黃燕鳳 翟露 劉玉花 馬翠 韋薇 戴霞

1 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院護(hù)理部（南寧530021）

2 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年消化內(nèi)科

糖尿病可引起血管內(nèi)皮損傷和功能異常，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，導(dǎo)致冠心病、缺血性腦卒中及下肢動(dòng)脈閉塞等，是糖尿病患者致死致殘的主要原因[1，2]。而這種血管內(nèi)皮功能障礙的發(fā)生與骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）密切相關(guān)[3]。EPCs是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，當(dāng)血管內(nèi)皮發(fā)生局部難以修復(fù)的損傷后，EPCs可向血管損傷部位遷移至血管內(nèi)皮，參與血管新生和血管內(nèi)皮修復(fù)[4]。然而，當(dāng)機(jī)體患糖尿病時(shí)，EPCs的數(shù)量減少、功能受損，不能有效地發(fā)揮EPCs內(nèi)皮修復(fù)作用[5，6]。因此，尋求改善糖尿病狀態(tài)下EPCs功能的方法及其相關(guān)機(jī)制，對(duì)于治療糖尿病血管病變有重要意義。

目前，不少研究證實(shí)有氧運(yùn)動(dòng)能提高老年人、冠心病以及慢性心衰患者的EPCs遷移功能，促進(jìn)損傷內(nèi)皮的修復(fù)[7-9]。但目前關(guān)于運(yùn)動(dòng)對(duì)糖尿病患者或者動(dòng)物模型的EPCs功能作用研究較少，尚未發(fā)現(xiàn)有研究報(bào)道有氧運(yùn)動(dòng)、抗阻運(yùn)動(dòng)以及聯(lián)合有氧-抗阻運(yùn)動(dòng)（聯(lián)合運(yùn)動(dòng)）對(duì)糖尿病EPCs遷移能力的影響，且其相關(guān)機(jī)制尚不十分明確。有研究證實(shí)，小凹蛋白-1（caveolin-1，Cav-1）參與血管修復(fù)和生成過(guò)程[10，11]，但Cav-1與EPCs關(guān)系的研究較少，而高血糖可改變Cav-1 的表達(dá)，同時(shí)使EPCs 功能受損[12，13]。運(yùn)動(dòng)是否能通過(guò)調(diào)節(jié)Cav-1 表達(dá)改善糖尿病小鼠EPCs的遷移能力，以及哪種運(yùn)動(dòng)的效果更好有待進(jìn)一步研究。本研究對(duì)2型糖尿病小鼠實(shí)施為期8周的有氧運(yùn)動(dòng)、抗阻運(yùn)動(dòng)以及聯(lián)合運(yùn)動(dòng)干預(yù)，體外分離培養(yǎng)骨髓源EPCs后比較各組EPCs遷移能力以及Cav-1 蛋白表達(dá)情況，探索哪種運(yùn)動(dòng)更能改善EPCs 遷移能力以及Cav-1 蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)血管內(nèi)皮修復(fù)和血管再生，為運(yùn)動(dòng)治療糖尿病、防治糖尿病血管并發(fā)癥提供新的基礎(chǔ)研究依據(jù)和新的思路。

1 對(duì)象和方法

1.1 動(dòng)物及分組

將40 只8 周齡雄性db/db 小鼠（品系：BKS-DB/Nju；血糖28 mmol/L；體重42.27±1.21 g；公司：南京大學(xué)-南京生物醫(yī)藥研究院）按照電腦產(chǎn)生的隨機(jī)數(shù)字進(jìn)行編號(hào)，隨機(jī)分為有氧運(yùn)動(dòng)組、抗阻運(yùn)動(dòng)組、聯(lián)合有氧+抗阻運(yùn)動(dòng)組（聯(lián)合運(yùn)動(dòng)組）以及對(duì)照組，每組10只。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑

RIPA 裂解液（碧云天）、PMSF溶液（索萊寶）、10X電泳轉(zhuǎn)膜液（索萊寶）、甲醇溶液（成都科龍）、5X Tris-甘氨酸電泳緩沖液（索萊寶）、抗體Cav-1（100 μl）（美國(guó)CST 公司）、Western blot 一抗稀釋液（索萊寶）、Western blot 二抗稀釋液（碧云天）、1×PBS 緩沖液（pH 7.2- 7.4，索萊寶）、蛋白磷酸酶抑制劑混合物（100X，索萊寶）、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（碧云天）、熒光二抗（羊抗兔，美國(guó)LICOR 公司）、熒光二抗（羊抗鼠，美國(guó)LICOR公司）。

