖溶液，然后稀釋至合適濃度即得樣品液。準(zhǔn)確吸取樣品液1 mL，按1.3.4.2的方法測定吸光度，計算樣品液的粗多糖含量，見公式(3)：

粗多糖含量/[g·(100g)-1]=

(3)

1.3.5 猴頭菇袋料栽培

將猴頭菇原始菌株和經(jīng)1.3.4復(fù)篩出的變異菌株進(jìn)行袋料栽培[19]，通過比較不同猴頭菇的生長情況，考察猴頭菇超聲波誘變是否有價值。

1.3.6 猴頭菇子實體粗多糖的測定

將猴頭菇子實體65℃烘干至恒重，粉碎，過30目篩，精確稱重。用熱水浸提[20]，固液比1∶10，浸提溫度80℃，浸提時間3 h，過濾去渣，浸提液用Sevag法除蛋白后，得到猴頭菇子實體粗多糖溶液，然后稀釋至合適的濃度即得樣品液。準(zhǔn)確吸取樣品液1 mL，按照1.3.4.2的方法測定吸光度，并計算樣品液的粗多糖含量，見公式(4)：

粗多糖含量/[g·(100g)-1]=

(4)

1.3.7 濾紙片法測定猴頭菇粗多糖的抑菌效果

1.3.7.1 猴頭菇子實體粗多糖溶液的制備

按照1.3.6的方法制備猴頭菇原始菌株、變異菌株子實體粗多糖溶液。

1.3.7.2 猴頭菇粗多糖濾紙片的制備

用打孔機將普通定性濾紙打成直徑為5.0 mm圓形紙片，放進(jìn)干燥潔凈的培養(yǎng)皿內(nèi)，經(jīng)121 ℃、30 min高壓滅菌后，放入干燥箱內(nèi)干燥[21]。取干燥后的普通定性濾紙片，分別放進(jìn)體積相同的猴頭菇原始菌株、變異菌株的子實體粗多糖溶液，浸潤30 min后備用。

1.3.7.3 參照菌種菌懸液的制備

將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌作為參照菌種進(jìn)行活化，然后將參照菌種分別接入10 mL細(xì)菌液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h。然后各進(jìn)行10倍遞增稀釋，稀釋成一系列濃度梯度，各參照菌種菌懸液的每個濃度各取0.1 mL涂布于細(xì)菌固體培養(yǎng)基平板并培養(yǎng)24 h，選取恰能鋪滿平板的菌懸液備用。

1.3.7.4 猴頭菇粗多糖抑菌效果測定

對1.3.7.3選出的參照菌種菌懸液，各取0.1 mL均勻涂布于平板上，再貼上在猴頭菇子實體粗多糖溶液中浸潤的濾紙片，每個平板貼4片濾紙片，均勻間隔，輕壓紙片，于37 ℃培養(yǎng) 24 h，觀察抑菌圈，并用十字交叉法測量抑菌圈直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘變時間對猴頭菇的影響

由表2可知，猴頭菇菌懸液經(jīng)超聲波處理不同時間后，菌落最早萌發(fā)時間均會提前1～2 d，說明超聲波誘變可加速菌落萌發(fā)。隨著誘變時間的延長，猴頭菇菌落萌發(fā)數(shù)降低，致死率升高。從致死率為70%～95%的平板中，挑選出萌發(fā)時間最早和生長最旺盛的菌落，分別編號H-1、H-2、H-3、H-4、H-5、H-6、H-7、H-8、H-9作為猴頭菇變異菌株，猴頭菇原始菌株編號為H。

表2 誘變時間對猴頭菇的影響

2.2 猴頭菇變異菌株初篩結(jié)果

將上述編號為H、H-1、H-2、H-3、H-4、H-5、H-6、H-7、H-8、H-9的猴頭菇菌株進(jìn)行平板培養(yǎng)，通過對生長勢、菌絲密度、菌絲色澤及邊緣整齊度的評分，選出比原始菌株H評分高的變異菌株。結(jié)果見表3和圖1。

表3 猴頭菇菌株生長情況的比較

注：評分標(biāo)準(zhǔn)：生長勢“+++”為3分，“++”為2分，“+”為1分；菌絲密度“較大”為4分，“大”為3分，“小”為2分，“較小”為1分；菌絲色澤“潔白”為3分，“白”為2分，“灰白”為1分；邊緣整齊度“較整齊”為3分，“整齊”為2分，“不規(guī)則”為1分。