1.3 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練

各組均以普通飼料喂養(yǎng)?？瞻捉M不進(jìn)行任何運(yùn)動(dòng)干預(yù)；各運(yùn)動(dòng)組分別采取相應(yīng)的運(yùn)動(dòng)，運(yùn)動(dòng)方案參考既往研究并改良[14，15]，由專人負(fù)責(zé)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練干預(yù)，每周運(yùn)動(dòng)6 天，共8 周。有氧運(yùn)動(dòng)組db/db 小鼠在坡度均為0度WDW-1型8跑道小鼠跑臺(tái)（北京東西儀器科技有限公司，出廠編號(hào)：2016020-022）跑步。在第1周時(shí)有氧運(yùn)動(dòng)速度為10 m/min，逐漸增加至15 m/min，30 min/d，第2～8周速度為15 m/min，60 min/d?？棺柽\(yùn)動(dòng)組db/db小鼠的尾部纏繞一定重量的水球進(jìn)行爬梯訓(xùn)練，具體干預(yù)方案見(jiàn)表1。聯(lián)合運(yùn)動(dòng)組每周的運(yùn)動(dòng)量為有氧運(yùn)動(dòng)與抗阻運(yùn)動(dòng)各一半的方式，見(jiàn)表2。

表1 抗阻運(yùn)動(dòng)組運(yùn)動(dòng)方案

表2 聯(lián)合運(yùn)動(dòng)組運(yùn)動(dòng)方案

1.4 EPCs的分離培養(yǎng)

于運(yùn)動(dòng)干預(yù)第8 周后取材，各組分離培養(yǎng)EPCs 方法均一致。頸椎脫臼法處死小鼠，于75%乙醇內(nèi)浸泡5～10 min，無(wú)菌分離小鼠肱骨、股骨及脛骨并離斷，以含三抗（青霉素-鏈霉素-慶大霉素）的無(wú)菌PBS 充分沖洗骨髓腔，收集骨髓細(xì)胞至無(wú)菌15 ml 離心管中，將骨髓腔沖洗液輕柔吹打均勻后，按1︰1 體積緩慢滴加于淋巴細(xì)胞分離液上，2000 rpm/min 離心 20 min 后用巴氏吸管吸取出中間白色云霧狀細(xì)胞層，加入PBS 清洗細(xì)胞去除殘留的淋巴細(xì)胞分離液，離心獲取細(xì)胞沉淀，加入EGM-2MV 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。將細(xì)胞培養(yǎng)物接種于包被了纖維黏連蛋白（FN 蛋白）的T25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。此后，每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每3天換液一次，去除非貼壁細(xì)胞。細(xì)胞擴(kuò)增至一定數(shù)量后進(jìn)行EPCs的鑒定，待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%后開(kāi)始進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)。

1.5 EPCs的鑒定

向各組的24孔板中依次加入DiI 標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍祝―iI-ac-LDL，Molecular Probes 公司）和帶FITC 熒光標(biāo)記的豌豆凝集素（FITC-UEA-I，Sigma 公司），共聚焦顯微鏡觀察到Dil-acLDL、FITC-UEA-I雙染色陽(yáng)性的細(xì)胞被認(rèn)為是正在分化的EPCs[16]。流式細(xì)胞檢測(cè)CD133 表型，Anti-mouseIgG-Fc/PE（博奧森）作為同型對(duì)照（陰性對(duì)照），將PE熒光標(biāo)記的造血干細(xì)胞抗原CD133 抗體（博奧森）加入待測(cè)細(xì)胞溶液中孵育30 min。PBS 溶液洗滌后，以300 g/min 轉(zhuǎn)速離心5 min，重懸調(diào)整細(xì)胞密度后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD133 表型表達(dá)情況。

1.6 EPCs的遷移功能檢測(cè)

采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)反映細(xì)胞遷移功能。1～3×106個(gè)EPCs 接種于6 孔板，置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用200 μL 移液器配合直尺槍頭垂直于6 孔板，對(duì)照預(yù)先畫(huà)好的線，均勻畫(huà)條痕。用1×PBS緩沖液洗滌6 孔板3 次，去除劃下的細(xì)胞，加入無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)置37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。各組EPCs分別于0 h、48 h在倒置熒光/相差顯微鏡成像分析系統(tǒng)定點(diǎn)拍照并分析，繪制柱狀圖[17，18]。

1.7 蛋白免疫印跡技術(shù)（Western blotting）

往25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶里加PIRA裂解液、苯甲基磺酰氟溶液（PMSF）、蛋白磷酸酶抑制劑混合液以裂解EPCs，裂解后進(jìn)行4℃、14000 r/min 的條件離心15 min，吸取上清液，5×蛋白上樣緩沖液按照1︰5體積比加入上清液，混勻后槽式加熱器調(diào)節(jié)溫度100℃，加熱10 min 使蛋白變性。使用BCA 法測(cè)定蛋白濃度，將蛋白進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯膜上（PVDF）。制備蛋白凝膠后，電泳、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉至少1 h，之后用TBST 洗滌。一抗孵育2 h 后二抗孵育1 h，TBST 洗滌，最后用Odyssey 雙色紅外激光成像系統(tǒng)掃描，選擇800 通道，調(diào)節(jié)明亮度，記錄各組蛋白灰度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Image J 軟件分析圖片，SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用單因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

骨髓分離后獲得的細(xì)胞在FN 蛋白包被的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，24 h 開(kāi)始貼壁，4 d 貼壁基本完全，可見(jiàn)較多貼壁細(xì)胞，呈圓形、短梭形，部分為長(zhǎng)梭形；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，圓形細(xì)胞數(shù)量減少，梭形細(xì)胞數(shù)量漸漸增多，可出現(xiàn)細(xì)胞集落，7 d 后EPCs 大量增殖，并有梭形貼壁細(xì)胞在其邊緣不斷生成，可出現(xiàn)“鋪路石”樣改變，見(jiàn)圖1。

圖1 倒置顯微鏡下EPCs的形態(tài)（×100）

2.2 雙熒光染色鑒定

在激光共聚焦顯微鏡下，胞漿攝取DiI-ac-LDL，顯示紅色，胞膜結(jié)合FITC-UEA-I，顯示綠色，雙染色陽(yáng)性細(xì)胞為黃色，為正在分化的EPCs。各組EPCs 的DiIac-LDL 及FITC-UEA-I 雙染陽(yáng)性率為73.50%±7.47%（圖2）。流式細(xì)胞儀檢測(cè)表型CD133 檢出率為63.29%（圖3）。

圖2 DiI-ac-LDL及FITC-UEA-I雙染試驗(yàn)結(jié)果（×200）

2.3 EPCs遷移能力檢測(cè)

本研究觀察了運(yùn)動(dòng)8 周后EPCs 的遷移能力，與對(duì)照組相比，運(yùn)動(dòng)可以改善EPCs 的遷移能力。8 周運(yùn)動(dòng)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，有氧運(yùn)動(dòng)、抗阻運(yùn)動(dòng)以及聯(lián)合運(yùn)動(dòng)均能明顯改善EPCs 的遷移能力（P＜0.05），且聯(lián)合運(yùn)動(dòng)較有氧運(yùn)動(dòng)、抗阻運(yùn)動(dòng)效果更佳（P＜0.05）。見(jiàn)圖4。

圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD133表型

圖4 各組EPCs在干預(yù)8周后的遷移功能比較

2.4 各組Cav-1蛋白表達(dá)的比較

經(jīng)過(guò)8 周的運(yùn)動(dòng)干預(yù)，我們采用Western blotting法檢測(cè)糖尿病小鼠EPCs的Cav-1蛋白表達(dá)水平。檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組、有氧運(yùn)動(dòng)組和抗阻運(yùn)動(dòng)組相比，聯(lián)合運(yùn)動(dòng)組Cav-1 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）。有氧運(yùn)動(dòng)組、抗阻運(yùn)動(dòng)組與對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖5。