圖1 猴頭菇菌株生長情況比較

可見，猴頭菇菌懸液經(jīng)超聲波誘導(dǎo)后，其生長勢、菌絲密度、菌絲色澤及邊緣整齊度均發(fā)生了明顯變化。由表3和圖1可見，猴頭菇菌絲密度比較大的，其邊緣整齊度大都呈不規(guī)則狀；而菌絲密度小、菌絲色澤淺的，其邊緣則都比較整齊。最終篩選出評分比原始菌株H高的猴頭菇變異菌株為：H-2、H-5、H-7、H-9。

2.3 猴頭菇變異菌株復(fù)篩結(jié)果

將編號為H-2、H-5、H-7、H-9的猴頭菇變異菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)，挑選出生物量最大、菌絲體多糖含量最高的猴頭菇變異菌株。結(jié)果如表4。

由表4可知，液體培養(yǎng)后，變異菌株菌絲體生物量比原始菌株高的為H-2、H-7、H-9；變異菌株菌絲體粗多糖含量比原始菌株高的為H-2(高出1.2 %)。因此，篩選出的優(yōu)良猴頭菇菌株為變異菌株H-2。另外，變異菌株H-5的生物量比變異菌株H-7要低，但H-5的菌絲體粗多糖含量卻比H-7要高，這說明猴頭菇經(jīng)超聲波誘變后，菌絲體生物量大的，其粗多糖含量不一定高。

表4 猴頭菇菌株液體培養(yǎng)后產(chǎn)物產(chǎn)量的比較

2.4 猴頭菇袋料栽培結(jié)果

取猴頭菇原始菌株H和變異菌株H-2，先二級種擴大培養(yǎng)，再用聚丙烯塑料袋裝料進(jìn)行栽培。結(jié)果如表5和圖2。

表5 猴頭菇袋料栽培結(jié)果

圖2 猴頭菇袋料栽培結(jié)果

由表5可知，猴頭菇變異菌株H-2和原始菌株H的菌絲體長滿時間一致，但H-2幼蕾萌發(fā)時間比H提早兩天。由圖2可看出，H-2子實體色澤偏白，而H子實體色澤偏黃。H-2子實體比H子實體的干重增加了3.8 %，粗多糖含量提高了2.3 %。另外，對比表4和表5可知，猴頭菇菌絲體粗多糖含量高于子實體粗多糖含量。

2.5 猴頭菇子實體粗多糖的抑菌效果

將從猴頭菇原始菌株H與變異菌株H-2子實體提取的多糖，分別配成濃度為10.54 mg/mL的粗多糖溶液，用濾紙片法測定抑菌效果，抑菌圈直徑小于9 mm 為低度敏感；9～11 mm為中度敏感；11 mm以上為高度敏感。結(jié)果見表6和圖3。

表6 猴頭菇子實體多糖抑菌效果

注：“—”表示沒有抑菌效果。

圖3 H-2對金黃色葡萄糖球菌的抑菌效果

由表6可知，猴頭菇原始菌株H子實體多糖對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌均無抑菌效果。猴頭菇變異菌株H-2子實體多糖對金黃色葡萄球菌高度敏感(見圖3)，而對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌沒有抑菌效果。這可能是因為猴頭菇經(jīng)超聲波誘變后，其子實體多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，從而提高了其對金黃色葡萄球菌的抑菌活性。

3 結(jié)論

本研究利用超聲波對猴頭菇進(jìn)行誘變。通過猴頭菇平板培養(yǎng)初篩和液體發(fā)酵復(fù)篩，得到菌絲體生物量和粗多糖含量均高于原始菌株H的變異菌株H-2。猴頭菇袋料栽培試驗表明，變異菌株H-2菌絲體和子實體的粗多糖含量比原始菌株H分別提高了1.2%和2.3%。另外，比較了H-2和H兩種猴頭菇子實體粗多糖的抑菌效果，結(jié)果表明，猴頭菇H-2子實體粗多糖，對金黃色葡萄球菌具有強抑菌作用，而原始菌株的子實體粗多糖對金黃色葡萄球菌不敏感。可見，猴頭菇菌株經(jīng)超聲波誘變后不僅可提高子實體粗多糖含量，而且也會增強其抑菌活性，因此超聲波誘變可以作為改良食用菌生物性狀的一項有效措施。