圖5 各組EPCs在運(yùn)動(dòng)干預(yù)8周后Cav-1表達(dá)水平的比較

3 討論

研究表明，當(dāng)血管內(nèi)皮受損時(shí)，EPCs 可以從骨髓動(dòng)員、遷移，整合到血管網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)分化為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞從而修復(fù)損傷血管和生成新的血管[4，5]。而2型糖尿病會(huì)導(dǎo)致EPCs的遷移能力下降，影響其趨化至受損內(nèi)皮進(jìn)行黏附、侵襲，從而使其修復(fù)內(nèi)皮的功能減弱[19]。不少研究報(bào)道稱有氧運(yùn)動(dòng)或耐力訓(xùn)練能改善中老年人EPCs 的遷移能力[7，20]，然而在病理狀態(tài)下，不同的運(yùn)動(dòng)方式對(duì)EPCs的影響效果可能不同。目前，不同運(yùn)動(dòng)方式對(duì)2 型糖尿病患者EPCs 功能的作用尚未十分明確，相關(guān)機(jī)制也尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)對(duì)糖尿病db/db 小鼠進(jìn)行8周的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，有氧、抗阻及聯(lián)合運(yùn)動(dòng)三種運(yùn)動(dòng)方式組均呈現(xiàn)出較對(duì)照組更強(qiáng)的骨髓EPCs 體外遷移能力，提示規(guī)律的運(yùn)動(dòng)可提高EPCs 的遷移能力，促進(jìn)EPCs 的血管內(nèi)皮修復(fù)功能，與夏文豪等[20]的研究結(jié)果一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，三種運(yùn)動(dòng)呈現(xiàn)出不同的促進(jìn)作用效果，其中以聯(lián)合運(yùn)動(dòng)組的運(yùn)動(dòng)效果最佳，其增強(qiáng)EPCs遷移能力的效果較單純的有氧、抗阻運(yùn)動(dòng)有顯著差異。本研究認(rèn)為需進(jìn)一步探究聯(lián)合運(yùn)動(dòng)對(duì)2型糖尿病患者骨髓EPCs 影響的作用機(jī)制，為2 型糖尿病患者或相關(guān)血管疾病的預(yù)防、診斷與治療以及疾病的延緩提供更好的資料。

為了探索運(yùn)動(dòng)改善EPCs 功能活性的可能分子機(jī)制，我們對(duì)各組糖尿病小鼠EPCs 中與內(nèi)皮修復(fù)相關(guān)的Cav-1 蛋白表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。Cav-1 是小凹蛋白家族成員之一，在內(nèi)皮細(xì)胞中含量豐富[21]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2（vascular endothelial growth factor recep?tor 2，VEGFR-2）定位于Cav-1 中，Cav-1 可通過(guò)正性或負(fù)性調(diào)控VEGFR-2 從而調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的信號(hào)通路，參與EPCs的內(nèi)皮損傷修復(fù)過(guò)程[22]。有研究報(bào)道，雌激素能促進(jìn)EPCs 的增殖，與雌激素調(diào)控Cav-1的表達(dá)有關(guān)[23]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)聯(lián)合運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后Cav-1 蛋白的表達(dá)明顯提高，并改善了EPCs遷移能力，提示聯(lián)合運(yùn)動(dòng)可能通過(guò)上調(diào)Cav-1 蛋白的表達(dá)改善EPCs 的遷移能力。已有研究報(bào)道，Cav-1 缺失后，EPCs 從骨髓到外周的動(dòng)員減少[24]。Wunderlich等[25]通過(guò)對(duì)Cav-1表達(dá)缺陷小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，Cav-1基因的表達(dá)缺陷可導(dǎo)致其心血管系統(tǒng)出現(xiàn)明顯的異常。Rodriguez-Feo等[26]研究發(fā)現(xiàn)，粥樣斑塊處Cav-1蛋白表達(dá)水平降低，且其低表達(dá)與不穩(wěn)定斑塊的形成密切相關(guān)。以上多個(gè)研究與本研究結(jié)果均表明，血管內(nèi)皮的穩(wěn)定修復(fù)不能缺少Cav-1。然而，也有研究表明，糖尿病狀態(tài)下血管功能失調(diào)，可能與高糖所致的Cav-1 表達(dá)增高有關(guān)[27]?？梢?jiàn)，Cav-1的表達(dá)水平高低影響著血管內(nèi)皮的修復(fù)。而本研究結(jié)果顯示，聯(lián)合運(yùn)動(dòng)組明顯上調(diào)EPCs 的Cav-1 蛋白表達(dá)水平，提示Cav-1 可能參與聯(lián)合運(yùn)動(dòng)相關(guān)EPCs功能活性的改善，且其表達(dá)水平對(duì)EPCs遷移功能有促進(jìn)作用；亦表明聯(lián)合運(yùn)動(dòng)方式較單純有氧或抗阻運(yùn)動(dòng)方式更能提高Cav-1蛋白表達(dá)水平，從而更好地改善EPCs功能，修復(fù)內(nèi)皮損傷。

4 總結(jié)

本研究結(jié)果表明，EPCs 上調(diào)Cav-1 蛋白的表達(dá)對(duì)于其遷移功能的促進(jìn)作用不可或缺，聯(lián)合運(yùn)動(dòng)可通過(guò)提升Cav-1 蛋白的表達(dá)水平達(dá)到改善EPCs 遷移能力。本研究為采用運(yùn)動(dòng)及干細(xì)胞防治糖尿病血管疾病提供了新的證據(jù)。有關(guān)聯(lián)合運(yùn)動(dòng)通過(guò)Cav-1蛋白調(diào)節(jié)EPCs的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。